Способ получения этиловых эфиров жирных кислот

 

Область использования: биотехнология , биохимический синтез органических веществ, в частности сложных эфиров жирных кислот и однои многоатомных спиртов. Сущность изобретения: использование в качестве сырья для синтеза внутриклеточных жирных кислот штамма Methylococcus capsula- tus ВСБ-87 без их предварительного выделения из биомассы, а также за счет использования внутриклеточного фермента того же штамма без его предварительного выделения из биомассы и иммобилизации на инертном носителе. Способ осуществляется следующим об- .разом. Проводят культивирование штамма в жидкой питательной среде, полученную биомассу отделяют центрифугированием , наносят этанол в соотношении 5:1 - 5:Ю и выдерживают в течение 20-25 сут при комнатной температуре на встряхивателе. Полученную смесь подвергают обработке хлороформом с целью извлечения липидов. Этиловые эфиры жирных кислот выделяют с помощью колоночной адсорбционной хроматографии . сл с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 12 Р 7/62

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Ь i Ф1ЗНМ

QO

ЬЭ

ГОСУДАРСТВ Е Н НОЕ ПАТЕ НТН ОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) (21) 4897955/13 (22) 28.12.90 (46) 15.06.93 Бюл. >" 22 (71) Носковский технологический институт пищевой промышленности (72) Ю.А.Султанович, Г.Б.Колесник, t1.8.Рождественская, Е.В.Крюкова и С.А.Зайцев (73) Московский технологический институт пищевой промышленности (56) Авторское свидетельство CCCF

V 1070135, кл. С 07 С 67/00, 1984.

Опубликованная заявка на патент

Японии I" 63-133991, опубл. 88.06.06."ИСИ", 1989, Р 6, с. 61. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТИЛОВЫХ ЭФИРОВ

ЖИРНЫХ КИСЛОТ (57) Область использования: биотехнология, биохимический синтез органических вецеств, в частности сложных эфиров ьтирных кислот и одно- и многоатомных спиртов. Сущность иэобретеИзобретение относится к области биохимического синтеза органических веществ, в частности сложных эфиров жирных кислот и одно- и многоатомных спиртов.

Известен способ получения сложных эфиров на основе жирных кислот, включающий этерификацию жирных кислот состава Ст-С,В спиртами состава С»С,о при нагревании в присутствии катализатора. В качестве катализатора используют полисульфофенилкетон на алюмосиликате. Процесс ведут при температуре 170-220

„„5U„„1822411 А3 ния; использование в качестве сырья для синтеза внутриклеточных жирных кислот штамма Ие йу1ососс«в сари«1аtus ВСБ-874 беэ «х предварительного выделения из биомассы, а также за счет использования внутриклеточного фермента того же штамма без его предвар«тельного выделения иэ биомассы и иммобилизации на инертном носителе.

Способ осуществляется следующим об.разом. Проводят культивирование штамма в жидкой питательной среде, полученную биомассу отделяют центрифугированием, наносят этанол в соотношении 5:1 — 5:10 и выдерживают в течение 20-25 гсут при комнатной температуре на встряхивателе. Полученную смесь псдвергают обработке хлороформом с целью извлечения липидов. Этиловые эфиры жирных кислот выделяют с помощью колоночной адсорбционной хроматографии.

Способ является сложным, так как )сЛ в нем применяется дорогостоящий, 4 трудно производимый катализатор. Процесс проходит при достаточно высокой температуре, при которой возможно окисление мирных кислот, особенно полиненасыценных.

Наиболее близким Ilo технической сущности и достигаемому результату к заявляемому изобретению является способ получения сложных эфиров, заключающийся в том, что проводят реакцию этерификации с участием 100 частей алифатического одноатомного спирта, 1822411

25-600 частей алифатической насыщенной или ненасыщенной карбоновой кислоты с числом атомов углерода от 3 до 22 и 400-100000 единиц (в расчете на 1 часть карбоновой кислоты) иммобилизованной липазы, полученной из микроорганизма. Реакцию проводят при температуре 20-80 С (предпочтительно при 30-60 С) при перемешивании °

Образующийся сложный эфир отделяют от реакционной смеси, Для осуществления способа требуетсл использование липазы, иммобилизованной на инертном .носителе, и наличие в реакционной смеси исключительно только жирных кислот и спирта, что значительно затрудняет стадию подготовки синтеза.

Целью предлагаемого изобретения ,является упрощение способа получения этиловых эфиров жирных кислот C1 -C,s насыщенных, моно- и диненасыщенных иод действием микробной липазы.

Поставленная цель достигается тем, 25 что в способе получения этиловых эфиров жирных кислот, включающим этериФикацию жирных кислот этанолом с использованием в качестве катализатора микробной липазы, отличием является то, что в качестве источника жирных кислот используют биомассу, полученную путем культивирования штамма

Иеthylococcus capsulatus ВСБ-874, на которую после отделения культуральной жидкости наносят этанол в соот- ношении 5:1 - 5:10, полученную смесь выдерживают в течение 20-25 суток и подвергают обработке органическими растворителями для полученил концентрата этиловых эфиров жирных кислот.

Использование биомассы, получен» ной путем культивирования штамма

M.capsulatus ВСБ-874, обусловлено высоким содержанием жирных кислот (203) нормального строения с числом атомов углерода or 13 до 18, насыщенных, моно- и диненасыщенных. Преоб. ладающими являются пальмитиновая и пальмитолеиновая кислоты, содержание которых достигает 41 и 493, соответ- 50 ственно. В ощутимых количествах присутствует также олеиновая кислота (5,5 ) . йтамм, полученный во "ВНИИСинтезбелок", выделен из сточных вод нефтя; ной скважины ЛзССР и отселекционирован путем выращивания в длительном непрерывном процессе при постепенном понижении рН среды и повышении температуры. Норфологические, культуральные и физиологические признаки, а также технологическая характеристика изложены в паспорте штамма.

Отамм является ацидотермотолерантным, используется в настоящее время для промышленного получения кормового белка из -метана. Это создает возможность организовать дешевое промыш-. ленное производство неионогенных поверхностно-активных веществ (этиловых эфиров жирных кислот), так как сырье для их синтеза может быть получено из биомассы штамма без снижения ее ценности как кормового белкового продукта.

Нанесение этанола на биомассу в указанных соотношениях обусловлено необходимостью достижения максимальной скорости синтеза этиловых эфиров жирных кислот. При соотношении биомассы и этанола менее 5: 1 количество синтезированных этиловых эфиров жирных кислот не превышает 353. При увеличении соотношения биомассы и этанола свыше 5: 10 выход этиловых эфиров жирных кислот оСтается прежним. (52ь).

Выдержка полученной смеси в течение 20-25 суток обусловлена полнотой образования этиловых эфиров жирных кислот. При выдержке менее 20 суток количество синтезированных этиловых эфиров мирных кислот не превышает 35403. Иаксимальное количество эфиров образуется на 22-25 сутки. При дальнейшей выдержке увеличения количества эфиров практически не происходит.

Обработку смеси после выдержки проводят органическими растворителями с целью получения концентрата этиловых эфиров жирных кислот.

Укаэанные свойства являются не только новыми, но и позволяют получить положительный эффект, заключающийся в упрощении подготовки и самого процесса получения этиловых эфиров жирных кислот, Способ осуществляется следующим образом. Проводят култивирование штамма M. cap su 1 a tu s ВС Б-874 в жидкой питательной среде, полученную биомас" су отделяют центрифугированием, нанослт этанол в соотношении 5:1

5:10 и выдерживают в течение 2025 суток при комнатной температуре на встрлхивателе. Процесс синтеза эфиров и его окончание контролируют

22411

15

55

5 18 при помощи тонкоспойной хроматографии на пластинках "Сипуфол" в системе растворителей гексан:д«этиловый эфир-уксусная кислота (80:20:1) по количеству фракций свободных ж«рных кислот и этиповых эфиров жирных кислот ° Полученную смесь подвергают обработке хлороформом (3 раза по двухкратному количеству на экстраг«руемый объем) с целью извлечен«я лип«дов. Этиловые эфиры жирных кислот выделяют с помощью копоночной адсорбционной хроматографии, Пример 1. Биомассу получали путем глубинного культивирования штамма бактерий И.capsulatus ВСБ-874 в непрерывном режиме в ферментере объемом 40 л (рабочий объем 20 л) на питательной среде следующего состава, г/л: 80< н Р04 - 0,05 ил, и8$0< 7Н о0,02, КС1 — 0,025; микроэлементы, (мгlrl): 7п$0+ 71< 0 — 0,03, Hn$04 <

x4J1

«7Н О вЂ” О, 1, А12 ($04) > 41! Π— О, 2, СгС1 2Н О вЂ” 0,085.

Расход природного газа на 1 л среды - 15 л/ч, воздуха — 45 и/час,- температура культивирования 42ОC, рН среды 5,6, р = 0,25 и- .

Содержание липидов составляет 15ь от сухой биомассы.

Полученную биомассу отделяют центрифугированием (10 тыс. об/мин, 1520 мин) и в количестве 50 r помещают в коническую колбу со шпионом на

200 мл. Влажность биомассы составляет 753. В колбу вносят 10 г этанола, закрывают пробкой и ставят на встряхиватель (100 циклов/иин, амплиту.да - 5). Колбу выдерживают в указанных условиях при комнатной температуре в течение 20 суток, Этиловые эфиры жирных кислот экстрагируют хлороформом (3 раза по

100 мл) и выделяют с помощью копоночной адсорбционной хроматографии.

Количество синтезированных этиповых эфиров жирных кислот составило

351.

Пример 2. Бактериальную биомассу получали аналогично примеру 1.

В колбу с 50 г биомассы вносили,100 г этанола, что составляет 5:10, и выдерживали в течение 25 сут. Выделение синтезированных эфиров осуцествляли аналогично примеру 1.

Количество синтезированных этило вых эфиров жирных кислот состав«ло

52с;.

П р и и е р 3. Бактер«апьную биомассу полу иал« аналогично примеру 1.

В колбу с 50 г б«о«ассы вносили 20 г этанола, что составляет 5:2, и выдерживали в течение 22 сут. Выделение синтезированных эфиров осуществляли аналогично примеру 1.

Коп«чество синтезированных эт«ло- . вых эфиров жирных кислот составило

504.

Пример 4. Бактериальную биомассу получали аналогично примеру 1.

В колбу с 50 г биомассы вносили 5 г..этанопа, что составляет 5:0,5, « выдерживали 15 суток. Выделение синте"

20 зированных эфиров осуществляли аналогично примеру 1.

Коп«чество синтез«рованных этиловых эфиров жирных кислот. составило

304.

Пример 5. Бактериальную биомассу получали аналогично примеру 1.

В колбу с 50 r биома сы вносили

200 г этанола, что составляет 5:20, и выдерживал« в течение 30 суток. Вы30 деление синтезированных эфиров осуцествплли аналогично примеру l.

Количество синтезированных этиловых эф«ров жирных кислот составило

52 ь.

Использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволит упростить получение этиловых эфиров жирных кислот за счет использования в качестве сырья для синтеза

40.внутр«клеточных жирных кислот штамма

М.capsulatus ВСБ-874 без «х предварительного выделения из биомассы, а также за счет использования внутриклеточного фермента того же штамма щ без его предварительного выделения из биомассы, и иммобилизации на инертном носителе.

t формула изобретения

Способ получения этиловых эфиров жирных кислот, включаюц«й этерификацию жирных кислот этанолом с использованием в качестве катализатора микробной липазы, о т л и ч а ю щ и йс я теи, что, с целью упроцен«я прсцесса, в качестве источника жирных кисгот и пипазы используют биомассу, полученную путем культивирован«я

1822411

Составитель Ю.Султанович

Редактор В.Трубченко Техред И.Иоргентал Корректор t1.Kåðåöìàí

Заказ 2118 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по,изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 штамма Ие Ьу1ососсиз capsulatus

ВКПИ-1743, на которую после отделения культуральной жидкости наносят этанол в соотношении 5:1 - 5:10, полученную смесь выдерживают в течение 20-25 сут и выделяют целевой продукт экстрагированиеи органическими растворителями.