Способ индукции партеногенеза у растений

 

Использование: биотехнология, цитогенетические исследования, сельское хозяйство , физиология растений. Сущность изобретения: партеногенез у растений индуцируют в результате обработки женских генеративных органов с мегагаметами витальными дозами индуцирующего вещества , изменяющего кальциевый гомеостаз в сторону увеличения содержания свободных ионов кальция в мегагаметах при сохранении их витальности и функционирования. 14 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (и)з А 01 Н 1/04, 1/02

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4923293/13 (22) 01.04.91 (46) 23.06.93. Бюл. М 23 (71) Научно-производственное обьединение

"Элита Поволжья" (72) А.С. Кашин, Н.И. Давоян и M.Ê. Мосолыгина (56) Бритиков Е.А. Биологическая роль пролина. М.: "Наука", 1975, с. 66-73.

Авторское свидетельство СССР

1Ф 520957, кл. А 01 Н 1/02, 1975.

Авторское свидетельство СССР

М 1323048, кл. А 01 Н 1/04, 1985.

Zhao Zuoyu, Gu Mind-quang, Production

of Diploid Pure Lines of Maize through

Parthenogenesis induced by Chemicals.-Acta

genetlca slnlca, 1984, ч.11, п.1, р. 39 — 46.

Изобретение относится к растениеводству и селекции сельскохозяйственных культур, в частности, к применению химических веществ для экспериментального индуцирования апомиктичного (партеногенетического) развития женских генеративных элементов In vlvo, и может быть использовано в гетерозисной селекции растений как этап для разработки методов ускоренного получения гомоэиготных линий и апомиктичных диплоидных форм растений, закрепляющих эффект гетероэиса в первом гибридном поколении, а также в физиологии и генетике растений для изучения путей индукции и развития экспериментального апомиксиса, явлений оплодотворения и эмбриогенеза, механизма активации мегагамет.

„„ЯЯ„„1822681 А1 (54) СПОСОБ ИНДУКЦИИ ПАРТЕНОГЕНЕЗА У РАСТЕНИЙ (57) Использование: биотехнология. цитогенетические исследования, сельское хозяйство, физиология растений, Сущность изобретения; партеногенез у растений индуцируют в результате обработки женских генеративных органов с мегагаметами витальными дозами индуцирующего вещества, изменяющего кальциевый гомеостаэ в сторону увеличения содержания свободных ионов кальция в мегагаметах при сохранении их витальности и функционирования. 14 з.п, ф-лы, 2-табл., 1 ил.

Цель изобретения — расширение спектра (набора) универсально партеногенез-индуцирующих веществ при увеличении выхода партеногенетических форм, Поставленная цель достигается тем. что в способе индукции партеногенеэа у растений, включающем кастрацию и изолирование соцветий или цветков до цветения, обработку в них, после начала цветения, женских генеративных органов с мегагаметами биологически активными веществами,. индуцирующими партеногенеэ, морфобиологический контроль индукции, обработку осуществляют витальными дозами индуцирующего вещества, изменяющего кальциевый гомеостаз в. сторону увеличения содержания свободных ионов кальция в мегагаметах при сохранении их витальности и

1822681 функционирования, например, поверхностчо активного вещества типа детергента— этанола, а контроль осуществляют цитоэмбриологически по сохранению витальности мегагамет и их активации к партеногенетическому развитию. В качестве индуцирующих веществ кроме поверхностно-активных веществ-типа этанола, используют также вещества антиауксинового действия, например, рутин, кумарин, другие флавоноиды из монофенолов и М-дифенолов; вещества из переносчиков и каналоформеров, повышающие проницаемость мембран для ионов кальция, например, грамицидины, карбоксильные полиэфирные антибиотики типа А

23187. лазолоцида А, цитокинины типа 6бенэиламинопурина, 6-фураноаминопурина, эеатина; переносчики химической энергии типа аденозинтрифосфорной кислоты; вещества, повышающие проницаемость мембран растительной клетки, деполяриэующие их и понижающие мембранный потенциал, например, натриевая соль никотинамидадениндинуклеотида, глутатион, рибофлавин, холекальциферол; вещества, в растворе диссоциирующие на свободные ионы кальция и любые анионы, например, хлорид кальция, нитрат кальция.

Используемую s заявленном способе группу индуцирующих веществ органической или неорганической природы, необладающих токсическим действием на растение, ненарушающих жизнеспособности и функционирования мегагамет и обьединенных физиологическим действием на кальциевый гомеостаэ, приводящим к увеличению содержания свободных ионов кальция s цитозоле мегагамет, никогда не использовали в качестве действующих веществ в способах индукции партеногенеза у -растений; партеногенез индуцирующий эффект этих веществ не был известен, не был очевиден и не мог быть логическим путем выведен, исходя иэ структурных формул их молекул или известного физиологического действия их как веществ, действующих на кальциевый гомеостаэ растительной клетки.

Изменение кальциевого гомеостаза под действием этих веществ (но нв влияние на партеногенеэ) было известно. Причем. известно, что в любой клетке. включая растительную, находящуюся в состоянии динамического равновесия с окружающей средой, концентрация свободных ионов кальция равна 10 Моль/л, а вне клетки—

10 Моль/л. В связи с этим введение кальция в клетку или высвобождение его из компартментов, т.B. повышение эидогенного содержания свободных ионов кальция, инициирует ряд биологических процессов. При этом связь между повышением эндогенного содержания ионов кальция в цитозоле мега. гамет и индукцией партеногенеэа у растений оставалась до настоящего времени неизвестной и неочевидной, хотя укаэанный в заявленном способе набор веществ функционально обьединяется именно таким действием на кальциевый гомеостаз клетки.

В силу всего вышеизложенного, предлагае10 мое техническое решение неочевидно, обладает новизной и существенными отличиями.

Использование вышеупомянутых веществ в качестве универсально партеноге15 неэ-индуцирующих в составе смеси, воздействие которой по укаэанному способу приводит к активации мегагамет и индукции партеногенеэа у растений при сохранении их витальности, расширяет

20 спектр (набор) веществ, использовавшихся до настоящего времени для индукции партеногенеза, увеличивает выход партеногенетических форм. Ранее известно использование вышеупомянутых веществ

25 только в качестве активаторов или ингибиторов роста растений, антибиотиков, фиксаторов, стерилизаторов, макросолей при минеральной подкормке вегетирующих растений. поверхностно-активных веществ и

З0 т,п., но не в качестве универсально партеногенеэ-индуцирующих веществ.

На чертеже дана зависимость выхода партеногенетических форм в процентном выражении (на оси Y) от концентрации этаЗ5 мола. используемого в заявленном способе в качестве индуцирующего вещества, в процентном выражении (на оси Х).

Способ осуществляется следующим образом. До начала цветения на стадии еще

40 незрелых зародышевых мешков кастрируют соцветия или цветки, удаляя пыльники до их растрескивания и высыпания из них пыльцы; изолируют кастрированные соцветия или цветки, например, пергаментными изо46 ляторами для предотвращения случайного попадания любой пыльцы на их женские генеративные органы; после начала цветения их обрабатывают индуцирующим веществом, например, вводят раствор одного из

50 вышеуказанного набора индуцирующих веществ (например, этанола). Наиболее оптимальным является способ введения, при котором индуцирующее веществО вводится в центральную ось соцветия или цветка, чем

55 достигается эффект снижения расхода вещества и оптимальной доставки его к месту непосредственного действия, т.е. к мегагаметам. В качестве растворителя используют любое вещество, не обладающее токсическим действием на растение, например, во1822681

1О

S0

55 ду. Концентрацию индуцирующего вещества берут витальную, причем его витальность и индуцирующий эффект контролируют цитоэмбриологически по сохранению жизнеспособности мега гамет и эффекту активации их к партеногенетическому развитию (нвпример, к пролиферации и т.п,).

Пример 1. Экспериментальное доказательство осуществимости способа проводили на материале кукурузы сложного гибрида Коллективный-147ТВ.

Женские соцветия (початки) кукурузы с однополыми женскими цветками изолировали зв 3...5 дней до начала цветения (до выметывания первых нитей рылец) на стадии незрелого зародышевого мешка пергаментными изоляторами, чтобы предотвратить последующее случайное опыление завязей.

На 2...7 сутки после начала цветения проводили иньекцию партеногенеэ-индуцирующего вещества — этанола как одного из наиболев доступных веществ, изменяющих кальциевый гомеостаз клетки, в виде водного раствора в концентрации 1...50 в обьеме 2 мл на одно соцветие с помощью шприца-доэатора комбинированного ШДК5 в центральную ось початка, Верхний предел концентраций 50 брали, исходя иэ того, что зганол в этой концентрации используют в цитологии как фиксирующее вещество, т.е. воздействие этанолом данной концентрации приводит к летальному исходу для растения (Паушева

З.П. Практикум по цитологии растений. — M.:

Колос, 1980. — С. 70-76).

Идентификацию витальности мегагамет и индукции партеногенеза у них на ранних стадиях развития производили по цитоэмбриологическим маркерным признакам индуцированного партеногенетического развития яйцеклеток и вторичных ядер центральных клеток зародышевых мешков.

Для этого на 3...10 сутки после иньекции раствора этилового спирта фиксировали в фиксаторе Чемберлена часть завязей с обработанных початков. Состав фиксатора

Чемберлена: 90 частей этанола 70$-ного; 5 частей ледяной уксусной кислоты: 5 частей

40 -ного формальдегида. Препараты зародышевых мешков готовили flo ускоренной методике, включающей окраску 2 -ным ацетокармином. вычленение семяпочек макроиглами, мвцерацию их комплексом ферментов из зобной железы виноградной улитки (цитазой). вычленение зародышевыхх мешков микропрепаровальными иглами и приготовление глицерин-желатиновых препаратов. Из каждого соцветия початка цитоэмбриологически изучено в среднем по

30 семяпочек.

Выход партеногенетических форм кукурузы, индуцированных к развитию действием водного раствора этилового спирта в сравнении с прототипом, приведен в табл.

1. Выход партеногенетических форм выражали отношением числа индуцированных к партеногенетическому (апомиктичному) развитию завязей к числу проаналиэированных завязей початка.

Из данных табл. 1 следует, что выход партеногенетических форм в заявленном способе превышает таковой в прототипе по совокупности вариантов обработки в 13 раэ (2.48 (,/0,19 $), а по вариантам с максимальным выходом апомиктичных форм — в 35 раз (10.52 $ /0,30 ().

Интервал оптимальных концентраций индуцирующего вещества этанола в заявленномм способе определяли по результатам графического анализа (фиг.). Причем, оптимальными концентрациями этанола считали те, которые давали выход партеногенетических форм выше максимального показателя такового по прототипу, т.е. выше 0,467ь по сорту.1inquang-13 (указано на фиг. горизонтальной прерывистой линией), Это интервал оптимальных концентраций этанола — 1,1047.00 У».

Таким образом, использование заявленного способа в случае, когда в качестве индуцирующего вещества берут этанол, как одно из веществ, изменяющих кальциевый гомеостаз мегагамет, эффективно для кукурузы гибрида Коллективный-147 ТВ.

Пример 2. Экспериментальное доказательство осуществимости способа проводили на материале кукурузы сложных гибридов Коллективный-147ТВ, ВИР-42 и гомозиготной мужскостерильной линии

ЮВ-24 ТС в соответствии с описанием способа, данным в примере 1.

В качестве индуцирующих использовали ряд биологически активных веществ, изменяющих кальциевый гомеостаэ, указанных в пунктах 2...7 формулы изобретения.

Результаты испытания приведены в табл. 2.

Таким образом, использованный в примере специфический набор биологически активных веществ расширяет спектр универсально партеногенез-индуцирующих веществ у растений. Причем в табл. 2 приведены только те концентрации веществ, при воздействии которыми наблюдали максимальный эффект индукции партеногснеза. Проблему наиболее экономичного выхода на оптимальные параметры

1822681 концентраций решали следующим образом: брали максимальную из витальных для растения доз и расширяли интервал концентраций индуцирующего вещества в сторону уменьшения на 3...4 порядка, испытывая при этом внутри интервала 5...7 уровней концентрации. Контроль витальности и индукции партеногенеза вели по цитоэмбриологическим признакам.

Результаты испытания свидетельствуют о том. что все из апробированных веществ превосходят прототип по выходу партеногенетических форм в 9...120 раэ (4,17...55,17 против 0,46 по прототипу).

Таким образом, осуществление заявленного способа в случае использования ряда веществ, указанных в п,п. 1...7 формулы изобретения, в отношении индукции и выхода партеногенеза эффективно для трех селекционных форм кукурузы.

Аналогичные результаты, подтверждающие расширение спектра и универсальность таким образом специфически подобран; ых индуцирующих веществ, получены для проса посевного и томата.

Формула изобретения

1. Способ индукции партеногенеза у растений, включающий кастрацию. изолирование соцветий или цветков до начала цвотк, ия, обработку г, них после начала цветения женских генеративных органов с мегагаметами биологически активными веществами, индуцирующими партеногенез. и последующий морфобиологический контроль индукции, отличающийся тем, что, - целью увеличения выхода партеногенетических форм и расширения спектра универсально партеногенез-индуцирующих веществ, обработку осуществляют витальными дозами индуцирующего вещества, изменяющего кальциевый гоМеостаз в сторону увеличения содержания свободных ионов кальция в мегагаметах при сохранении их витальности и функционирования, а контроль осуществляют цитоэмбриологически по сохранению витальности мегагамет и их активации к партеногенетическому развитию.

2. Способ по и. 1, от л ич а ю щи и с я тем, что в качестве индуцирующего вещест, ва используют поверхностно-активные вещества типа детергента.

5 3. Способпоп.2, отличающийся тем, что используют этанол.

4. Способ по и. 1, отличающийся тем, что в качестве индуцирующего вещестsa используют вещества антиауксиноеого

10 действия.

5. Способ поп.4, о тл ич а ю щи йс я тем, что используют рутин, кумарин.

6. Способ по и. 1, отличающийся тем,.что в качестве индуцирующего вещест15 вв используют вещества из переносчиков и каналоформеров, повышающие проницаемость мембран для ионов кальция.

7. Способ пои. 6, отл ич а ю щийс я тем, что используют грамицидины С и Д.

20 8. Способпо и. 1, отличающийся тем, что в качестве индуцирующего вещества используют цитокинины.

9, Способпоп. 8, отл ича ю щийс я тем, что используют 6-бенэиламинопурин.

25 10. Способпоп. 1. отличающийся тем, что в качестве индуцирующего вещества используют переносчики химической энергии.

11, Способпоп.10, отличающийся

30 тем, что используют аденозинтрифосфорную кислоту.

12. Способ поп. 1, отличающийся тем. что в качестве индуцирующего вещества используют вещества, повышающие про35 ницаемость мембран и приводящие к деполяризации и понижению мембранного потенциала.

13, Способ поп.12, отличающийся тем, что используют натриевую соль никоти40 намидадениндинуклеотида, глутатион, рибофлавин, холекальциферол.

14. Способ по и. 1, отличающийся тем, что в качестве индуцирующего вещества используют вещества, в растворе диссо45 циирующие на свободные ионы кальция и любые анионы.

15. Способ по и. 14, отличающийся тем, что используют хлорид кальция, нитрат кальция.

1822681

Таблица 1

Таблица 2

Кукуруза

J inq uang- l 3

0,46

lu

5000 мг/л

Рутин 1000 мг/л

244

Каналоформеры

Грамицидин С 5000 мг/л Колл, 147 TG

Грамицидин Д 200 сг/л tJB-24 ТС

3000 мг/л Колл.147 TG

Цитокинины

6"Бензиламинопурин

40 мг/л:

Ке-24 ТС

Колл. 147 ТВ

5,72

4,54

10 мг/л

Прототип . (АнтиауксийЬ

Кумарин 1000 мг/л

Колл. 147 TG .

К "24 ТС

ВИР-42

29

27

8,70

5,56

6,65

55,17

7,41

4,17

12

Продолжение табл,2

1822681

Переносчики химической энергии

ВИР-42

240

10,13

Колл. 147 ТВ

6,67

Никотинамидадениндинуклеотид-Na 100 мг/л

Рибофлавин 20 мг/л

Холекальциферол 0, 1253 Колл. 147 TD боли кальция

Составитель

Техред М.Моргентал

Коррекгор О.КРаацоаа

Редактор

Заказ 2164 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Аденозинтрифосфорной кислоты натриевая соль

1000 мг/л

Вещества, понижающие мембранный потенциал

ГлутатиоИ 100 мг/л

СаС1 200 мг/л

Са(ВОЗ) 80 мг/л

400 мг/л

Колл. 147 TO

Колл. 147 ТВ

Колл. 147 TB

ЮВ-24 ТС ! олл. 147 ТО

18

43

44

Хо х

16,67

11 54

10,71

20 93

4,55

5,77