Способ выделения 4-и/или 5-оксииндолил-3-уксусных кислот

 

Использование: биотехнология, медицинская промышленность. Сущность изобретения: раствор, содержащий смесь 4- и 5-оксииндолил-З-уксусных кислот , подвергают хроматографии на колонке , заполненной гидрофильным анионообменным сорбентом и элюируемой 0,5-0.7 М раствором NaCI. Фракции, содержащие целевой продукт, упаривают , подкисляют до рН 3-4 и экстрагируют гидрофобным органическим растворителем . Полученные экстракты обезвоживают , упаривают и выделяют продукт с выходом 75-98% и содержанием основного вещества 98%.

(ОЮЗ Г.O(II-1(:КИХ

СО1 ГИ АЛИС: ГИНЕ Г. К ИХ аеспуглик

ГОсудАастБеннОГ пАтен ГМОе

BEjjOMCTRO CCC1 (IOCflATFHT СССа1

ЯЗНАИ

Г,АйЧ Г {;.,»

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4926954/13 (22) 12.04.91 (46) 23,06.93. Бюл. М 23 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) В.А,Ежов, А.Г.Трушкина и А.Г.Козловский (56) Кощеенко К.А„Бакланова Т.Г.,Козловский А,Г.,Аринбасаров М.У., Скрябин Г,К. О гидроксилировании индолил-3-уксусной кислоты грибом Aspniger ИБФМ F-212. Прикладная биохимия и микробиология, 1977, т.

13, вып. 2, с. 248-252. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ 4- И/ИЛИ 5-ОКСИИ НДОЛИЛ-3-УКСУСНЫХ КИСЛОТ

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности.

Цель изобретения — повышение качества целевых продуктов и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что хроматографию проводят на гидрофильных анионообменных носителях перед экстракцией, при этом элюцию продуктов осуществляютт 0,5-0.7 M Na CI.

Способ заключается в том, что раствор, содержащий смесь оксииндолилуксусных кислот, подвергают хроматографии на гидрофильном анионообменном сорбенте, используя элюцию 0,5-0,7 М NaCI, затем фракции, содержащие соответственно 4ОН-ИУК или 5-ОН-ИУК, концентрируют в вакууме до небольшого объема, полученные концентраты подкисляют до рН 3-4 и экстрагируют целевые продукты гидрофобным органическим растворителем, например этилацетатом.

„„5ЦÄÄ 1822885 А1 (я>s С 12 P 17/04, С 07 0 209/04 (57) Использование: биотехнология, медицинская промышленность. Сущность изобретения; раствор, содержащий смесь 4- и 5-оксииндолил-3-уксусных кислот, подвергают хроматографии на колонке, заполненной гидрофильным анионообменным сорбентом и элюируемой 0,5-0,7 М раствором NaCI. Фракции, содержащие целевой продукт, упаривают, подкисляют до рН 3-4 и экстрагируют гидрофобным органическим растворителем, Полученные экстракты обезвоживают, упаривают и выделяют продукт с выходом 75-98ф» и содержанием основного вещества 98 .

Этилацетатный экстракт, содержащий

4-ОН-ИУК. обеэвоживают сульфатом натрия, упаривают под вакуумом досуха, Получают аморфный порошок белого цвета с содержанием основного вещества не ниже

98 и выходом 75 — 98 от содержания в исходном растворе.

Этилацетатный экстракт, содержащий

4-ОН-ИУК, обезвоживают сульфатом натрия, упаривают под вакуумом досуха. Получают аморфный порошок белого цвета с содержанием основного вещества не ниже

98 и выходом от содержания в исходном растворе.

Этилацетатный экстракт, содержащий

5-ОН-ИУК, обеэвоживают сульфатом натрия, упаривают под вакуумом до минимального объема и оставляют на холоду.

Выпавшие кристаллы отфильтровывают v, сушат под вакуумом. Получают белый кристаллический порошок с содержанием основного вещества не ниже 99 и выходом

1822885

86-98,5 or содержания 5-ОН-ИУК в исходном растворе.

Способ может быть использован для выделения и очистки 4- и 5-ОН-ИУК из растворов, их содержащих, как в индивидуальном виде, так и в смесях, в том числе из фильтратов культуральной жидкости грибов.

Проведение хроматографии на гидрофильных анионообменных сорбентах в условиях элюции 0,5 — 0,7 М NaCI на первом этапе очистки, а при выделении из культуральной жидкости грибов непосредственно после отделения биомассы, позволяет сразу четко разделить два продукта и одновременно освободиться от окрашенных примесей, что дает возможность при дальнейшей экстракции получить сразу чистый продукт.

Нами было установлено, что при использовании для элюции растворов хлористого натрия с концентрацией менее 0,5 М снижается выход целевых продуктов. Увеличение концентрации NaCI с 0,7 М до 1,0 М не приводит к улучшению качества разделения и увеличения выхода продуктов. Применение в качестве элюентов аммонийных солей, например ИН4СНзСОО и(СН4)2СОз, приводило к снижению качества получаемых продуктов, появлению окрашенных примесей в процессе элюции и снижению содержания 4- и 5-ОН-ИУК в конечных препаратах.

Пример 1. 2 л фильтрата культуральной жидкости гриба Aspergillus niger ИБФМ

F-212, содержащего 0.22 г/л 5-ОН-ИУК и

0,28 г/л 4-0Н-ИУК, пропускают через колонку 2,2х40 см, заполненную ДЭАЭ-сефадексом А-25, со скоростью 50 мл/час, Затем осуществляют элюцию целевых продуктов

0,5 M NaCI с той же скоростью. Отбирают фракции по 100 мл, определяя в них содержание продуктов методом тонкослойной хроматографии и спектрофотометрически по поглощению при 280 нм. Фракции 9-13, содержащие 5-ОН-ИУК. объединяют, упаривают в вакууме до 50 мл. Концентрат подкисляют до рН 3,5 2 М HCI и 5-OH-ИУК экстрагируют многократно этилацетатом.

Экстракт обезвоживают сульфатом натрия и упаривают досуха, Получают 400 мг кристаллического порошка белого цвета 5-ОНИУК с содержанием основного вещества

100;ь. Выход продукта от содержания его в фильтрате составляет 98.5 .

Фракции 16-19, содержащие 4-0Н-ИУК, обьединяют, упаривают в вакууме до 100 мл.

Полученный концентрат подкисляют 2 М

НС!до рН 3,5 и экстрагируют из него 4-ОНИУК этилацетатом. Экстракт обезвоживают сульфатом натрия, упаривают в вакууме досуха. Получают 550 мг аморфного порошка

50 белого цвета с содержанием 4-ОН-ИУК

99,8 . Выход продукта от содержания его в фильтрате составляет 98.2ь.

Пример 2. 10 л фильтрата культуральной жидкости гриба Asp.niger ИБФМ F-212, содержащего 0,3 г/л 5-ОН-ИУК и 0,2 г/л

4-0Н-ИУК, пропускают со скоростью 200 мл/час через колонку (6х150 см), заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, переведенной в

ОН-форму и промытой водой. По окончании сорбции проводят элюцию 0,5 М NaCI co скоростью 150 мл/ч, Отбирают фракции по

200 мл с помощью автоматического коллектора.

Фракции, содержащие 5-ОН-ИУК (V=2,5 л, C=1,2 г/л) объединяют, упаривают под вакуумом до 300 мл, доводят рН до 3,8 с помощью 2 М HCI, Экстрагируют дробно (3-4 раза) этилацетатом до полного извлечения 5-ОН-ИУК из водного слоя, Этилацетатный экстракт (V=500 мл, С=5,4 г/л) высушивают безводным сернокислым натрием, упаривают под вакуумом до объема

8,5 мл и оставляют при 4 — 6 С в течение ночи. Выпавшие кристаллы отфильтровывают на стеклянном фильтре, промывают холодным этилацетатом и сушат в вакуум-сушильном шкафу при комнатной температуре. Получают 2,0 г белого порошка с содержанием основного вещества

99,8 . Надосадочную жидкость упаривают до 2 мл и охлаждают. Выпавшие кристаллы сушат. Получают 0,7 г кристаллического порошка белого цвета с содержанием основного вещества 99,5 (. Суммарный выход составляет 90"-,ь or содержания 5-ОН-ИУК в фильтрате культуральной жидкости.

Фракции. содержащие 4-QH-ИУК, объединяют (Ч=2,8 л, С=0,71 г/л), упаривая под вакуумом до 200 мл, подкисляют до рН 3,8, экстрагируют дробно этилацетатом, Этилацетатный экстракт (Ч=400 мл, C=3,8 гlл) высушивают безводным сульфатом натрия и упаривают под вакуумом досуха, Получают

1,5 г белого аморфного порошка с содержанием основного вещества 98,5 g . Выход составляет 75 от содержания 4-ОН-ИУК в фильтрате культуральной жидкости.

Пример 3. 1О л фильтрата культуральной жидкости гриба Asp,niger ИБФМ F-212, содержащей 0,25 г/л 4-ОН-ИУК и 0,25 г/л

5-0Н-ИУК, наносят на колонку (Зх45 см) с

ДЭАЭ-сфероном (фирма "Chemapol", ЧСФР) со скоростью 200 мл/час. Элюцию ведут 0,5 M МаО со скоростью 200 мл/час, отбирая фракции по 200 мл.

Фракции, содержащие 4-ОН-ИУК. очищают далее, как указано в примере 2, и получают белый аморфный порошок весом

2,0 г с содержанием основного вещества

1822885

Составитель B.Åæîâ

Техред М.Моргентал Корректор М.Петрова

Редактор

Заказ 2174 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушскак наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул,Гагарина, 101

98 и выходом 80 (от содержания в фильтрате культуральной жидкости, Фракции, содержащие 5-0Н-ИУК, объединяют, подкисляют до рН 3,6 и далее очищают, как указано в примере 1. Получают

2,4 г кристаллического порошка с содержанием основного вещества 99,5ф, и выходом

96 от содержания в фильтрате культуральНОЙ жидкости.

Пример 4. 10 л фильтрата культуральной жидкости гриба Asp.niger F-212, содержащего 0,2 г/л 4-ОН-ИУК и 0,3 г/л

5-0Н-ИУК, очищают как указано в примере

3, но в качестве анионообменного сорбента используют QAE-сефадекс в колонке Зх80 см.

Получают 1,6 г белого аморфного порошка 4-ОН-ИУК с содержанием основного вещества 98 и выходом 80 от содержания в фильтрате и 2,8 г кристаллического белого порошка 5-ОН-ИУК с содержанием основного вещества 100 и выходом 93,3ф, от содержания в фильтрате культуральной жидкости.

Пример 5. Способ осуществляют как в примере 2, но в качестве элюента используют 0,7 М NaCI, Получают 2,6 г кристаллического порошка 5-OH-ИУК с содержанием основного вещества 997 и 1,6 г белого аморфного порошка 4-ОН-ИУК с содержанием основного вещества 98,2 (,. Выход 5и 4-ОН-ИУК от содержания их в фильтрате культуральной жидкости составляет соответственно 86 3 и 807.

Пример 6, 1 л раствора, содержащего

1 г 4-ОН-ИУК и 1 г 5-0Н-ИУК, пропускают через колонку 2,0 х 30 см, заполненную

ДЭАЭ-сфероном, со скоростью 50 мл/ч.

Элюцию осуществляют 0,5 M NaCI. Фракции, содержащие 5-0Н-ИУК, объединяют, упаривают до 100 мл,упаренный концентрат подкисляют до рН 3,5, 5-OH-ИУК экстрагируют этилацетатом до полного извлечения.

Экстракт высушивают над безводным

NazS04, упаривают досуха. Получают 970 мг

5 кристаллического порошка с содержанием

5-ОН-ИУК 100 6 (выход 97ф ).

Фракции, содержащие 4-0Н-ИУК, объединяют, упаривают до 100 мл, подкисляют до рН 3,05, 4-ОН-ИУК экстрагируют этилаце10 татом до полного извлечения, Экстракт высушивают над безводным сульфатом натрия, упаривают досуха. Получают 950 мг белого аморфного порошка с содержанием

4-ОН-ИУК 99,57, (выход 95 ).

15 Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить качество препаратов 4ОН-ИУК до 98 — 99,87 и 5-ОН-ИУК до 100 при сохранении, а при получении 5-ОН-ИУК и повышении выхода за счет четкого отде20 ления этих соединений друг от друга и от примесей в процессе хроматографии, а также упростить процесс получения целевых продуктов за счет сокращения стадий выделения и очистки и эа счет сокращения one25 раций, где используются органические растворители. Кроме того, способ позволяет уменьшить вэрывоопасность и пожароопасность производства.

Формула изобретения

30 Способ выделения 4- и/или 5-оксииндолилЗ-уксусных кислот из раствора, предусматривающий экстрагирование гидрофобным органическим растворителем и хроматографическое разделение целевых продуктов, о т л и35 ч а ю шийся тем, что, с целью повышения качества целевых продуктов и упрощения способа, стадию хроматографического разделения проводят перед стадией экстрагирования путем сорбции целевого продукта на гидро40 фильном анионообменном сорбенте и элюции

0.5-0,7 М раствором NaCI,