Способ получения вещества, обладающего антипротеазным действием

 

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, в частности к способам получения ингибитора протеазы из сырья животного происхождения. Цель изобретения - упрощение способа и увеличения выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что околоушные слюнные железы животных гомогенизируют, экстракцию проводят в растворе уксусной кислоты при соотношении ткань: кислота 1:8-1:10 с добавлением хлористого цинка в количестве 1 г на 1 л смеси при рН 3-3,5, температуре +4-8^oС в течение 36-60 ч, экстракт фильтруют, фильтрат обрабатывают ацетоном в соотношении 1:5 при температуре -5-+5^oC в течение 18-22 ч, полученный осадок, содержащий целевой продукт, растворяют в дистиллированной воде, фильтруют на цеолите и лиофилизируют.

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается выделения биологически активных веществ из сырья животного происхождения, обладающих антипротеазным действием. Цель изобретения упрощение способа и увеличение выхода целевого продукта. Способ осуществляется следующим образом. Используемые в качестве сырья околоушные слюнные железы крупного рогатого скота получают на мясокомбинате, причем забор сырья вписывается в технологическую цепочку забоя. Полученное сырье замораживают при температуре -12 -18^oC. Свежезамороженные железы гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают раствором уксусной кислоты, содержащим 1 г хлористого цинка на 1 л смеси до рН раствора 3,0-3,5. Соотношение ткань:кислота должно быть 1:8-1:10. Экстракцию проводят при температуре +4 +8^oС в течение 36-60 ч при постоянном встряхивании. По окончании экстракции надосадочную жидкость декантируют. Полученный супернатант фильтруют через бязевую ткань. К фильтрату добавляют ацетон в соотношении 1:5 при температуре -5 +5^oC, перемешивают и формируют осадок в течение 18-22 ч. Осадок промывают в ацетоне и высушивают. Порошок растворяют в дистиллированной воде, перемешивают и фильтруют через цеолитовый фильтр. Фильтрат лиофилизируют. Полученное вещество представляет собой комплекс полипептидов с молекулярной массой 2000-10000 Д. Полипептидная природа вещества, полученного по предлагаемой методике, подтверждается следующими данными: 1) дает цветную реакцию с биуретовым реактивом; 2) молекулярная масса компонентов, определенная с помощью гель-хроматографии составляет 2000-10000 Д; 3) аминокислотный анализ вещества показал, что в состав полученного продукта входит 20 видов аминокислот в определенном соотношении; 4) основной спектр (пик) поглощения в ультрафиолетовом свете колеблется в пределах 220-230 нм (спектрофотометрически). Вышеуказанное позволяет достаточно точно провести идентификацию полученного вещества. При сопоставительном анализе заявляемого способа и способа-прототипа выявлены следующие сходные признаки: 1) оба способа используют для получения вещества, обладающего антипротеазным действием; 2) используют животное сырье; 3) сырье гомогенизируют; 4) гомогенат подвергают экстракции; 5) экстракт фильтруют;
6) полученное вещество лиофильно высушивают. Однако, известный способ-прототип и предлагаемый способ имеют следующие отличия:
1) В качестве сырья в прототипе используют поджелудочную железу, а в предлагаемом способе околоушные слюнные железы. Поджелудочную железу применяют в качестве сырья для получения гормонов и других биологически активных веществ, в то время как используемые в предлагаемом способе околоушные слюнные железы в настоящее время являются отходом производства. 2) В предлагаемом способе сырье предварительно замораживают с целью разрушения клеток околоушной железы, что приводит к увеличению выхода конечного продукта (см.табл. 1). 3) Для получения экстракта, содержащего вещество, обладающее антипротеазным действием, по способу-прототипу экстракцию предварительно измельченного сырья проводят 60-70% раствором этилового спирта при рН 3,0-4,0; экстракт упаривают до содержания спирта 10-30% охлаждают до 5-10^oC и инкубируют в течение 2-6 ч, а целевой продукт отделяют сифонированием, сорбируют на сульфокатионите КУ-23И, промывают раствором 0,1-0,5 М NH₄Cl с рН 9,5-10,5; десорбируют 0,01-2,5 М раствором NaCl с рН 12,0-12,5; а перед осаждением ацетоном подкисляют до рН 1,0-3,0; фильтруют. В то время как по предлагаемому способу, для получения экстракта, содержащего вещество, обладающее антипротеазными свойствами, замороженное сырье гомогенизируют. Экстракцию проводят раствором уксусной кислоты при соотношении ткань:кислота не менее 1:8-1:10 с добавлением хлористого цинка в количестве 1 г/л смеси при рН 3,0-3,5. Обработка гомогената сырья раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка позволяет осадить агрегирующие при заданных (3,0-3,5) значениях рН белки и провести гидролиз крупных белков. Так как измельченная ткань обладает склонностью к набуханию, то для более полного выделения активного вещества для экстракции берут не менее 8-10 объемов уксусной кислоты относительно гомогената ткани. Экстракцию проводят в течение 36-60 ч при температуре +4-+8^oC, что также способствует гидролизу крупных белков. Декантация надосадочной жидкости позволяет отделить экстракт от осадка, не прибегая к процессу сорбции. Для дальнейшего очищения экстракта от крупнодисперсного осадка, включающего агрегированные белки, не обладающие специфической активностью (антипротеазное действие), его фильтруют. Доказательства правильности выбранных в предлагаемом способе параметров экстракции приведены в табл. 2-6. Из табл. 2 видно, что для получения вещества обладающего антипpотеазными свойствами, с молекулярной массой 2000-10000 Д, необходима концентрация хлористого цинка 1 г/л. Из табл. 3 видно, что наилучшие результаты экстракции полипептидов наблюдаются при рН 3,0-3,5. Более высокие значения рН приводят к недостаточному выходу вещества с более высокой молекулярной массой, а при более низких значениях рН усиливается гидролиз пептидов. Так как измельченная слюнная железа обладает склонностью к набуханию, то, как видно из таблицы 4 для более полного выделения активного вещества для экстракции берут не менее 8-10 объемов кислоты относительно количества сырья. Из таблицы видно, что оптимальная экстракция вещества с молекулярной массой 2000-10000 Д происходит в течение 36-60 ч. Снижение времени экстракции приводит к уменьшению выхода целевого продукта, а увеличение к гидролизу пептидов. Из таблицы 6 следует, что экстракция, при которой наблюдается оптимальный выход вещества с молекулярной массой 2000-10000, происходит при температурном режиме +4 +8^oС. Полученный в результате вышеописанного процесса экстракт целесообразно разделять с осадком гомогената путем декантации, что значительно упрощает дальнейший процесс фильтрации. Фильтрация через бязевую ткань позволяет освободить экстракт от балластных веществ. Экстракция по заявляемому способу значительно упрощает технологию выделения ингибиторов протеаз. Для выделения используют экстрагирование при определенных условиях, не требующее специального оборудования. Экстракция по заявляемому способу исключает ряд этапов по сравнению со способом-прототипом; вакуум-дистилляцию, охлаждение, сифонирование, фильтрацию под давлением на рамном фильтре через пластины "Zeiz" (ФРГ). То есть, для получения экстракта и дальнейшей его подготовки к выделению и очистке в заявляемом способе используется значительно меньше этапов. 4) Для выделения активных полипептидов, обладающих антипротеазными свойствами, их дальнейшей очистки, по способу-прототипу ингибирующие фракции выделяют из фильтрата путем пропускания через колонку, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23И синтезированного на основе стирола и дивинилбензола, после окончания сорбции сульфокатионит промывают раствором NH₄Cl, ингибитор протеаз десорбируют из ионита водным раствором NaOH, содержащим NaCl, с помощью концентрированной НСl устанавливают рН 3,0; выпавшие белки фильтруют, раствор охлаждают, осаждают ингибитор ацетоном, осадок отфильтровывают, растворяют в дистиллированной воде, обессоливают на сефадексе G-15. По предлагаемому способу, для выделения активных полипептидов, обладающих антипротеазными свойствами, и их дальнейшей очистки, ингибиторсодержащую фракцию выделяют обработкой фильтрата ацетоном, добавляя 5 объемов ацетона на 1 объем фильтрата, при температуре -5 +5^oС. Далее формируют осадок в течение 18-22 ч, который промывают в ацетоне и высушивают. Для дополнительного освобождения от денатурированных и агрегировавших белков порошок растворяют в дистиллированной воде и фильтруют через цеолитовый фильтр. Выход активного вещества составляет 28 г на 1 кг исходного сырья. Доказательства правильности выбранных в предлагаемом способе параметров выделения активных полипептидов приведены в табл. 7-9. Из табл.7-9 видно, что наибольший выход вещества происходит при обработке фильтрата экстракта ацетоном в соотношении 1:5 при температуре -5 +5оС, формировании осадка в течение 18-22 ч. Таким образом, в способе-прототипе для получения ингибиторов протеаз на этапах выделения активного вещества и его очистки, используют сложный процесс сорбции, промывание до определенной оптической плотности, десорбцию из ионита, установку рН в элюате. Эти процессы требуют дорогостоящего оборудования, длительных временных затрат. Выделение активных полипептидов и их очистка по предлагаемому способу значительно упрощает технологию получения вещества антипротеазного действия. Процессы обработки фильтрата экстракта ацетоном, с последующим формированием осадка, растворением и фильтрацией через цеолит полученного раствора не требует значительных материальных и временных затрат, а также специального оборудования. Таким образом, технологический процесс выделения вещества антипротеазного действия по способу-прототипу включает 18 этапов, а именно:
1) забор сырья;
2) гомогенизация;
3) экстракция;
4) вакуум-дистилляция;
5) охлаждение;
6) отделение липидов сифонированием;
7) фильтрация экстракта под давлением;
8) сорбция на сульфокатионит при рН 3,0;
9) промывание сорбента;
10) десорбция ингибитора протеаз раствором NaOH;
11) закисление среды до рН 3,0;
12) фильтрация;
13) охлаждение;
14) осаждение целевого продукта ацетоном;
15) фильтрация;
16) растворение осадка;
17) обессоливание раствора на сефадексе G-15;
18) лиофилизация. Предлагаемый способ позволяет уменьшить число этапов, необходимое для получения вещества, обладающего антипротеазными свойствами, до 11 этапов, а именно:
1) забор сырья;
2) замораживание;
3) гомогенизация;
4) экстракция при встряхивании;
5) декантация;
6) фильтрация;
7) осаждение целевого продукта ацетоном;
8) промывание осадка ацетоном;
9) растворение осадка;
10) фильтрация через цеолит;
11) лиофилизация. Таким образом, предлагаемый способ содержит 11 технологических этапов, в отличие от 18 этапов прототипа. Предлагаемый способ не требует применения дорогостоящих реактивов и оборудования. Кроме того, выход вещества, полученного по заявляемому способу, выше, чем выход вещества из такого же количества сырья по способу-прототипу, при примерно равной активности целевого продукта. Способ получения вещества, обладающего антипротеазным действием, иллюстрируется примерами. П р и м е р 1. Берут 1 кг свежезамороженных околоушных слюнных желез крупного рогатого скота, измельчают на волчке. Сырье заливают 9 объемами раствора уксусной кислоты, содержащего 1 г хлористого цинка на 1 л смеси, доводя рН до 3,5. Экстракцию проводят в течение 48 ч при температуре +4^oС, при постоянном встряхивании. По окончании экстракции надосадочную жидкость декантируют и фильтруют через бязевую ткань. К полученному фильтрату добавляют ацетон в количестве 5 частей на одну часть фильтрата, при температуре 0^oC, перемешивают, формируют осадок в течение 18 ч. Полученный осадок промывают в ацетоне и высушивают, получают 70 грамм порошка. Порошок растворяют в дистиллированной воле из расчета 100 г порошка на 3 л дистиллированной воды, перемешивают в течение 1 ч, и, профильтровав через цеолитовый фильтр, лиофилизуют фильтрат. Выход активного вещества составляет 28 г из одного килограмма исходного сырья. Полученное вещество обладает антипротеазными свойствами. П р и м е р 2. Берут 2 кг свежезамороженных околоушных слюнных желез крупного рогатого скота и гомогенизуют на волчке. Гомогенат заливают 8 частями раствора уксусной кислоты, содержащего 1 г/л хлористого цинка, при рН смеси 3,0. Экстракцию проводят в течение 36 ч при температуре +6^oC, при постоянном встряхивании. По окончании экстракции надосадочную жидкость декантируют, и далее фильтруют через бязевую ткань. К полученному фильтрату добавляют ацетон в соотношении 5 частей ацетона на одну часть фильтрата, при температуре -4^oC, перемешивают, и формируют осадок в течение 20 ч. Полученный осадок промывают в ацетоне и высушивают, получают 136 грамм порошка. Порошок растворяют в дистиллированной воде из расчета 3 л дистиллированной воды на 100 г порошка, перемешивают в течение 1 ч, фильтруют через цеолитовый фильтр, лиофилизируют фильтрат. Выход активного вещества составляет 56 г из одного килограмма исходного сырья. Полученное вещество обладает антипротеазными свойствами. Ингибирующее действие на протеазы вещества, выделенного по предлагаемому способу, изучали по его действию на активность ряда ферментов по отношению к субстрату. В качестве субстрата были использованы фибриновые пластины. Активность ингибитора оценивали по уменьшению площади лизиса субстрата под действием фермента. В контрольные пробы вместо исследуемого вещества вводился физиологический раствор. При изучении влияния полученного полипептида активность трипсина угнеталась на 15,6% стрептокиназы на 24,5% и фибринолизина на 67,5%
Таким образом, по предлагаемому способу получают вещество, обладающее выраженным ингибирующим действием на фибринолиз и протеолиз. По сравнению с ранее известными способами получения веществ антипротеазного действия, предлагаемый способ прост, не требует использования дорогостоящих реактивов и оборудования, позволяет достигнуть повышения выхода целевого продукта. В качестве сырья предлагается использовать околоушные слюнные железы крупного рогатого скота, являющиеся в настоящее время в большинстве регионов отходом производства. Осуществление предлагаемого способа при снижении затрат на производство позволяет одновременно снизить и число технологических этапов, а также затраты времени, необходимого на производственный цикл. Вещество, обладающее антипротеазным действием, может найти применение в медицине в качестве средства, необходимого для лечения острого сиалоденита, острого и хронического панкреатита, тканевых повреждений, протекающих с выраженной активацией ферментов. ТТТ1 ТТТ2

Формула изобретения

Способ получения вещества, обладающего антипротеазным действием, из околоушных желез животных, включающий измельчение исходного сырья, гомогенизацию, экстракцию с последующей фильтрацией и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода целевого продукта, экстракцию осуществляют раствором уксусной кислоты при соотношении сырье:кислота 1:8 1:10 с добавлением хлористого цинка в количестве 1 г на 1 л смеси при рН 3,0 3,5, температуре +4 8^oС в течение 36 60 ч, экстракт фильтруют, фильтрат обрабатывают ацетоном в соотношении 1:5 при температуре -5 +5°С в течение 18 22 ч, полученный осадок, содержащий целевой продукт, растворяют в дистиллированной воде, фильтруют на цеолите и лиофилизируют.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 29-2000

Извещение опубликовано: 20.10.2000        

---