Способ получения мембраносвязанных соединений
Использование: в биологической и медицинской химии, как обладающие специфическим иммуностимулирующим действием. Сущность изобретения: продукт - мембраиосвяэаиные соединения общей формулы: C«H3iCONH-CKCOXH bSCH2CH(OCOCi5H3i) CH2OCOCt5H3i.CF3COOH. где X - -Ser- Asn.(Leufe. Glu-Cys-Gly-Pro-Arg-Glu-Phe- Val-Olu-Asn-SerOH, . Реагент : пептидная смола Р-у. где у - -Ser{But)-Asn- (Leuh-GMOBuyCys-GlufOBuVPro-Arg (Н) Glu(OBuVPhe-VaHGIu(OBulHVsn-Sei(But) или Serf Lys(Boc)4. OBu - сложный бутиловый эфир. But - бутил, Вое - трет-бутилоксикарбонил Р - полимерная смола. 0-п-алкоксибензил-(сополи)-дивинил-бенэол-стирол или поли-п-бензилоксибензил. Реагент II: X - ОН. Полученное соединение обрабатывают анизолом в трифторуксусной кислоте с отщеплением полимера и защитных групп. 1 ил. -г Ј
C0I0) СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
ЬЭ (л)
00 М
0ь
Од (21) 4027766/04 (22) 23.06.86 (31) P 35.22512.2 (32) 24.06.85 (33) ОЕ (46) 23.06.93. Бюл. hk 23 (71) Хехст АГ (ОЕ) (72) Гюнтер Юнг, Карл-Хайнц Bисмюллер, .
Aepr Мецгер. Ханс-Йерг Бюринг, Герхард
Бекер и 8ольфгэнг Беслер (ОЕ) (56) Е. Young c comp. в "Peptldes structure
and Function". V, Y, НгееЬу, О.Н. Rich, р. 179182, 1983, Pierce Chem. Co. Rockford Illinois
M. Schmitt и др. Llckblgs Ann. Chem.
1985, рр. 321-345.
Е Р hk 114787,кл. С 07 С 103/5g, опублик.
1984.
Э. Шредер, K. Любке. Пептиды. — М.:
Мир, 1967, т.1, с.398. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕМБРАНОСВЯЗАННЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Изобретение относится к способу получения мембраносвязанных соединений— новых биологически активных соединений, которые могут нэйти в биологической медицинской химии.
Цель изобретения — синтез новых производных липопептидов — мэлотоксичных соединений. обладающих высокой способностью к образованию антител против антигенов и гэптенов и тем самым в получении доступного специфического иммуностимулирующего продукта.
Поставленная цель достигается описываемым способом получения мембрэносвяэаммых соединений общей формулы I:, Я2 1823876 А3
tel)s С 07 K 13/00//А 61 K 37/02 (57) Использование: в биологической и медицинской химии, как обладающие специфическим иммуностимулирующим действием.
Сущность изобретения: продукт — мембрэносвяэанные соединения общей формулы:
СаНэ СОМН-СН(СО)ф СНг$СН2СН(ОСОСкНэ)
СНэОСОСеНэ1.СЕзСООН, где Х - -$ег
Азпфлiф. Glu-Суз-6!у-Pro-Агр-Glu-PheЧэ!-61о- Asn-SегоH, $еК уз) ОН. Реэгент I: пептиднэя смолэ Р-у, где у — -Sel(8ut)-Asn(Leu)s-6!о(08о )-Суз-G lu(OBu )-Pro-Arg (Н ) Glu(OB use-ЧэКЗЦО8о -Азп-Ser(B4) или $е4буз(8ос)3з, OBU — сложный бутиловый эфир. But — бутил, Boc — трет-бутилоксикврбонил Р— полимерная смола.
О-п-ànêoêñèáeíçìë coïoëè)-дивинил-бен- 3 зол-стирол или поли-п-бенэилоксибемзил.
Реагент II: Х OH. Полученное соединение обрэбэтывэют амизолом в трифторуксусной кислоте с отщеплением полимера и защитных групп. 1 ил. с,ц-ска-сн-смн
1Нф-цН1СН-СН,ОС0-4Н„
0ь0С6) „ где Х: -Ser-Asn(LeuQWlu-Cós Gly-РгоАг9-6!о — Phe-Val — Glu — Asn — SегоH;
-Ser(Lys)NOH зэключэющийся в том, что пептидную смолу формулы:
Р-у, где у - -$еК8от)-Азп(ео) 61о(ОЫ)СузGlu(OBu+Pro-Агу-(H )-G i о (08u ) — Phe—
Чэ!-6! о(08 о )-Азп — Ser(But) 1823876
20 или Ser(Lys(Boc)j
О — сломаный бутиловый эфир, But — бутил, Вос — третбутилоксикарбонил.
P —; О-п-алкоксибенэил-(сополи)-дивинилбензол-стирал или поли-п-бензилоксибенэил, полученную путем постепенного наращивания соответствующей присоединенной к соответствующему полимеру пептидной цепи, исходя из С-концевой аминокислоты, с последующим присоединением серина вводят во взаимодействия с
1 @я-% NH-бн-сОх
СБф-СН;СН-СН,ОСО-СаНз1 с . 00OCI)Hg 3(!E)COOH и затем полученное соединение обрабатывают аниэолом в трифторуксусной кислоте с отщеплением полимера и защитных групп и выделением целевого продукта в виде трифторацетата.
Ниже изобретение поясняется подробнее с помощью примеров, причем вначале расшифровываются примененные в тексте сокращения.
Alt = 2-метилаланин, TFE =- трифторуксусная кислота, EgFR,= фактор роста эпидермиса.
Рагп = пальмитоильный остаток
DCC = дициклогексил-карбомиимид
0МЕ = диметилформамид
FlTC = флуоресцеинизотиоцианат
Fmoc = флуоренилметоксикарбонил
But = третичный бутиловый остаток
PSD9B = сополимеры стирола и дивинилбенэола со связующими группами 4(гидроксиметил)фэноксиметила
HoBt = 1-гидроксибензотриаэол
RITC =- родаминизотиоцианат
HulTN(y) = антигенная детерминанта интерферона человека
»--го
DCU = N,N — дициклогексилмочевина
ЕЕ = этилацетат
Материал и методы экспериментов
Химикаты
Растворители высшего качества фирмы
"Мерк". Высушивание и дистилляцию осуществляли обычными методами. N-метилморфолин ("Мерк") дистиллировали над нингидрином для удаления вторичных аминов. 1-гидроксибенэотриаэол и дициклогексилкарбодиимид также производства фирмы "Мерк". Все производные I-аминокислот производства фирмы "Бахем", BocAib-ОН u Aib-OMe.HCI синтеэированы по методам, описанным в литературных источниках.
Тонкослойная хроматография
Были использованы готовые пластины из силикагеля 60Е25л (фирма "Мерк") и следующие текучие средства: (I) 1-бутанол/ледяная уксусная кислота/вода 3:1:1 (II) хлороформ/метанол/ледяная уксусная кислота/вода 65:25:3:4 (111) хлороформ/метанол/конц. аммиак/вода 65:35;3;4 (IV) хлороформ /метанол /вода 65:25:4 (V) хлороформ/метанол 1:1
В качестве распылительных препаратов использованы . нингидрин, хлор/4,4 бис/диметиламино/дифенилметан/препарат TDM/ и препарат сакагуши. Для сравнения служила дициклогексилмочевина со следующими данными:
Rt(l) 0,91. Rr(ll) 0,82, Rt(ill) 0,92, В (1Ч) 0,81, Rt (V) 0,83
Аминокислотные анализы
Для установления идентичности промежуточных ступеней 200-микрограммовые пробы защищенных пептидов гидролизовали в 6 N HCI в течение 24 ч при 110 С, Промежуточные ступени и целевое звено сегмента гексапептида, содержащие связь
Leu-Leu гидролиэоввли в тех же условиях в течение 72 часов. Аминокислотные анализы осуществляли в биотронном анализаторе LI
6000 Е с применением стандартных программ, 35 Определение рацемата
Гидролизованные аминокислоты были получены как производные и-пропилового эфира пентафторпропиониламинокислоты и энатиомеры методом газовой хроматогра40 фии отделены в стеклянных капиллярных колоннах с помощью хиразил-вал. Укаэанные части в процентах D-аминокислот не корректировали на рацемиэацию, обусловленную гидролиэом, 45 Элементарные анализы
Были осуществлены простые определения С. Н. N на элементарном. анализаторе модели 1104 (" Карло Эрба", Милан).
Температура плавления
50 Значения температуры плавления были определены по методу Тоттоли и не корректировались
Съемка спектров з
С-NMR-спектры: 30 мг защищенного эйкоэапептида растворили в 400 микролитрах C НСlз/ 2С НзО Н (1;1) (фирма "Мерк") и измерили в NMR-спектрометре WM 400 (фирма "Брукер") в течение 12 ч при 30 С.
Круговые дихроичные спектры растворы свободного эйкозапептида (r, 1 1.7 мгlмл) 1823876
1510,4
Элементарный анализ:
55 в этаноле, трифторэтаноле, метаноле, 1.1.1,3.3.3-гексафторпропаноле, воде. а также в смеси этанола с водой измерили с помощью дихрографа 11 (фирма "Юхан-Руссел").
Хроматографическая очистка
Защищенные промежуточные ступени пептида до окончания реакции сочетания и удалении растворителя в масляном вакууме растворили путем добавки одинакового объема СНС!з/МеОН 1:1, отцентрифугировали от дициклогексилмочевины и хроматографировали на сефадексе LH 20: колонна 3 х
115 см; растворитель СНС!э/МеОН 1:1; количество 35 мл; скорость течение 8.40 мл/10 мин. Фракции по 3 мл исследовали в систе- 15 ме 11 методом тонкослойной хроматографии (препарат TDM). Пептиды появились в объеме растворителя 165-190 мл, Фракции объединили, удалили растворитель в вакууме, остаток высушили над PzOs, Аминокис- 20 лотный анализ дал ожидаемые значения и содержание пептида 92 — 96 (,.
Пример 1. Получение РатзСуз-EgFR(516-529)
После обычного ступенчатого синтеза 25 (синтез Меррифилда) под защитой N—
F.moc/(Bu ).Doc/ÍOÂt и симметричных ангидридов) сегмента EgF — R (526 — 529) получили последней аминокислоту Fmoc-Ser{Bu )-OH.
После отщепления защитной группы смесью 30 пиперидин: DMF (1:1, 15 мин) связанный со смолой пентадекапептид EgF-RН.Ser(But Asn-Leu-Leu-G lu(0 Bu )-Суз-Glu-Pro — Ar (H )
-Glu(OBu+Phe-Yat-Gtu(OBu )-Asn-Ser(Bu )О-р-алкокси-бенэил-сополи(дивинил- 35 бензол-стирол) (1 г, загрузка 0,5 ммоль/г) был соеди не н с P а езСуэОН((РааО) (СН2СН (РатО)ЯСН2СНМН(ОРагп)) (2 ммоль, 1
СΠ— ОН 40 в DMF/ÑÍ2ÑI2 (1:1)) и DCI/HOBt (2 ммоля, при 0 С, с предварительной активацией в течение 20 мин (16 ч), затем дополнительное соединение (4 ч). Липогексадекапептид был отщеплен трифторуксусной кислотой (5 мл) с 45 добавлением тиоанизола (0,25 мл) в течение 2 ч, Выход;
960 мг - (76 g) РапiэСуэ-Ser-Asn-Leu(.eu-Glu — Gly-GIu-Pro-Arg — Gtu-Phe- YaIGlu-Asn — Ser — ОН х СЕзСООН аминокислотный анализ
2,00 (2), 1,97 (2), 4,29 (4), 0,88 (1), 1,05 (1), 1,13 (1), 1.12 (1), 0.98 (1), 1,02 (1)
Температура разложения 173ОС.
Индекс Rf: система Н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (2:1:1) 0,62.
Молярный вес 2 616,21 (e виде трифторацетата) Брутто-формула С 124 Н2 ий2оОза5 Рз
fl р и м е р 2. 1. Получение РатзСузSer(LysQO H
PamzCysSer(LysP — ОН был синтезирован по методу твердой фазы (МЕ РРИ ФИЛД) нв сополимере р-алкоксибензилспирт-,PSDNB (1 ) с N — Fmoc-аминокислотами и кислотонеустойчивой защите боковой цепи (t-В и для серина и Вос для лизина). Применены симметричные ангидриды Fmoc-аминокислот. Сцепление на РатэСуэОН было осуществлено по методу DCC/HOBt и повторено для достижения лучшего количественного преврвщения. Для отщепления липопептида от смолы-носителя и для удаления защиты боковой цепи смолу два раза в течение
1,5 ч обрабатывали трифторуксусной кислотой, которая в заключение была удалена в ротационном выпарном аппарате в высоком вакууме. Продукт был перекристаллизован из ацетона.
Элементарный анализ, как и С-спектр указывает на то, что липопептид представлен в виде трифторацетата. Принимая, что
PamaCysSer(Lys)4 — ОН представлен в виде амфотерного иона, остаются еще три е -аминогруппы, которые могут быть протонизированы от трех молекул трифторуксусной кислоты, эC-NMR- пектр РатзСуз--Яег-(1 у@ОН 3TFE показы вает, что соединение представлено в виде трифторацетата (квартет СРз-групп при 110-120 частях на миллион, а также карбонильные сигналы при 161 — 162 частях на миллион). Вследствие агрегации полярной части молекулы линии Lys u Ser — С-атомов значительно расширяются. Карбонильный сигнал при 206,9 частях на миллион происходит от остающегося ацетона, примененного для перекристаллизации.
Молекулярный eec:
Расч. С 56,40 Н 8,70 N 7,56 S 1,73
Осажд, С 5558 Н 933 N 654 S 2 61
Аминокислотный анализ:
Аминокислотный анализ выявил соотношение серина к лизину 1:4.2. Образующиеся при гидролиэе характерные продукты разложения (6 N HCI, 110 С, 18 ч) S-глицерил-цистеина были в наличии (сравнение с известными стандартами). Доля пептидов рассчитана на 83, 3 молекулы TFE на липопептид соответствуют доле пептида
80,2, хорошо соответствуя анализ .
1823876
I 1. Получение РатзСуз — Бег-(1 уз -ОН х3TFE
ll. 1. Сцепление Fmoc — Lys(Boc)OH на смоле-носителе Fmoc — Lys(Boc)-OH (4,5 г, 9,6 ммолей) примешивают в 15-20 мл DMF (CHzCI 1:1) ч/ч (при 0 С с DCC (0,99 г, 4,8 ммолей), Через 30 мин отфильтровывают от осажденной мочевины в утку для встряхивания, в которой помещены р-бенэилоксибензил-спирт-смола (2,5 г, 1,6 ммолей
ОН-групп). После добавки пиридина (0,39 мл, 4,8 ммолей) встряхивают в течение 18 ч при комнатной температуре. Растворитель отсасывают и смолу 3 раза промывают каждый раз 20 мл DMF/ÑÍãÑlã и DMF. Смолу сначала смешивают в 20 мл CHzClz с пиридином (28,8 ммолей, 6Ag) и затем с бенэоилхлоридом (28,8 ммолей, 6 Ag). Встряхивают в течение 1 ч при комнатной температуре.
Растворитель отсасывают и смолу промывают 3 раза 20 мл СНгСlг, DMF, иэопропанолом и РЕ-30/50, Il. 2. Симметричный ангидрид Fmoc-аминокислоты Fmoc-Lys(Boc) — OH (4,5 г, 9,6 ммоля, 3 Ag) растворяют в 15 мл CHzCIz/DMF u смешивают при 0 С с DCC (4,8 ммолей, 1,5
Ag). Через 30 мин при 0 С отфильтровывают от мочевины непосредственно в реактор и обрабатывают дальше, как указано в нижеследующей таблице.
Следующее пс ложен ие г ри годно для
1/5 применечного в начале количества смолы (0,5 г, 0,32 ммоля ОН-групп).
Гп ос-О-бутил-серин (0,74 r, 1,92 ммолей) растворяют в 4 мл CHzClz/DMF и смешивают с DCC (0,96 ммоля) при 0 С.
Через 30 мин при 0 С отфильтровывают от мочевины непосредственно в реактор и, как обычно перерабатывают.
11. 3. Присоединение к РагпзСуз — ОН
P3m3Cys-ОН (0,58 г, 0,64 ммоля) растворяют в 5 мл CHzClz (DMF 1:1) и при 0 С смешивают c HOBt (93 л г, 0,64 ммоля) и
DCC(0,64 ммоля). Через 30 мин при 0 С смесь загружают непосредственно в реактор, Через 16 с встряхивания осуществляют дополнительное сцепление с вышеуказанным молярным отношением в течение 4 ч. Растворитель отсасывают и смолу промывают три раза 20 мл
DMF/ÑÍzÑ1ã и DMF.
il. 4. Отщепление гексапептида от полимера
Boc — защищенное соединение пептида и полимерной смолы (около 1 r) из11. 3 хорошо промывают CHzClz и 2 раза в течение 1,5 ч встряхивают со смесью иэ 5 мл TFE и 0.5 мл анизола. Фильтрат концентрируют в вакууме, а остаток помещают в 5 мл СНС1з.
РатзСуз — Ser(Lys)40H х 3TFE кристаллиэовывается после добавки 50 мл ацетона при
- 20 С, центрифугируется и сушится в высоком вакууме.
Выход:
5 0 41 г (85 )
Температура плавления:
205 С (разл.)
Тонкослойная хроматография на пластинах силикагеля:
10 Rf 0 42 (Растворитель: n — BuOH /пиридин НгО/ ледяная уксусная кислота = 4:1;1:2)
Rf = 0,82 (растворитель: и ВиОН /МеОН/НгО/ле15 дяная уксусная кислота - 10;4:10:6)
Аминокислотный анализ:
Ser 0,95 (1); Lys 4 (4)
Молекулярный вес:
Св7Н >ssN юОюЯР9 (1852,6)
20 Элементарный анализ:
Расч, С 56,40 Н 8,70 N7,,56 S 1.73
Осажд. С 55,58 Н 9,33 N6,,94 S 2,61
III, Получение PamaCys Ser (Lys)4-OH—
25 FIIC х 2TFE
Флюоресциинизотиоцианат (3,9 мг, 10 микромолей) растворяют в 2 мл хлороформа и добавляют в раствор РагпзСуз-Ser (Lós)40Н х 3TFE (18,5 кг; 10 микролюлей) в 2 мл
30 хлороформа. После добавки 4-метилморфолина (10 микролитров, 10 микромолей) перемешивают в течение 1 ч и затем растворитель удаляют в ротационном выпарном аппарате. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа
35 и ацетона 1:1. Желтый продукт выпадает в осадок при - 20 С, его центрифугируют и сушат в высоком вакууме.
Выход;
16 мг после очищения сефадекс LH20
40 Продукт представлен в виде трифторацетата и очень сильно флуоресцирует при возбуждении ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 366 нм-. По сравнению с исходным продуктом е -аминогруппа ковалент45 но связана с FITC. Из этого следует суммарная формула РапцСуь — Ser (Lys)4OH-FITC х 2 TFE с условием. что амфионная структура сохраняется.
Молекулярный вес;
50 С106Н169Й110ггЯгР6 (2127.68)
Тонкослойная хроматография на пластинах силикагеля:
Rr = 0.72 (растворитель: ll-бутанол/пиридин/во55 да/ледяная уксусная кислота = 4;1:1;2)
R< = 0,73 (растворитель: и-бутанол/муравьиная кислота/вода = 7:4:2)
Аминокислотный анализ:
Ser 1,11 (1.00); Lys 4.00 (4 00) 1823876
55
Имеются продукты гидролиза глицерилцистеина
1Ч. Получение РатзСуз-Ser (Lysg-ÎÍ х
ЗНС
РатзСуз-Ser(Lys)4OH х 3TFE 185.2 мг (0,1 ммолей) растворяют непосредственно в небольшом количестве хлороформа и добавляют приблизительно такое же количество эфирного раствора HCI. Хорошо встряхивают, причем часть выпадает в осадок, но большая часть остается в растворе.
Вращают в ротационном выпарном аппарате до получения сухого продукта и снова добавляют эфирный раствор HCt..После многократного повторения этой операции растворяют остаток в небольшом количестве хлороформа и добавляют ацетон до помутнения раствора. Продукт кристаллиэуют в бесцветный порошок при - 20 С, OTcecblвают и сушат в высоком вакууме.
Выход:
153 мг
Молекулярный вес:
C81H159N10O13SCI3 (1619,63)
Элементарный анализ:
Расч. С 60,07 H 9,89 N 8,65
Осажд, С 57,64 Н 11,20 N 8,39
B продукте остается излишняя HCI.
Масс-спектромегрия с десорбцией поля:
M -пик появляется при m!e 1510, а также M * 1 и М + 2. Характерны протонированные фрагменты РавзСув — OH (908,5) при
m/е 910, 909, 911 и 912.
Опыты по иммунизации
Осуществлена ковалентная связь Е-клеточного митогена, который является одновременно отличным носителем и сильно действующим катализатором, с синтетическими антигенными детерминантами.
С этой целью был применен синтетический липопептид S-(2,3-бис(пальмитоилокси)пропил)N-пал ьмитоил-цистеинилсерин(Рэ взСуз — Ser), представляющий собой N-терминал липопротеина из внешней мембраны эшеришиа коли. Особенно выраженные в ковалентной связи с антигеном амфифильные свойства обеспечивают, с одной стороны, стабильное сцепление несущего три остатка жирной кислоты соединения S-глицерила в липидном слое клеточной мембраны. С другой стороны, в результате этого во внешнем гидрофильном слое мембраны представлен более полярный антиген (или гаптен). Так как активирующее действие липопротеина определяется только его N-терминальной частью, то во всех конъюгатах, несущих
РагпзСуз-Ser или аналогии, сохраняется их иммумостимул ирующее действие.
В качестве примера на фиг.1 приведено применение концепции получения специфических антител против рецептора эпидермального фактора роста (EGR R). Для этого путем эпитопного поиска с использованием ЭВМ была выбрана экстрацитоплазматическая область 516-529, построена синтезом Меррифилда и затем надстроен
Fmoc-Ser(Bu }-OH и затем РатзСуз-ОН.
После отщепления смолы аналитическим путем признанный единым конъюгат без других добавок был применен 1.р для мышеи в одной единственной дозе. С помощью теста EUsa уже через 2 недели были установлены высокие титры специфических антител против тетрадекапептида. Важно. что при контрольных опытах одним очевидно иммуногенно слабым тетрадекапептидом не получены титры антител.
Так как РавзСуз-конъюгаты сильно иммуногенны и в клеточных культурах, путем иммунизации 1и vitro можно быстрым и элегантным образом получить условные и моноклональные антитела против слабо иммуногенных соединений.
Преимущества предлагаемого техйического решения заключаются в следующем: прос1ота получения химически однозначно определенных коньюгатов антигена-катализатора в любых количествах, в противоположность другим конъюгатам одноразовое применение без многократного компрессования", высокая эффективность!и vivo u
In vitro. Значительное сокращение лабораторных животных, зачастую даже полный отказ от иммунизации in vivo и резкое уменьшение времени, в частности, при ген-. техноло ических работах. Опыты можно проводить также-с системами клеточных культур человека.
Пример иммунизации 1и vivo, Ва!Ь/С-мыши в возрасте 6 — 10 недель были иммуниэированы путем одноразовой инъекции i,р 50 микрограмм и 500 микрограмм/0,2 мл 10 — 10 молярного раствора
-г ковалентно связанного с антигеном катализатора (РагпзСуз — Ser/EG F-R 515-529). В качестве контроля служили антиген, катализатор и смесь антигена и катализатора в сравнимых молярных количествах, а также средах. Через две недели после инъекции у мышей была взята кровь из ретроорбитального венозного сплетения для получения сыворотки и определен титр антител опытом ELISA.
Аналогичную иммунизацию можно проводить другим путвм. например, внутривенозно. орально, ректально, внутримышечно, подкожно.
1823876
Было исследовано образование специфических антител без катализатора Фройнда против тетрадекапептида EGF — R
516 — 529 по методу иммунизации 1и vlvo, Balb/С-мышей иммунизировали
1. Конъюгатом РатзСуз — Ser(EGF — R 516—
526)
2. Свободным тетрадекапептидом, только EGF — R 516 — 529
3, Только РаазСуз-Ser
4. Свободным тетрадекапептидом (EGF-R 516-529) в смеси с одноразовой инъекцией ip 0,2 микромолей конъюгата. Титр антител был определен при помощи теста
ELISA (орлинатэ при 405 nm).
Через 14 дней после иммунизации у мышей взяли кровь из глазной вены и полученную сыворотку применили в тесте ELISA, Значения получены иэ среднего значения
3 — 5 мышей разности между значениями теста ELISA коньюгата PEP 14 BSA u BSA.
Обнаружилось, что только при использовании мембраносвязанного биологически активного коньюгатэ согласно изобретению найдены значительно повышенные, многократно превышающие в активности предшествующие способы концентрации антител.
Пример иммунизации In п го.
Клетки селезенки мышей к|гьтивировли в течение 5 дней в присутствии ка brorata
Pam Cvs — Se (EGF 515 529), катализатора
РэпзСуз — Ser, те i радека пептидэ F G F-R
516--529. ",меси энтигенэ и катэлизэтора и питэгел ной среды.
Лимфоциты были ку|тьтивировэны при плотно:Tl клеток 2;5 х 10 /мл л течение 48 б
4 в:0,2 мл делимого количества, в питательной среде RPMI 1640, накопленной с 10 термоактивированного глутэмиио л, (2 MM), пенициллином (100 v |ìë), стрептомицином (100 мгlмл) и 2-меркаптоэтанолом (5 х 10 м), -5
Надсэдо нэя жидкость была использована для исследования на специфические антителэ в тесте FLISA.
Уитогеннэя активность клеток селезен ки мышей
1Литогеннэя активация Balb/С-клеток селезенки посредством pamzCys-Ser- (Lys)4F ITS (окружность), Рагл На чертеже на ординате нанесен индекс стимуляции встраивания Н-тимидина в з DNA (значения cpm включения/значения cpm контроля без митогена) против концентрации использованного биологически активного вещества. При сравнении опытов, проведенных in vivo u In vItro установлено, что в.опыте in vIvQ в микротитровых пластинах: плот ость клеток: 2,5 х 10 клеток/мл; концентрация б вещества: 5 х 10 ммолярная; условия инку-7 бации: 37 С, 5 (СОг, 5 дней. Conj.: конъюгат Pam3Суз-Ser(EGF-R 5 515-529) Pep.: тетрадекапептид EGF-R 516 — 529 Adj.: РавзСуз-Ser Mix: смесь свободного тетрадекапептида EGF-R 516-529 и РагпзСуз-Ser. 10 И в опыте ln vitro обнаружено резкое повышение концентрации антител, вследствие чего значительно увеличивается воэможность применения клеточных культур, в особенности для получения антител. 15 Таким образом, описываемый способ позволяет получать мембраносвязанные соединения — малотоксичные и при этом более доступная (благодаря своей синтетической природе), чем известный, выделенный иэ при20 родных источников прививочный материал. Формула изобретения Способ получения мембраносвяэанных соединений общей формулы I 4Ну-(0 NH-ÑÍ-СОХ СН2S-ЩСН-co ÎÎÎ-О15НИ 30 0 104>>g?lay ЫР 000Н где )(— Sei -Asn(Leu)zGlu-Cys-Glu — Pro — ArgGlu--Phe — Val-Glu-Asn — Ser-OH; Ser(Lys)4OH, отличэющийся тем,чтопептидную 35 смолу формулы P-y, где у — Ser(But)Asn Leu Leu — Glu(QBu )Ñóç— Giu(OBur)--Pro-Агд-(Н )6 lu (О В u )Phe-ValGtu(OBu )Asn — Ser(But) 40 или Яеф уз(Вос)14: OBu — сложный бутиловый эфир; But — бутил; Вас — трет-бутилоксикарбонил, P — полимерная с лола 45 î-и-алкоксибензил-(сополи)-дивинил 5енэол-стирол или поли-п-бензилоксибенэил, полученную путем постепенного наращивания соответствующей пептидной цепи, исходя из С-концевой аминокислоты, присоединен50 ной к соответствующему полимеру с последующим присоединением серина. вводят во взаимодейс гвие с Сдачу-СО-И;CH-CCOH 1 cHô-СН -СН-i. H O O- gHu 0COC „?l 1823876 Последовательное построение пептида с симметричными ангидридами Fmoc — аминокислоты оов оа а i го ао аоо Составитель В. Волкова Тех ред М.Моргентал Корректор С. Пекарь Редактор О. Стенина Заказ 2192 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 и затем полученное соединение обрабатывают анизолом в трифторуксусной кислоте с отщеплением полимера и защитных групп и выделением целевого продукта в виде трифторацетата.
