Способ получения авирулентного иммуносорбента для выявления постинфекционных антител при ретроспективной диагностике ящура

 

Изобретение относится у вирусологии и может быть использовано в биотехнологической промышленности для изготовления средств диагностики ящура. Сущность способа заключается в том, что монослойную культуру клеток заражают вирусом ящура и после появления признаков цитопатического действия размножающегося вируса освобождают от ростовой среды. Монослой снимают смесью равных объемов трипсина и версена. Из осадка полученного центрифугированием, после разбавления в 10 раз раствором Хенкса готовят мазки на предметах стеклах. Мазки подсушивают, фиксируют ацетоном и обрабатывают 0,01 - 0,001 Н, раствором соляной кислоты в течение 3 - 5 мин для инактивации интрацеллюлярного вируса. Кислоту нейтрализуют раствором фосфатного буфера и промывают дистиллированной водой. Полученные препараты используют в качестве иммуносорбентов для постановки реакции при ретроспективной диагностики ящура. 4 табл.

Изобретение относится к вирусологии, точнее к способам получения иммуносорбентов на основе инактивированного вируса ящура, находящегося в цитоплазме инфицированных клеток, путем их химической обработки, и может быть использовано в научно-исследовательской работе и биологической промышленности при изготовлении средств диагностики ящура. Целью изобретения является упрощение и сокращение времени технологического процесса при сохранении исходной серологической активности и стабильности иммуносорбента. Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения авирулентного иммуносорбента для выявления постинфекционных антител при ретроспективной диагностики ящура, вкючающем получение инфицированного вирусом препарата клеток, его фиксацию на подложке и последующую инактивацию интрацеллюлярного вируса, в соответствии с изобретением для инактивации интрацеллюлярного вируса фиксированный препарат клеток смачивают 0,01-0,001 н. раствором соляной кислоты в течение 3-5 мин. П р и м е р 1. Матрасы, содержащие монослойную культуру клеток ВНК-21, зараженную вирусом ящура типа А22 со множественностью инфицирования 0,1 ТЦД50/клеток, после появления признаков цитопатического действия размножающегося вируса (округление и увеличение оптической плотности у 10-70% клеток монослоя) освобождают от ростовой среды. Монослой снимают смесью равных объемов 0,5%-ного раствора трипсина и 0,25% раствора версена. Из осадка, полученного центрифугированием в течение 30 мин при 1000 об/мин, готовят после разбавления в 10 раз раствором Хенкса мазки на предметных стеклах, помещая на каждое из них по 2-3 капли клеточной суспензии диаметром 0,5-0,7 см. Стекла с клеточными препаратами подсушивают при комнатной температуре или в термостате при 37оС в течение 45 мин. Затем препараты клеток фиксируют 20 мин охлажденным (от +4 до -19оС) безводным ацетоном. После подсушивания фиксированные препараты клеток обрабатывают 0,01 н. раствором соляной кислоты в течение 5 мин при инактивации интрацеллюлярного вируса. Через 5 мин кислоту нейтрализуют 0,15 М раствором фосфатного буфера (рН 7,6) в течение 10 мин, затем промывают дистиллированной водой, 3-5 препарата используют для контроля на остаточный вирус, а остальные препараты используют в качестве иммуносорбентов для постановки НРИФ при ретроспективной диагностике ящура. Препараты хранят при температуре ниже +4оС в течение 1-2 мес (срок наблюения). П р и м е р 2. Операции по получению препаратов иммуносорбента проводят так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что процесс инактивации проводят 0,01 н. раствором соляной кислоты в течение 3-х мин. П р и м е р 3. Операции по получению препаратов иммуносорента проводят так, как описано в примерах 1 или 2. Отличие состоит в том, что в качестве системы культивирования вируса используют клетки СП. П р и м е р 4. Операции по получению препаратов иммуносорбента проводят так, как описано в примерах 1 или 2. Отличие состоит в том, что в качестве системы культивирования вируса используют клетки СП. Эффективность инактивации интрацеллюлярного вируса соляной кислотой проверяли на препаратах вируса ящура, полученного на разных системах культивирования. Препараты представляли собой предметные стекла, на которые наносили по 2-3 капли суспензии монослой культуры клеток ВНК-21, БП или СП, снятых со стенок культуральных сосудов, ЦПД должно захватывать не менее 10-15% и не более 60-70% клеток. После подсушивания на воздухе при комнатной температуре или при +37оС в течение 30-60 мин сразу же или возможно на другой день препараты фиксировали охлажденным от +4 до -10оС безводным ацетоном в течение 20 мин, а затем подсушивали и обрабатывали 0,1-0,0001 н. растворами соляной кислоты. Инактивацию проводили при комнатной температуре и при 37оС в течение 1-10 мин. На обусловленный схемой опыта момент препараты промывали 0,15 М фосфатным буфером, а затем дистиллированной водой, подсушивали и проверяли остаточную вирулентность титрованием в исходной культуре клеток. Для этого мазки соскабливали с помощью скальпеля, собирали отделившиеся клетки в фарфоровую ступку, тщательно растирали, заливали 1 мл питательной среды для культивирования клеток, проаораживали при -20-40оС в течение часа и осветляли 15-минутным центрифугированием при 3000 об/мин. Результаты титрования выражали показателем К50. Этот показатель характеризует концентрацию инактиванта, защищающую 50% инокулированных культур от поражения остаточным вирусом. Его вычисляли по формуле Кербер-Ашмарина. Опыты показали, что через 3-5 мин значение К50 составляет 0,0001 н. независимо от температуры процесса, а полную инактивацию вируса в зафиксированных клетках обуславливали за это время все концентрации соляной кислоты от 0,001 и выше. Использование полученных инактивированных иммуносорбентов для постановки НРИФ показало, что интенсивность специфического свечения инфицированных вирусом клеток после инактивации 0,001 н. соляной кислотой не уступает свечению клеток, инактивированных согласно прототипу. При более высоких концентрациях соляной кислоты отмечалось ослабление яркости свечения в связи с выраженным повреждением структуры зафиксированных клеток. Результаты исследований инактивированных препаратов культуры клеток ВНК-21 и СП на остаточный вирус приведены в табл.1. Из данных, приведенных в табл.1, видно, что 0,001 н. раствор соляной кислоты надежно инактивирует вирус ящура в инфицированных культурах клеток в течение 3 мин как при 37оС, так и при комнатной температуре. Инактивированные в соляной кислоте препараты не уступают по активности в НРИФ препаратам, полученным по способу-прототипу. Аналогичные результаты получены и при инактивации вируса в клетках БП. Результаты оценки эффективности инактивации интрацеллюлярного вируса предлагаемым способом в сравнении с прототипом приведены в табл.2. Из данных табл.2 видно, что предлагаемый способ получения иммуносорбента для НРИФ по эффективности инактивации вируса ящура, находящегося в цитоплазме инфицированных клеток, не уступает способу-прототипу. Интенсивнсоть НРИФ на препаратах, полученных сравниваемыми способами, оказалось адекватной. В то же время предлагаемый способ позволил продолжительность процесса инактивации сократить в 1920 раз по сравнению с прототипом. Дополнительную оценку качества иммуносорбентов, полученных сравниваемыми способами, провели в опытах по выявлению постинфекционных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота с разным иммунологическим статусом. При этом были использованы пробы сыворотки от животных-реконвалесцентов, поствакцинальные и отрицательные сыворотки от интактных животных. Результаты исследований приведены в табл.3. Данные, приведенные в табл.3, свидетельствуют о том, что как количеству положительных проб, так и по тритрам антител выявляемых в РИФ, сравниваемые иммуносорбенты дали сопоствимые результаты. Проведены исследования, характеризующие стабильность полученного предлагаемым способом иммуносорбента при его длительном хранении в сравнении с препаратами, полученными способом-прототипом. Результаты исследований представлены в табл.4. Из данных табл.4 видно, что по срокам годности для постановки РИФ иммуносорбент, полученный предлагаемым способом, не уступает прототипному и может быть использван в диагностических целях в течение не менее 3 мес. Предлагаемый способ обладает по сравнению с прототипом следующими преимуществами: обеспечивает получение полностью авирулентного в ветеринарно-санитарном отношении препарата, пригодного для широкого практического применения: продолжительность процесса инактивации сократилась в 1920 раз при сохранении исходной серологической активности и стабильности иммуносорбента; достигается упрощение технологического процесса.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АВИРУЛЕНТНОГО ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОСТИНФЕКЦИОННЫХ АНТИТЕЛ ПРИ РЕТРОСПЕКТИВНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЯЩУРА, включающий получение инфицированного вирусом препарата клеток, его фиксацию на подложке и последующую инактивацию интрацеллюлярного вируса, отличающийся тем, что, с целью упрощения и сокращения времени технологического процесса при сохранении исходной серологической активности и стабильности иммуносорбента, для инактивации интрацеллюлярного вируса фиксированный препарат клеток смачивают 0,01 - 0,001 н раствором соляной кислоты в течение 3 - 5 мин.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 2-2002

Извещение опубликовано: 20.01.2002        




 

Похожие патенты:

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для получения моноклонального антитела производного анти-гликопротеина
Изобретение относится к области медицины, точнее к микробиологии и вакцинопрофилактике, и может быть использовано при конструировании аректогенных бесклеточных коклюшных вакцин

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии,, и может быть использовано для определения антигенов в крови

Изобретение относится к биотехнологии и мс^кет быть использовано при приготовлении препаратов для диагностики бруцеллеза

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для серологической диагностики различных хламидийных заболеваний человека и животных

Сср // 381684
Наверх