Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis var кursтакi для получения инсектицидного препарата

 

(5

Т

У (21! (6 (2 (8 (2 (4 (31 (3 (3 (7 ст (7 (U (5

5010514/13

4742274/13

13.10.89

РСТ/US 88/01560 (1 1,05.88)

14.11.91

30,08.93. Бюл. N. 32

18.05.87

US

Соединенные Штаты Америки, предвленные Министром торговли (US)

Рассел С. Трейверз и Филлис А.В. Мартин

Авторское свидетельство СССР

69787, кл. А 01 N 63/00, 1984.

ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS

RINGiENSlS VAR KURSTAKI ДЛЯ ПОЛНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРА(57) Использование: микробиологическая . промышленность, производство средств защиты растений от насекомых. Штамм бактерий Bacillus thurlngiensis получен из почвенного слоя неклассическим способом отбора посредством ацетата натрия и тепла.

Штамм депонирован в коллекции культур в

Северном регионал ьном исследовательском центре департамента сельского хозяйства, CLUA, Пеория под N. NRRL В -18196, штамм является спорогенным, кристаллообразующим и уникальным в том, что требует для роста, споруляции и образования кристаллов питательной среды, содержащей лейцин и валин. Инсектицидный препарат, полученный на основе этого штамма, является высокоэффективным против чешуекрылых насекомых, в частности совки капустной и импортированных мермитид. 1 табл.

Изобретение касается получения нового инсектицидного препарата на основе нового штамма Bacillus thurlnglensls Чаго

m rrisoni ИЯЯ1 В -18196.

Инсектицидный препарат используется дл борьбы с видами насекомых отряда Чешуек ылых, в частности, TRI CHOPLUSIANI, "coâк капустная" и ARTOGEIA RAPAE портированные мермитиды".

Спорообраэующий микроорганизм

В. huringiensis был изолирован свыше 80 ле тому назад, и с тех пор стал коммерчески и вестным в отношении биологической б рьбы с вредителями. Спорообразующие к тки В thuringiensis каждая продуцирует с ру(андоспору) и ромбоаидний беляк аий кристалл (па реп пору или тельца екл юч ения).

Э томоцидные свойства приписываются (исключительно б-эндотоксину, который является основным компонентом параспорального кристалла. Когда кристалл переходит в растворимое состояние в кишке насекомого, он вызывает образование протоксина, который активизируется в результате протеолитического расщепления, Являясь довольно специфическим видом в отношении Чешуекрылых насекомых и некоторых мух и мостиков, В thuringiensls является безвредной по отношению к невосприимчивым отрядам насекомых, животным и человеку. В настоящее время в США.

В. thuringiensis разновидности kurstahi включает инсектицидные продукты В.

thurlngiensis, наиболее широко используемые для борьбы с этими вредителями. Однако эти продукты недостаточно эффективны при промышленном применении.

С другой стороны, синтетические пиретроиды являются химическими инсектицидными агентами, наиболее широко используемыми для борьбы с Чешуекрылыми вредителями. Пиретроиды являются высокоэффективными и обеспечивают более сильную борьбу с вредителями по сравнению с используемыми в настоящее время инсектицидными продуктами В.thuringiensis, Однако недостаток, связанный с использованием пиретроидов, состоит в том, что они являются токсичными в отношении непреслед,емых беспозвоночных, тем самым представляя опасность для окружающей водной среды.

Поэтому существует потребность в эффективных активных против чешуекрылых инсектицидах, которые безопасны для окружающей среды, эффективны по столмости и которые дублируют эффективность синтетических пиретроидов.

Цель изобретения состоит в получении инсектицидного препарата на основе нового штамма В thuringlensls Чаг, rnorrlsoni

МКК1 В-18196 для уничтожения видов насекомых отряда Чешуекрылых, в гастности

TrIchoplusIanI, "совки капустной", и ArtogeIa гарае,"импортированными мермитидами"

Новый штамм В.thuringlensIs бь|л депонирован в коллекции культур в Северном

Региональном Исследовательском центре департамента сельского хозяйства США, Пеория, Иллинойс 61604, под регистрационным inoMepor«NRRL В-18196. Потомство этого штамма будет относиться к Мйй1 .

Новый и>ТВММ является спорогенным, кристаллообразующим мутантным LUTBM мом выделенных из окружающей среды В, thuring iensis и имеет способность продуцировать бипирамидальные кристаллы, состоящие иэ токсичного белка, и является уникальным в том отношении, что является ауксотрофным по лейцину и валину для роста, споруляции и продуцирования кристаллов. В противоположность этому ранее наблюдаемые штаммы В. йиг1пд!епэ1з проявляли ауксотрофность, которая удовлетворялась без аминокислоты, I,ß.Nlckercon ет

aI, AppI, Microblot, 28, 124-128 (1974).

Термин "ауксотрофия" здесь определяется в значении потребности в питательных веществах. необходимых для роста, споруляции и продуцирования кристаллов микроорганизмама.

Фраза "амино-кислотный комплекс питательной среды" определяешься здесь для обозначения питательной среды, содержа45

Штамм NRRL В- i 8196 имеет следующие характеристики; колонии являются круглыми, цельными, выпуклыми и кремового цвета с диаметром колонии 2-7 мм на питательном агаре после 24 часов. Вегетативные клетки явля.отся азробными, грамположительными, подвижными палочками размером 1-1,2 мкм на 3-5 мкм. Концевые (верхушечные) споры вегетативных клеток не раздувают спорангий v, составляют от 33 до 50 ",4:вегетативных палочек, Клетки являются положительными по каталазе, ферменту глюкозы, гидролизу казеина, но вопреки таксономическому описанию прежде наблюдаемых штаммов В, thuringiensis штаммы согласно изобретению не используют цитраты. Новый штамм также не ферментируct маннит, арабинозу и ксилозу. щей комбинацию двух или более аминокислот.

Новый штамм NRRI В-18196 размно>кен из почвенного слоя, используя неклассиче5 ский способ отбора посредством ацетата натрия и тепла, В соответствии с этим спо.собом водная питательная среда буферизуется примерно до 0,25 M ацетатом натрия, чтобы допустить зарождение только неже10 лательных спорообразующих организмов, присутствующих в образце окружающего почвенного слоя, Ватам выращенные спорообразующие организмы и неспорообразующие организмы в образце умерщвля15 лись путем тепловой обработки. Выжившие споры после этого высеивались на чашки и выращивались на соответствующей агаровой питательной среда для получения новых штаммов согласно изобретению, Не прибе20 гая к какой-либо конкретной теории, предполагается, что новые штаммы согласно изобретению образуются во время процесса отбора в результате мутагенеэа, естественно происходлщего в штаммах

25 Й thuringiensis c последующей обработкой ацетатом натрия и теплом, Примером способа селекции является следующии: 0.,5 г почвы бьио добавлено в 10 млс 1-бульон". (100 млс воды, i г триптона, 30 0,5 г экстракта дрож>кей, 0,5 хлористого натрия) в 1 >5 мл дафлекторной колбе. 1 -бульон бьи буфери";003H до 0,25 М ацетатом натрия. Смесь встряхивалась в течение 4 часов при 250 об/мин и 30 С. После использова35 ния проточноготегиовогоустройства пастеризации смесь нагревалась- при 80 С в течение 3 минут. Термообработанная смесь высеивалась на чашки с 1-агаром (I — бульон, отвар>кденный с помощью 1,5 (, агара)

40 и инкубировалась в течение ночи (16 часов) при 30 С.

1837773

20

25 качестве активного ингредиента в укаэан30

45

Дополнительно штамм NRRL B-18196

r дролизовал крахмал, ферментировал саароэу и продуцировал лецитиназу; клетки е использовали эскулин, не продуцироваи уреазу, не ферментировали салицин и У. 5 тамм является стойким по отношению к нтибиотикам пенициллинового типа, таим как нафициллин, ампициллин и метииллин, и является стойким по отношению низким уровням, т,е. около 10 г/мл, неомиина, канамицина и бромида этида.

Как сказано выше, продуцирование пор и белковых кристаллов штаммом В.

huringiensls имеющим характеристики

RRL В-18196, требует водной питательной реды, которая содержит лейцин-валиноый аминокислотный комплекс, Для оптиального образования кристалла бактерией огласно изобретению предпочтительный остав специальной питательной среды явяется следующим: 0,3 % тTрpи пnтTоoн аs,, 00,2 7 риптозы, 0,45 7 дрожжевого экстракта, олученного 0,01 M в буфере фосфата йария при рН 6,8 с добавлением 10 MgS04

10 MnS04 после обработки в автоклаве.

Штамм выращивают при температуре

0 С при 250 об/мин в 2-хлитровых коничеких колбах Эрленмейера с тройными переородками с объемом 25 $ и хранят при емпературе 25 С на среде ТЗ, отвержденой 1,5 агаром.

Другая соответствующая питательная реда, имеющая .требуемый аминокислотый комплекс, может использоваться для

ыращивания бактерий согласно изобретеию. Однако используемая иная питательая среда, нежели и редпочитаемая итательная среда, может привести к меньшенному образованию кристаллов.

Продуцироваиие клеток производится в 4 эробных условиях при любой температуре, довлетворительной для роста микроорганизмов согласно изобретению, т.е, примерно от 10 С до 40 С; предпочитаемый иапаэон температуры между 27 С и 32 С.

Величина рН питательной среды, соответствующей для выращивания культуры В.

huringlensis близка к нейтральности, т.е. рН от 6,7 до 7,2. Время инкубации является временем, необходимым для полного освобождения споры и кристалла,и предпочтиельно составляет от 18 до 24 часов. Клетки могут выращиваться в любой дефлекторной встряхиваемой колбе в ряде небольших опытов. Для операций в более крупных мас- 5 штабах удобно выращивать культуру в ре- . зервуаре, применяя помешивание и аэрацию в отношении инокулированной жидкой питательной среды. После инкубации клетки собираются традиционным способом седиментации, как, например. центрифугированием или фильтрованием. Клетки могут использоваться как таковые или в замороженном виде для последующего использования, Для получения инсектицидной композиции, содержащей штамм В.thurlngiensls var.

morrisonl NRRl В-18196 в качестве активного ингредиента, штамм, который составляет до 30 g оoб6uщtеeгrо o оoб6tъ еeмMаs, смешивают с инертными ингредиентами, которые составляют остаточный объем, т.е. по крайней мере 70 о/, общего объема. Инертный ингредиент может быть просто разбавителем, например, вода.

Другие инертные ингредиенты могут включать консерванты, агенты, контролирующие текучесть, клеющие вещества, эмульгаторы, распыливающие вещества, по8ерхН0сТНо-активные вещества, наполнители и буфер. Используемый интервал доз составляет от 1.1 х 10 до 5.10 спор на

Ю 12

0,405 га. Инсектицид, содержащий мутант В, thuringtensls var morrlsonl NRRL В-18196 в ных дозах, является высокоэффективным в уничтожении насекомых отряда чешуекрылых, в особенности, совки капустной и импортированных мермитид (см. табл, ниже).

Пример способа получения инсектицидного препарата включает смешивание вместе с использованием воздушной мельницы, чтобы обеспечить размер частиц и гомогенность штамм NRRL В-18196,составляющий до 30 7 общего объема с инертными ингредиентами, которые составляют остальной объем. Эти инертные ингредиенты включают консервант, два поверхностно-активных вещества, агент регуляции текучести,разбавитель и буфер. Смесь затем гранулируется с использованием техники сжатия (уплотнения) и упаковывается в воздухонепроницаемые, не содержащие влаги контейнеры.

Инсектицидные препараты могут, разбрызгиваться с использованием традиционных методик и разбрызгивающих устройств. Новый инсектицид может также инкапсулироваться или заключаться в соответствующий инкапсулирующий материал, как органический полимер, и применяться в порошковой форме. Также предусматривается, чтобы генетический материал для б-эндотоксина нового штамма В. thuringlensis мог быть перенесен с использованием техники рекомбинатных ДНК в другие бактерии и растения для обеспечения усиленной борьбы против вредителей.

Нижеследующий пример предназначен иллюстрировать изобретение и не ограни1837773 чивает объем притязаний, как он определен формулой изобретения.

В полевых испытаниях эффективность инсектицида, содержащего штамм NRRL В18196 в качестве активного ингредиента, против совки капусной и импортированных мермитид сравнивалась с эффективностью синтетического инсектицидного продукта, содержащего пиретроид, "ПИДРИН" и инсектицидного продукта В. thuringiensis разновидности Курстаки "ДИПЕЛ Ь", "ПИДРИН" является товарным знаком продукта, продаваемого фирмой "Шелл корпорейшн", и содержит 30 циано (3-феноксифенил) метил-4-схлоральфа (1метил)тип) бензолацетата и 70 инертных ингредиентов, "ДИПЕЛЬ" является товарным знаком продукта, продаваемого фирмой "Абботт пабораториз," и содержит 3,2

% В. thuringiensis разновидности Курстаки и 98,8 0 инертных ингредиентов.

Также испытывались два других новых инсектицидных препарата, содержащих в качестве активных ингредиентов штаммы

В thuringiensis varo Russtari ййй1 В-18197 и В-18195. Инсектициды на основе новых штаммов NRRL В-18197, В-18195 и В-18196 содержали 5,5х10 спор на 0,5 л воды, 0,01 общего объема составлял жидкий детергент (добавленный в качестве распыливающего вещества) и остальной объем составляла вода.

На Восточном берегу Мериленда капуста листовая была прямо высажена семенами в 4-х рядных делянках по 609,60 см длины 07 июля 1986 r. Растения отстояли друг от друга на 5.08 см в ряду и 91.44 см между рядами. Обработка была организована по схеме рандомизированных блоков с

4 повторами. Каждый ряд был буферизован защитным рядом. Почва была супесчаной почвои Норфолк "А". Все обработки опрыскчванием были 5,5 х 10 спор на 0,5 литра

9 воды, в которую добавлялось 0,01 % жидкого детергента в качестве распыливающего вещества, Опрыскивания производились с помошью садового опрыскивателя тромбонового типа, калиброванного для подачи

113.55 л состава 0,405 га.

Ряды обрабатывались опрыскиванием

11,18 и 25 августа и 2 сентября и 8 сентября.

5 15 сентября производились оценки поврежденной листвы и количества насекомых. Давление насекомых из-за естественно происходящего нашествия совки капустной и импортированных мермитидов

10 было умеренным. Оценки повреждения листвы индексировались следующим образом: 1) 0-3 повреждения — случайные отверстия на листьях;

2) 4-10 % повреждения — несколько ли15 стьев с отверстиями;

3)11-25 повреждения -среднее/умеренное число листьев с отверстиями;

4) 26-50 % повреждения — большинство листьев с отверстиями; и

20 5) 51-100 повреждения — повреждение корневой шейки и/ипи все листья с отверстиямими.

Дэнные анализировались методом дисперсионного анализа, и средние значения

25 определялись с помощью испытания множественного ряда Дункана(ОНКТ) при Р- 0,05 уровня (Дункан 1951). Результаты сведены в таблице.

Таблица ясно показывает 10-кратное

30 увеличение инсекционной активности инсектицида, содержащего в качестве активного ингредиента NRRL В- И196 по сравнению с коммерческим продуктом "Дипел".

Такое увеличение было хорошо проде35 монстрировано, когда посла обработки "Дипелом" уровень повреждений составлял менее чем 10, что соответствовало обра, ботке NRRL B-18196 при разбавлении 1:10.

Понятно, что модификации и изменения мо40 гут быть внесены в вышеприведенное описание без отклонения от идеи и объема изобретения

Формула изобретения

45 Штамм бактерий ВасП! оэ thuringlensls

var. Kurstal

1837773 (1,2.3) Средняя оценка листвы, 15 сентября

Обработка и номинал/акр

1,00 а

0.0а

0,0а

1.25

0,50 авс

1.0 авс

В,thurlnglensis

S-18196 5) 2,00

1.0 авс

0.25 ав

В thuringiensis

В-18195 б

2.00

1.25 авс

1.25 авс

2.50 во

2.75

2.26 ее

0,75 авс

2.25 е

3,0 е

4.0

4.50

4.75

1, Любые два числа в одной и той же колонке с последующей той же буквой значительно отличаются (Р = 0,05) 0MRT

2. Распыление производилось 11,18,25 августа и 2,8 сентября.

3. Вред„причиненный, главным образом, совкой капустной и импортированными мермидами, 4 ДИПЕЛ = 7,26 миллиардов международных единиц на 373,2 ч.

5 Калибровано по выходу 7,26 миллиардов международных единиц н . 373,2 ч, Составитель А.Ульянова актор В.Трубченко Техред М.Моргентал Корректор И,Шмакова аз 2874 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва. Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат."Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

ПИДРИН 2,4 ЕС

78.372 r активного ингредиента

/0,405 га

В thuringlensis

 — 18197 6

"ДИПЕЛЬ" 377ч ф

1/10  — 18195

Необрабатываемая конт ольная r я ка

Среднее количество совки капустной на

10 растений, 15 сентяб я

Среднее количество мермитид импортированных на 10 растений, 15 сентября