Способ получения полимерной композиции

 

Использование: для сорбции заряженных макромолекул белков, ферментов, нуклеиновых кислот и т.п. При обработке пищевых отходов, сточных вод. Сущность изобретения: целлюлозу смешивают с окисью алюминия (или двуокисью титана) и полистиролом , нагретым до пластического состояния , при массовом соотношении указанных компонентов 30:20:50. Полученный продукт измельчают, Суспендируют в водном растворе, содержащем неорганическую соль и основание. В суспензию добавляют диэтиламиноэтилхлорид. Суспензию нагревают. Выделяют, сушат продукт и подвергают одной или нескольким обработкам .в воде или водном солевом растворе, имеющем удельную проводимость, не превышающую 7000 umhos, при 60-100°С. 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4614180/05 (22) 18.05.89 (31) 196152 (32) 19.05.88 (33) US (46) 30.08 93. Бюл. N 32 (71) Калтор Лтд (72) Ричард Л.Энтрим и Дональд В.Харрис (US) (56) Патент СССР по заявке RL 3339849/05, кл. С 08 J 3/00, 30.01,91. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНОЙ

КОМПОЗИЦИИ (57) Использование: для сорбции заряженных макромолекул белков, ферментов, нукИзобретение относится к получению гранулированных ионообменных композитов на основе производных целлюлозы, способных связывать заряженные макромолекулы, которые могут быть использованы, в частности, в пищевой промышленности.

Целью изобретения является улучшение адсорбционных и связующих свойств композиции.

Указанная цель достигается тем, что полученный известным способом и выделенный сухой продукт подвергают одной или нескольким обработкам в воде или водном солевом растворе, имеющем удельную проводимость, не превышающую 7000

umhos, при температуре 60-100 С. Время обработки составляет от получаса до 5 ч.

Предпочтительной температурой обработки является 80-100 С. Может быть использована водопроводная вода, депонизированная вода или разбавленный солевой раствор, имеющей удельную проводимость,,, ЫЛ„„183833у АЗ,(я)я С 08 J 3/00, С 08 L 1/28 леиновых кислот и т.п. При обработке пищевых отходов, сточных вод. Сущность изобретения: целлюлозу смешивают с окисью алюминия (или двуокисью титана) и полистиролом, нагретым до пластического состояния. при массовом соотношении указанных компонентов 30:20:50. Полученный продукт измельчают. Суспендируют в водном растворе, содержащем неорганическую соль и основание. В суспензию добавляют диэтиламиноэтилхлорид. Суспензию нагревают. Выделяют, сушат продукт и подвергают одной или нескольким обработкам в воде или водном солевом растворе, имеющем удельную проводимость, не превышающую 7000 umhos, при 60-100 С. 5 табл. предпочтительно, более 1000 umhos, Указанная обработка композиции проводится в течение времени, достаточном для повышения адсорбционной способности по отношению к макромолекулам.

Получаемая композиция в особенности пригодна для адсорбции и иммобилизации глюкозизомеразы. СО

Вследствие высокой загрузочной емко- (, сти ионообменных препаратов целлюлозы, р содержащих глюкозизомеразу, при их использовании в промышленности для превращения больших количеств глюкозы в фруктозу могут применяться сравнительно О небольшие реакторы.

Кроме того, вследствие такой высокой загрузочной емкости, субстрат и получен- („ ный продукт находятся в условиях изомеризации очень непродолжительное время. Эти условия изомеризации, как правило, способствуют образованию небольших количеств нежелательных побочных продуктов, 1838339

55 что I-,Rrlзано с реакционноспособностью фруктозы, ПоэтоМу, чем дольше фруктоза находится в этих условиях, тем в больших коли:1 =i,твах образуются такие не>келательные п11бочные продукты. Таким образом, -:..-=:. .--iая загрузочная емкость ионообменнай целлюлозы приводит к желаемой степени иэомеризации субстрата в короткое время с. уменьшением времени, в течение

СетОООГО фОУКтОЭа НаХОДИтСЯ В УСЛОВИЯХ изимеризации. !Лэвестные препараты, содержащие негранулированную ионообменную uеллюлозу, имеют недостаток, закл:Очающийся в их "уплотнение", вследстDI16 чего их применя1от в виде небольших слоев с целью избежать трудности, связанных с избыточным обратным давлением. Но даже il случае применения небольших слоев существует возможность каналообразования и, как следствие, недостаточная степень контактирования субстрата со связанной или иммобилизованной глюкозизомеразой.

Хотя и созданы определенные препараты иммобилиэованной глюкозизомеразы с целью свесги к минимуму указанные трудностIn, онl1 страдают другими недостатками, ;-1апример, их ферментативная способность или активность на единицу объема не так высока, как хотелось бы, и/или они не так экономичны, как ионообменная целлюлоза, Б соответствии с изобретением получено гранулированное производное целлюлозы двух типов, В гранулированном производном целлюлозы первого типа в качестве эагустителя применяют окись алюминия, а в гранулированном производном цел3нолозы второг" типа в качестве загустигеля применяк>т двуокись титана. Для получения обоих композитов применяют следующу1О мегодику. Агломерат получают смешиванием 30 ч. целлюлозы и 20 ч. загус и1еля (Окись ал1оминия для типа и двуокись титана для типа II) и полученную смесь перемешивают 10 мин с 50 часгями полистирола i3 двухваликовом нагретом!

60-- i80"С, смесителе, После охлаждения г1олученный компоэит размалывают и просеивают через сито на 40-80 MBLU.

В один из двух пластиковых сосуда HB 2 л; еть1рьмя горлами, снабженного мешалкой, термометром с регулятором нагрева вод,. :холодильником и нагревательной пбо11очкой. загружают 300 г гранулированной целлюлозы или типа !. или типа Il (ГЦ! !

rifi;: Г!!!!1 и 942 мл деионизированной воды. !!и;-. пеоемешивании добавляют 300 r беэi3r,l,i40rr, сульфата натрия и затем 82 г 50%но, гидроокиси натрия, К каждой нагретой ц: !О" :: реакционной смеси с помощью насо;;.а и!3; IIBinfIAIoT 1 17 50%-ного диэтилами5

50 ноэтилхлорида (ДЭХ). Реагент прибавляют в течение двух часов, Смесь перемешивают

30 мин при 40 С, затем в каждый сосуд добавляют 62 r NaOH и в течение 2 ч прибавляют дополнительные 117 диэтилхлорида, Затем реакционную смесь нагревают около

30 С при 60 С, охлаждают и добавлением

30%-ной HzSO4 устанавливают рН 6,5. Полученные продукты обозначают как гранулированное производное целлюлозы типа (ГЦ!) и гранулированное производное целлюлозы типа II (ГЦ!!).

Полученные в результате гранулированные композиты могут рассматриваться как исходные с точки зрения последующей адсорбции макромолекул, Т,е, исходный композит в употребляемом здесь смысле — это композит, ранее не подвергавшийся обработке и не загружавшийся такими макромолекулами, Нижеследующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, чо без его ограничения.

Пример 1. Данный пример показывает повышение адсорбционной способности по отношению к ферменту — гл1окозизомеразе, достигнутое в результате обработки гранулированного производного целлюлозы (ГПЦ!) с окисью алюминия в качестве эагустителя водой при 90 С.

50 r сухого свежего базового (с,б.) ГПЦ! просеивают через сито из нержавеющей стали ¹ 60 меш. (стандарт США) из нержавеющей стали с применением 24 л воды иэ распылителя душа.

Просеянное ГПЦ! обезвоживают на воронке из плавленного стекла, присоединенной к вакуумной. колбе, после чего переносят в бутылку и обозначают как образец А.

К 600 мл деионизированной воды в стакане на 1000 мл из нержавеющей стали добавляют 21,7 г сухого базового (сух,б) просеянного ГПЦ!. Стакан помещают в водяную баню, нагретую до 90 С, и смесь перемешивают 30 мин при 90 С.

Горячую смесь фильтруют через грубую воронку из сплавленного стекла, присоединенную к колбе Бюхнера, после чего частицы ГПХ вновь помещают в стакан из нержавеющей стали на 1000 мл. В стакан добавляют вторую порцию деионизированной воды (600 мл) и смесь вторично нагревают при перемешивании в течение тридцати минут на водяной бане при 90 С, Горячую смесь фильтруют как ранее, после чего частицы ГПЦ в третий раз обрабатывают 30 мин на водяной бане при 90 С

600 мл деионизированной воды. После окончательного фильтрования обезвожен1838339 ное, трижды обработанное ГПЦ, помещают в бутылку и обозначают как образец В, Адсорбционную способность обработанного ГПЦ по отношению к глюкозизомеразе определяют по метод!лке с определением в одной точке. В пластиковую колбу на 140 мл с крышкой помещают 4,835 r с.б, (2,0262 г сух.б.) обработанного ГПЦ((образец В), и 50 мл деионизированной воды, К полученной смеси добавляют 0,5 мл 1 M трис-буфера 10 (рН 7) и 1,25 мл глюкозизамеразы (5412 мл) с активностью 6765 (МЕГИ).

Глюкозизомераэа может быть выделена из экстрактов, садер>кащих фермент, с помощью хорошо известных способов. Эти 15 способы очистки включают (но без ограничения только ими): центрифугирование, осаждение солью (напр., сульфатом аммония) и колоночной хроматографией (напр., ионоабменной или аффиннай храматогра- 20 фией), Международная единица глюкозизомеразы (МЕГИ) — это такое количество фермента, которое способна превратить 1 микромоль глюкозы в фруктозу в минуту в 25 растворе, содержащем 2 моль глюкозы, 0,02 моль MgSO<, 0,001 моль СаСЬ на литр при рН 6,84 — б 85 (0,2 М малеата натрия) при температуре 60 C.

Для создания удельной проводимости в 30 з

9,а х 10 umhos добавляют хларид натрия и смесь перемешивают 1 ч, Добавление разбавленной НС(устанавливают рН 7,1 и образец перемешивают 4 ч. После отстаивания образец прозрачной жидкости 35 разбавляют 1:10 и анализируют, Найдена, что активность прозрачной жлдкости в целом соответствует 803 МЕГИ. Таким образом 2,0262 г сух.б. ГПЦ адсарбировали в целом 596Л МЕГИ, чта соответствует 2940 40

МЕГИ/г сух,б, ГПЦ!.

Использованием той же методики для исходного ГПЦ (образец А) определена адсорбционная способность в 1955 МЕГИ/г

ГПЦ! сух.б, с тем же ферментом. Таким об- 45 разом, высокотемпературная обработка .приводит к повышени!о адсорбционной способности ГПЦ((по отношению к ферменту на 50%.

Пример 2, Данный пример показы- 50 вает возрастание абсорбционной способности гранулированного производного целлюлоза с двуокисью титана в качестве загустителя (ГПЦв) при ега обработке водой при 90 С, 55

65,5 г с,б, образца (34,5 r сух.б.) ГПЦ(! перемешива!от в стакане с 600 мл деионизированной воды (комнатная температура) и затем просеивают через сито ¹ 60 меш, (стандарт США) из нержавеющей сталл с применением 24 л воды из душа, Промытое

ГПЦ обезвоживают на фильтре из плавленного стекла, перенося в бутылку и обозначаIoT, как образец А. Этот образец является контрольным, не прошедшим обработку при 90 С.

Другую порци!а в 34,5 r сух,б. образца

ГПЦ(! вместе с 600 мл деиониэированной воды помещают в с!акен иэ нержавеющей стали, Стакан помещают в водяную баню, нагрету!о примерно до 90 С и взвесь перемешивают при температуре водяной бани 1 ч. Полученный продукт промыва!от на ситах

N 60 меш. (стандарт США) из нержавеющей стали с целью удаления мелких частиц с применением около 24 л воды, Образец обезвожива!ат в воронке из сплавленного стекла, памеща!ат !3 бутылку и обоэнача!от, как образец (.

Еще одну порцию в 34,5 r сух.б, образца

Гп!! а . ma

Г...„I, вм= .....,....,е!;=! изированной воды помещают в стакан из нержавеющей стали и обрабатыва!ат па вышеприведенной методике на водяной бане при 90 С в течение 1/2 ч. Твердое вещество отфильтровывают., вновь суспендируют в 600 мл деионизираванной воды и повторно обрабатыва!от нагреванием 1/2 часа на водяной бане при 90 С, Продукт промыва!ат на сите

N. 60 меш, (стандарт США) с удалением мелких частиц, затем обезваживают на фильтре из сплавленного стекла, переносят в бутылку и обазнача!ат, как образец С, Еще одну порцию в 34,5 г сух,б. образца

ГПЦ(! трижды обрабатыва!от порциями по

600 мл деионлзированной соды, каждый раз в течение 1/2 ч на водяной бане при 90 С.

Полученный продукт затем промывают на сите N 60 меш, Iñòàíäãðò США) с удалением мелких частиц с использованием около 24 л воды, Полученный образец ГПЦ(! обезвоживают, помеща!от в бутылку и обозначают, как образец D.

Четыре образца взвешивают и для них определяют адсарбционную способность lio отношению к ферменту гл юкозизомеразы (ГИ), Полученные результаты приведены в таб!1.1.

Пример 3. В данном примере показана адсорбционная способность образцов гранулированной целлюлозы (ГЦ), сначала переведенной в производные с различными количествами ДЭХ и затем обработанной при 90 С водой.

Получение производных.

В шесть четырехгорлых сосудов из пластика емкость!о 2 л, снабженных мешалкой, термометром с регулятором нагревания по времени, холодильником и обогревательной оболочкой, помещают 300 г стандартно1838339

30

35 ао

50

55 -о ГПЦ (смесь полистирола, целлюлозы и двуокиси -итана в качестве эагустителя, соответственно 50, 30 и 20,, получение см, выше) и 942 мл деионизированной воды.

При перемешивании добавляют 300 г безводного сульфата натрия и затем 82 r. 50 нога гидроксида натрия. В каждом случае к нагретой до 40 С реакционной смеси с помощью насоса Тессо прибавляют определенное количество хлоргидрата диэтиламиноэтилхлорида (ДЭХ), соответствующее его 50 / 600/ 70% 80% 900 и 100% ной стандартной концентрации. 50 ДЭХ прибавляют 2 ч, Реакционные смеси перемешивают 30 мин при 40 С и затем в каждый из пластиковых сосудов прибавляют 62 г 50%-ного гидроксида натрия и вторую половину 50%

ДЗХ в течение 2 ч.

Реакционные смеси нагревают около 30 мин при 60 С, охлаждают и добавлением

Н2$О4 (30 -ной) устанавливают рН. Условия реакции для ка>кдого продукта приведены в табл.2.

Просеивание и промывание.

Продукты реакции просеивают через сито N 30 меш, (стандарт США) и собирают на сите М 60 меш. (стандарт США) использованием ка>кдый раэ около 24 л воды из душа. Продукт от каждого просеивания (т.е.

30-60 меш. по стандарту США) перемешивают s 2000 мл воды и промывают на сите

N- 60 (стандарт США) использованием 24 л воды иэ душа, Твердое вещество вновь диспергируют в 2000 мл воды и вновь промывают на сите N 60 меш. (стандарт США) с использованием в каждом случае 24 л воды из душа. Шесть продуктов реакции обезво>кивают на фильтре иэ сплавленного стекла, Высокотемпературная обработка, В стаканы из нержавеющей стали на

1000 мл помещают по 50 г сух,б, продукта и

600 мл деионизированной воды и стаканы ставят на водяную баню при 90 С, после чего взвеси ГПЦ перемешивают 2 ч при температуре бани. Твердое вещество отделяют горячим фильтрованием на грубом фильтре из сплавленного стекла и затем суспендируà r в 600 мл деионизированной воды и снова перемешивают 2 ч на водяной бане при

90 С, Полученные горячие взвеси ГПЦ фильтруют через грубый фильтр из сплавленного стекла и затем твердое вещество повторно суспендируют в 600 мл деионизированной воды и снова нагревают 2 ч на водяной бане при 900С. После фильтрования трижды обработанные ГПЦ просеивают на сите М 60 меш, (стандарт США) с промыванием 24 л воды из душа. Полученные продукты обеэвоживают и в них определяют адсорбционную способность по отношению к глюкоэизомеразе. Ниже приведены полученные результаты.

Содержание ДЭХ, 100 90 80 70

60 50

Адсорбционная способность после обработки при 90 С (МЕГИ/г ГПЦ, сух,б.)

3130 2714 2538 2538 2468 1953

Как можно было бы ожидать, адсорбционная способность по отношению к глюкозизомеразе будет умейьшаться в зависимости от концентрации ДЭХ. Однако

ГПЦ, полученное использованием только

60/ ДЭХ обладает адсорбционной способностью, эквивалентной ГПЦ, полученному со 100 ДЭХ, но не обработанного при 90 С (см. пример 2), Пример 4. В данном примере показано действие температуры обработки на . адсорбционную активность ГПЦ, 300 r сух.б. образца ГПЦц просеивают и промывают по методике примера 2. Просеянное ГПЦ обезвоживают на воронке из сплавленного стекла и тщательно перемешивают. Образцы смешанного ГПЦц суспендируют в деионизированной воде (10 мл/г сух.б.), Образцы перемешивают 2 ч при различных температурах в интервале 50—

100 С, Образцы ГПЦц затем отделяют фильтрованием в воронках иэ сплавленного стекла. В каждом образце ГПЦц отбирают пробу для анализа, а остальное количество

ГПЦц вновь суспендируют в свежей воде для повторной двухчасовой обработки. После второй обработки образцы ГПЦц отделяют фильтрованием, в них также отбирают пробу для анализа и затем их в третий раэ суспендируют в воде и обрабатывают. После третьей обработки образцы ГПЦц промывают холодной водой на сите М 60 меш., обезвоживают фильтрованием и тщательно перемешивают, Оставшиеся образцы после однократной и двукратной обработки также просеивают, обезвоживают и смешивают.

Адсорбционную способность каждого из полученных образцов ГПЦц по отношению к глюкозизомеразе определяют по методике примера 1, но с использованием нескольких точек адсорбции для,различных количеств ГПЦц при постоянном количестве фермента, Адсорбцис иную способность рассчитывают по кривой зависимости активности изомераэы от массы добавляемого

ГПЦц. Полученные результаты приведены в табл.3.

При всех испытанных температурах адсорбционная способность улучшалась за счет многократной обработки. Адсорбционная способность повышалась с увеличением

1838339 температуры обработки, так что адсорбционная способность удваивалась после двух или трех обработок при 100 С.

Пример 5. В данном примере показано влияние высокотемпературной обра- 5 ботки на улучшение адсорбционной способности ГПЦ1! по отношению к белку, отличному от глюкозизомеразы.

Для определения того, будет ли обработка горячей водой улучшать адсорбцион- 10 ную способность по отношению к другим . белкам так же, как по отношению к глюкоэизомеразе, 0,2 раствора альбумина бычьей сыворотки (АБС) получают растворением белка в 10 мМ трис-буфера (рН 7). 15

Добавлением хлорида натрия удельную проводимость в растворе устанавливают равной 9000 umhos.

Образцы промытого и просеянного

ГПЦп, а также ГПЦл, трижды обработанного 20 при 100 С по методике примера 4, используют для определения адсорбционной способности по отношению к АБС. Взвешенные порции каждого образца ГПЦп суспендируют в аликвотах на 50 мл раствора АБС и 25 перемешивают 60 мин, Образцы ГПЦц оставляются отстаиваться под действием силы тяжести, после чего отбирают образцы прозрачного верхнего слоя с целью опреде30 ленные. в табл.4

55 ления концентрации растворенного АБС по ультрафиолетовому поглощению при 280 км.

Адсорбционную способность подсчитывают по разнице концентраций растворенного

АБС до и после добавления ГПЦц.

Обработанный при 100 С ГПЦи адсорбирует 19,7 мг АБС/г сух.б., в то время как необработанный ГПЦ(! адсорбирует только

11,6 мг БСА/г сух.б. Таким образом, обработка при 100 С увеличивает адсорбционную способность по отношению к альбумину бычьей сыворотки примерно на 70 .

Пример 6, В данном примере показано влияние высокотемпературной обработки на другие носители, для которых известна способность адсорбировать глюкозизомеразу.

Для определения того, является ли улучшение адсорбционной способности ГПЦ после обработки горячей водой общим свойством адсорбентов изомеразы, несколько носителей, для которых известна способ-. ность адсорбировать глюкозизомеразу, 2 ч обрабатывают при 90 С водой. Затем определяют адсорбционную способность по отношению к изомеразе для необработанных и обработанных носителей, Испытаниям подвергались волокнистая ДЭАЭ-целлюлоза ватман (1), макропористая полистирол-четвертичный аминная смола (2) и макропористая полифенол-четвертичный аминная смола (3).

Порции в 10 г каждой смолы суспендируют в 100 мл деиониэированной смолы и перемешивают 2 ч при 90 С. Затем смолы отделяют, обезвоживают в воронке из сплавленного стекла и по методике примера 4 определяют адсорбционную способность по отношению к иэомеразе. Никакой разницы в адсорбционной способности обработанных и необработанных носителей 1,2,3 не обнаружено, Адсорбционная способность ватмана снизилась после обработки с 3407 МЕГИ/г для необработанного носителя до 2429 МЕГИ/т.

Таким образам, обработка водой не улучшает адсорбционной способности любого другого, не относящегося к ГПЦ, носителя.

Пример 7. В данном примере показано, что высокотемпературная обработка как водопроводной водой, так и разбавленным солевым раствором, также эффективна для повышения адсорбционной способности ГПЦ.

Для сравнения с деионизированной во-. дой водопроводной воды (удельная проводимость 620 umhos) и разбавленного раствора хлорида натрия (удельная проводимость 5000 umhos) образцы ГПЦи трижды обрабатывают по методике примера 4 при

90 С каждым раствором, Затем по методике примера 1 определяют адсорбционную способность по отношению к глюкозизомеразе.

Получены следующие результаты, представОбработка водопроводной водой почти также эффективна, как и обработка деионизированной водой, для повышения адсорбционной способности ГПЦ. Разбавленный солевой раствор (0,05 M NaCl) более эффективен, по сравнению с деионизированной или водопроводной водой, Пример 8. B данном примере показано влияние удельной проводимости (концентрации соли) на обработку ГПЦ.

Для определения влияния удельной проводимости на эффективность обрабогки образцы ГПЦ трижды обрабатывают при

100 С по методике примера 2 растворам хлорида натрия с различной удельной проводимостью. Затем по методике примера 1 определяют для каждого образца, обработанного ГПЦ, адсорбционную способность по отношению к глюкозизомераэе. Получены следующие результаты, представленные в табл.5.

Во всех случаях обработка улучшает адсорбционную способность ГПЦ, по сравнению с необработанным контрольным образцом. Оптимальное улучшение достигается после обработки солевым раствором с удельной проводимостью 1000

umhos (0,01 í. NaCI).

1838339

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Адсорбционная способность обработанных ГПЦл

Формула изобретения

Способ получения полимерной композиции, способной адсорбировать или связывать заряжен н ы е ма к ро молекулы, включающий смешение целлюлозного материала и окиси алюминия или двуокиси титана с полистиролом, нагретым до пластического состояния, при массовом соотношении

30:20:50, измельчение полученного продукта, суспендирование его в водном растворе, содержащем неорганическую соль и основание, добавку диэтиламиноэтилхлорида в суспензию, нагрев суспензии, выделение и сушку целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й5 с я тем, что, с целью улучшения адсорбционных и связующих свойств композиции, выделенный сухой продукт подвергают одной или нескольким обработкам в воде или водном.солевом растворе, имеющем удель10 ную проводимость, не превышающую 7000

umhos, при 60 — 100 С, 14

1838339

Продолжение табл. 3

Таблица 4

Таблица 5

Составитель О, Рокачевская

Техред M,Ìoðãåíòàë Корректор А. Мотыль

Редактор

Заказ 2902 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул.Гагарина, 101