Способ получения рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей бычий гормон роста, способ биосинтеза производного бычьего гормона роста
Использование: генетическая инженерия , биосинтез белков, в частности бычьего гормона роста. Сущность изобретения: рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие бычий гормон роста получают в результате лигйрования фрагмента BamHI-Xbal плазмиды pCZ101 размером 10,2 kb или BamHI-EcoRI фрагмента той же, плазмиды с Ipp промотором и репликоном, теряющим контроль числа копий при 30°С, с BamHI- Xbal .фрагментом плазмиды pCZ101 или pCZ106 размером 0,6 kb, кодирующим аминокислоты с 15 до 191 бычьего гормона роста и ДНК-линкером, содержащим нуклеотиды. кодирующие последовательность активации трансляции, стартовый кодон и кодон для N-конца производного бычьего гормона роста. Способ биосинтеза состоит в том, что культивируют штамм Escherlchia coli, трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК pCZ110, или pCZ153. или pCZ154, культивирование трансформантов, выделение и очистку целевого продукта. 2 с.п. ф-лы, 2 табл., 15 ил. ел с
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N.15/18, 15/70
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПЛТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОсплтент сссР) «
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (21) 3867006/13 (22) 04,03.85 (46) 30.08.93. Бюл, N. 32 (31), 586582; 634920 (32) 06,03.84; 26.07,84 (33) US (71) Эли Лилли Энд Компани (US) (72) Хансен Максвелл Хсиунг (СА) и (TW), Рональд Джордж Шонер и Бригитте Элизабет Шонер (US) (56) Е P N. 0075444, кл. С 12 N 15/00, 30.03.83. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ БЫЧИЙ ГОРМОН РОСТА, СПОСОБ
БИОСИНТЕЗА ПРОИЗВОДНОГО БЫЧЬЕГО ГОРМОНА РОСТА (57) Использование: генетическая инженерия, биосинтез белков, в частности бычьего гормона роста. Сущность изобретения: рекомбинантные плазмидные ДНК, кодируюИзобретение относится к новым селективным и автономно реплицирующимся
В6КТораМ экспрессии, рекомбинантной
ДНК, которые состоят из транскрибируемой и транслируемой. активированной нуклеотидной последовательности, находятся в рамке считывания гена, который кодирует биоактивное производное бычьего гормона роста (бГР), и репликона, который в индуцированных условиях утрачивает контроль числа копий.
Изобретение относится также к способу биосинтеза бычьего гормона роста с использованием указанных векторов.
Развитие и эксплуатация технологии рекомбинантной ДНК для получения бГР были сильно затруднены проблемами экспрессий Ы«„1838412 АЗ щие бычий гормон роста получают в результате лигирования фрагмента BamHI-Xbal плазмиды pCZ101 размером 10,2 kb или
BamHI-EcoR1 фрагмента той ж плазмиды с
Ipp промотором и репликоном, теряющим контроль числа копий при 30 С, с BamHIXbal .фрагментом плазмидьг pCZ101 или
pCZ106 размером 0,6 kb, кодирующим аминокислоты с 15 до 191 бычьего гормона роста и ДНК-линкером, содержащим нуклеотиды, кодирующие последовательность активации трансляции, стартовый кодон и кодон для N-конца производного бычьего гормона роста. Способ биосинтеза состоит в том, что культивируют штамм
EscherIchia cali, трансформированный рекомбинантной плазмидндй ДНК рС2110, или pCZ153, или pCZ154, культивирование трансформантов, выделение и очистку целевого продукта. 2 с.п. ф-лы, 2 табл., 15 ил, гена. Некоторые иэ этих проблем, детально описанные в заявке на Европейский патент
N 0075444,, включают транскрипцию функционально субоптимальной мРНК. Такая мРНК имеет вторичные конфигурации стержня и петли, что препятствует нормальному рибосомному связыванию и таким образом резко снижает или даже предотвращает бГР экспрессию. Изобретение разрешает эту проблему, обеспечивая векторы для высокого уровня экспрессии производных бГР.
На фиг.1 — 4 изображена схематическая иллюстрация протокола конструирования плазмиды pNM575; на фиг.5-8 — схематическая иллюстрация протокола конструирования плазмиды pNM7898; на фиг.9 — карта сайта рестрикции плаэмид рС21920 и pJR1:
1838412
ATG слт ттт ссс сст лтс тст
ЮС ° ° i 1 ° 1 ° .111 11 С
TAC CTA AAA ССС Ct!Л TAC ACA
ATG АЛЛ GGG ЛЛТ ТСТ ATG GCC TTC
Ф II III III I! III III ° С
TAC ТТТ CCC ТТА АСЛ TAC CGG AAG (5) 5
3 (1) 5
3 стс тсс ссс 3 .а-а
CCA CCC ATC ТСС ТТ0 ТСС CGC
111 Iс tс II ФФI ° I а а
CGT CGG ThC ACG ААС AGG CCG а
ATC ТТТ CCA CCT.ATC TCT СТА
I I
ATG GAT CAT AhG ТТТ CCG CCT ЛТС
1 I\ III 11 11\ С\ 111 ° II
TAC CTA СТА TTC ААЛ CGC CGA TAC (6) 5
3 (2) 5
Э тлс ллл Сст ccA TAG hch GAT
10 тст стс тсс Gcc 1 э
°, -а-а1
AGA GAC ACG CCC 5, TCT CCT 3
1 I
ACA CCA 5
15 лтс GTT ттт ccc ccT ATG TcT
1 I t С I \ С I I I Ю I Ф
ТЛС CAA AAA CCC CGA AGA
Атс Ттт ccA ccc лтс ccT cTA
1 I ° \11 1 11 °
TAC AAA CGT CCC ТАС CCA CAT (1) 5
l3) 5
20
TCT CCT 3 CTG TCC СГС 3
I I
GAC ACC CCC 5
СТА
I I
СAT
ATG TTC CCA GCT ATG TCT (4) 5
ОГ
l0
t I
TAC AAG CCT CCA TAC AGh (0) 5 Атс сст ттт ccc ccT ATG TGT
I ° с I
Э TAC CGA AAA С СС ССЛ ТАС ACA
ТСТ CGT с \ I а а
ЛСЛ ССЛ 5
15
CTG ТСС CTC
11 11 Фю а а
GAC AGG CAG
R1 является последовательностью ДНК, которая кодирует транслируемый стоп-сигнал, который представляет собой где А является деоксиаденилом;
ЭО
5 TAA
Э АТТ
3 5 ТЛС 3
5, 3 ЛТС 5, и(н
) 5 TCA
Э ACT
Э
Векторы настоящего изобретения могут :: связывания следующих Xbal-H Al линкербыть сконструированы путем независимого 40 ных последовательностей ДНК: а) 5 CTAGAGCGTATTAATA ATG AAA CCC AAT TCT ATC
tltt 1 1 Ю 1 тссслтллттлт тлс ттт ссс ттл лсл тлс ссс ттс ссА ссс лтс тсс ттс тсс ссс стс
11 ° 111 IСI 111 \ 1 111 Ю
CGG AAG CCT CCG TAC AGC АЛС ACC CCG GAC
TTT GCC AAC CCT CTGCT 3
1 I IIIIIII
ААА CGG TTG CCA С . 5
b) 5 CTAGACCGThTThhTh6 ATG TTT CCA GCC ATG CCТ с Ф 1 I I I II I I I I I
Э TCCCAThhTTAT ТАС AAA GCT ССС ТАС ССА
CTA TCT GCT CTG ТТТ ССС AAC ССТ CTGCT 3
111 II I I I \ I I ° 111111
ChT ACA CCh GAC hAA CCC ÒÒG ССЛ С 5
CTAGAGGGTATTAATA ATG ТТТ CCA GCT ATG TCT
1 ° I I I I 1 Ф I I \ 1 1 I С I I С 1 С
TCCCATAATThT TAC ллл сот CGA TAC AGA с) 5
Э
CTA ТСТ ССТ CTG ТТТ CCC AAC CCT GTGCT 3
I I I t I t I I f \ I 1 С I I I \ I I
СЛТ АСЛ CCA СЛС ААА CCG TTG CGA С 5, на фиг,10 — карта сайта рестрикции плазмиды pCZ112; на фиг,11 — синтетический ген тимозин альфа 1, на фиг.12 — flpoтокол синтеза нуклеотидного фрагмента
Т15, на фиг,13 — протокол конструирования г)лазмиды рНп а1; на фиг.14 — протокол конструирования плазмиды pH17h4A1. на фиг.15 — протокол конструирования плазмиды рН1104, G — деоксигуанилом;
С вЂ” деоксицитидилом;
Т вЂ” тимидилом;
R — последовательностью ДНК, которая кодирует аминокислоты 9 (лейцин) по 191 (фенилаланин) бычьего гормона роста;
Селективный автономно реплицирующий рекомбинантную ДНК вектор экспресии в соответствии с изобретением состоит из неконтролируемого репликона и транскрибируемой и транслируемой активиру)ащей последовательности, которая находится в рамке считывания гена, который кодирует биоактивное производное бычьего гормона роста, причем ген является
1838412
TCT CTG TCC GGC CTG TTT GCC
hGA GAC hGG CCG GhC ЛЛЛ ССГ.
Зо
3 ллс сст GTGcT
ТТГ CGA С
35 стс ттт ссс ллс сст стсст з
I I II 3!
GAc ллл cGG ттс cGA c 5 ло
ТсТ стс тсс стс стс ттт Gcc
hÑË СЛС ЛСГ СЛС .ЛС АЛЛ Ссс
)о. Алс сст стсст ттс cch c 5 з, GGc cTG ттт ссс Ahc сст стсст! II LII II I I t I
CCG GAC Ahh ССС TTG CGA С
5О
5
n) зо тст сто тсс ссс сто ттт Гсс
ЛСЛ GAC ЛСС ССС ГЛС ЛЛЛ ССГ ллс сст стсст 3
t ттс cGA c 5
)о
35 во фрагменты примерно 10.2 kb BamHI-Xbal и 0,6 kb BamHI-Hgl AI плазмиды pCZ101.
Полученные в результате плазмиды обозначают соответственно как плазмиды
pCZ1920, pJRI и рАТ2, они содержат транслируемую и транскрибируемую активирующую последовательность липоп ротеинового гена Е. coll (Nakamura and Inouye
1979, Cell 18:1109) при считывании каркаса кодирующей последовательности для биоактивного производного бычьего гормона рОста; соответственно размещенный транслируемый стоп-сигнал; и репликон неконтролируемого роста. Клетки, трансформированные плаэмидами
pCZ1920, pJR1 и рАТ2 соответственно, экси рессируют М ЕТ-LIS-CLY-ASPN-SER-М ETALA-бГР, МЕТ-PHE-PRO-ALA-MET-ALA-R u
МЕТ-бГР, где
МЕТ является метионином, 20
LI S — лизином, *) 5 сслсс лтс слт GAT ллс ттт ссс сст ATG тст
t тсс тлс стл стл ттс ллл Gcc сГА тлс лсл сто тсс ссс стс ттт Гсс ллс сст стсст з !
GAc hGG ccG Ghc ллл cGG ттс cGA c 5
4 ь) cchch ATG ттс ссА сст лтс тст стл тст сст
3 TGT тлс ллГ ССт CGA TAC AGA GAT AGA CCA
cGAcc ATG GAT ттт ccG GcT ATG тст стс тсс
1 тсс тлс стл ллл ссс ссл тлс лсл слс лсс
CGATC ATG GAT ТТТ CCG GCT ATG TCT CTG TCC тлс тлс cTA AAA Gcc ссл тлс AGA слс AGG ссс стс ттт ссс ллс сст GTGcT з
I 1 I t I I
CCG GAC AAh CGG ттС CGA c
I где А является деоксиаденилом, G — деоксигуанилом, С вЂ” деоксицитидилом, Т вЂ” тимидилом, 45 во фрагменты примерно 10 kb EcoRIBamHI и примерно 0,6 kb Ватн!-Hgl А! плазмиды pCZ101 и фрагмент примерно
0,29 kb EcoRI-Clal плазмиды pNM608. Полученные в результате плазмиды, обозначен- 50 ные соответственно как плазмиды pCZ112, рАТ1, pASP1, pASP2, pCZ154, pCZ155 и
pCZ156, содержат транскрибируемую и транслируемую активирующую последовательность триптофанового гена Е. coll 55 (HallewelI and Emtage, 1980, Gene 9:27) в рамке считывания кодирующей последовательности для биоактивного производного
Gl Y — глицином, ASPN — аспарагином, SER — серином, ALA — аланином, РНŠ— фенилаланином, PRO — пролином, бГР— природной аминокислотной последовательностью бычьего гормона роста, начинающейся с N-терминального (первого) фенилаланина.
R является природной аминокислотг ной последовательностью бычьего гормона роста, начинающейся с шестой аминокислоты (лейцина) от N-терминала.
Карта сайта рестрикции каждой из плазмид pCZ1920 и pJR1 представлена на фиг.9.
Дополнительные плазмиды, которые также входят в область настоящего изобретения, могут быть сконструированы независимо связыванием следующих линкерных последовательностей ДН К Тац)+! 9) Ai: е) 5 сслсс лтс стт ттт ссс ссг лтс
3 TGG тлс CAA AAA GGC CGA тлс
f) 5 cGAcc ATG TTT ссс сст лтс
3 тсс тлс ссл ллл асс ссл тлс
g) 5 СГЛТА АТС СЛТ ТТТ ГСГ GCT ATG
3 TAT TAC CTA AAA GGC CGA TAC бычьего гормона роста; соответственно помещенный транслируемый стоп-сигнал и неконтролируемый репликон, Клетки, трансформированные плаэмидами pCZ112, рАТ1, pASP1, pASP2, рС2154, pCZ155 и
pCZ156, соответственно экспрессируют
MET-ASP-ASP-LYS-бГР, МЕТ-бГР, METASP-бГР, МЕТ-ASP-бГР, MET-НА(-бГР, МЕТ-ALA-PHE-PRO ALA MET-SER-IEU-SERНА1 -б ГР и MET-ASP-бГР,;де
МЕТ является метионином, ASP — аспарагиновой кислотой, LEU — лейцином;
SER — серином.
PRO — фенилаланином, LYS -лизином. НА1 — валином, ALA — аланином, 1838412
40
50
55 б ГР является природной аминокислотной последовательностью бычьего гормона роста, начинающейся с аминокислоты 9, лейцина; бГР является природной аминокислотной последовательностью, начинающейся с
N-терминального„(первого) фенилаланина.
Карта сайта рестрикции иллюстративной плаэмиды pCZ112 представлена на фиг.10, Плазмида рС2101 исходного материала содержит примерно 10,8 kb и сконструирована лигацией фрагмента примерно 0,6 kb
Xbal-BamHI плазмиды pNM789B в подобным образом переваренную плазмиду
plM-1 -АЗ. Последняя плазмида, которая содержит транскрибируемую и транслируемую активирующую последовательность липопротеинового гена Е. coii, а также и репликон неконтролируемого роста, может быть получена из Е, coli K12 RV308/plM-1, АЗ, штамма, депонированного и составляющего часть постоянно хранящейся коллекции культур Северной региональной исследовательской лаборатории, Пеория, Иллинойс. Штамм является доступным как предпочтительный источник и хранилище плазмиды под регистрационным номером
ИВВИ3 В-15733. Исходный материал плазмида pNM789B происходит из плазмиды
pKEN111 в соответствии со стадиями, иллюстрированными и описанными на фиг.1—
8 и в примере I ниже. Плазмида рКЕ111 может быть получена из Е, coli К12
СС620/pKEN111 штамма, депонированного и являющегося частью постоянно хранящейся коллекции культур Северной региональной исследовательской лаборатории, Пеория, Иллинойс. Штамм является доступным как предпочтительный источник и хранилище плазмиды под регистрационным номером МВВ1 8-15011. Плазмида
pNM789B также содержит транскрибируемую и транслируемую активирующую последовательность липопротеинового гена
Е.coli и, кроме того, кодирующую последовательность, включающую соответственно расположенный, транслируемый стоп-сигнал, для конденсированного протеина, включающего бГР и девятичленный полипептид у бГР N-терминала. Лигирование последовательности, кодирующей конденсированный протеин, содержащийся в фрагменте Xbai-BamHI, к соответственно расщепленной плазмиде plM-1 -АЗ приводит в результате в вышеупомянутой плазмиде pCZ101 исходного материала.
Исходный материал плазмиды рМ608 содержит примерно 4,6 kb и сконструирована путем лигации фрагмента EcoRI-Cial плазмиды рН17 Л4Л1 в EcoRI-Clal — пере5
30 варенную плазмиду рВ,322. Плаэмида рН17 Ь4 Л1 может быть сконструирована в соответствии с методикой примера 5 ниже, Иэ-за множественности сайтов рестрикции
Та 1 в плаэмиде рН17 h4 Ë1 желаемый фрагмент EcoRI-Tagl лучше всего может быть генерирован субклонированием фрагментов рН17 Л4 Л1 EcoRI-Hpal u Hpal-Tagl., Плазмида pNM608 содержит Е. coll триптофан транскрибируемую активирующую последовательность и, следовательно. является полезной для конструирования в изобретении.
Специалисты в данной области должны знать, что различные линкеры ДНК, описанные выше, являются важными компонентами изобретения. Эти последовательности могут быть удобно синтеэировзны с помощью модифицированного фосфор-триэфирного метода, использующего полностью защищенные дидеоксирибонуклеотидные строительные блоки. Такие методы синтеза хорошо известны на данном уровне техники и могут быть осуществлены по существу в соответствии с методикой Итакуры и др„
1977, Science, 198; 1056; и Крив с сотр., 1978, Pro, Nat, Acad, USA 75:5765. Кроме того, особенно предпочтительный способ описан в Hsiung et al„,1983. Исследование нуклеиновых кислот 11:3227, и Narang ec ai., 1980.
Методы вэнзимологии 68:90. Линкеры коди-. руют транслируемую активирующую r ocëåдователъность и также аминокислоты, составляющие первый участок (N-терминальную область) вышеупомянутых производных бГР. Остальная кодирующая последовательность бГР (включая соответственно расположенный. транслируемый стоп-сигнал) и также транскрибируемая активирующая последовательность могут быть обеспечены лигацией соответствуащего фрагмента плазмиды pCZ101. Такие лигации приводят в результате к иллюстративным плазмидам экспрессии производно;,.
ro бычьего гормона роста изобретения. „. I
Деления фрагмента рестрикции примерно 900 пар оснований ВзсЕ11 плазмиды
pCZ101 с последующей перециркуляриза-. цйей приводит в результате в плазмиде
pCZ103. BstE11 делеция не оказывает воздействия на область кодирования бГР в плазмиде pCZ101, Используя плаэмиду
pCZ103 вместо плазмиды pCZ101 в вышеупомянутых конструированиях получают в результате подобные плазмиды, но меньше
900 пар оснований. Производные бГР, экспрессируемые этими происходящими из
pCZ103 плазмидами, следовательно, являются идентичными производным, экспрес1838412
10 сируемым происходящими иэ рС2101 их дубликатами.
Итак, используя фрагменты рестрикции плазмиды pCZ103 примерно 9.3 kb BamHIXbai и примерно 0,6 kb BamHI-Ho Al вместо фрагментов рестрикции плазмиды pCZ101 примерно 10,2 kb BamHI-Xbal и примерно
О,:6 kb BamHI-Hgi Al a вышеупомянутых конструированиях из плаэмид pJ1 и рАТ2 получают в результате конструкцию производных плазмид р.1К1.3 и рАТ2.3 соответственно. Используя фрагменты рестрикции плаэмиды pCZ103 примерно 9,3 kb
Вап Н!-Есор! и примерно 0,6 kb BamHI-Hgi
AI вместо фрагментов рестрикции плазмиды pCZ101 примерно 10,2 kb BamHI-EcoRI u примерна0,6 kb ВamHI-Hgi Al в вышеупомянутых конструированиях из плаэмид рАТ1, рМР1, pASP2, pCZ154, рС2155 и pCZ156 получают в результате конструкции производных плазмид рАТ1.3, pASP2.3, pCZ154.3, pCZ155.3 и pCZ156.3 соответствен но. Изрбретение никоим образом не ограничивается использованием конкретной транскрибируемой активирующей последо вательностью, так как выбор определенной последовательности не является критическим для работоспособности изобретения. . Транскрибируемые активирующие последовательности, которые могут быть заменены ранее описанными липопротеиновой и триптофановай активирующими последовательностями, включают, но не ограничиваются Е, coli лактознай (lac), бактериофаговой ilPz0z и бактериофаговой
APE(0$ транскрибируемыми активирующими последовательностями. В дополнение к этому одна или несколько транскрибируемых активирующих последовательностей, или их частей, могут быть использованы совместно, такие как, например, trp u tac или тас транскрибируемые активирующие последовательности, Все вышеупомянутые последовательности были охарактеризованы ранее и могут быть сконструированы или синтетически или иэ известных плаэмид.
В определенных вариантах, описанных здесь, репликация плазмиды определяется термоиндуцирующимся репликоном неконтролируемого роста, описанным как в британской патентной публикации N. 1557774, так и в Uhlin et al„1979, е е 6:91. При температурах ниже 30 С, в частности 25 С, репликон поддерживает относительно низкое число копий, примерно 10- 15 копий на клетку, При повышении температуры до 37 С контроль числа копий теряется и плазмиды, содержащие репликон, амплифицируются до 1000-2000 копий на клетку. Конкретный рЕпликон неконтролируемого роста, приве25
35
45
50 ляет собой полезную первую стадию в
5
20 денный здесь в качестве примера, содержится в ранее описанной плазмиде р1М-1 АЗ исходном материале. Специалисты в данной области должны понимать. что изобретение не ограничивается использованием какого-либо конкретного репликона неконтролируемого роста или мутанта числа копий. Другие репликоны. вызывающие безудержный рост или большое число копий, могут быть получены путем соответствующей селекции или могут быть сконструированы в соответствии с процедурой, описанной в Международной публикации N W082/02901. Такие репликоны могут быть использованы для конструирования векторов экспрессии, которые также входят в область изобретения.
Клонирование генов в векторы, содержащие репликон неконтролируемого роста, приводит в результате к индуцированию L1 потере контроля числа копий, к сильному увеличению скорости синтеза белка и сопутствующему образованию до настоящего времени неизвестных и неописанных видов внутриклеточных белковоподобных гранул.
Такие гранулы, которые также входят в изобретение, являются высоко гомогенными по их белковому составу, и, следовательно, отличимы от известных высокомолекулярных агрегатов и инклюэий, которые иногда встречаются в клетках-хозяевах,. содержащих рекомбинантную ДНК. Последние включения являются гетерогенными, обычно содержащими ассортимент клеточных компонентов, таких как нуклеинавые кисло4 ты, углеводы, липиды и пептиды, и содержат только 10 — 20 конкретного белкового продукта. Гранулы изобретения являются высоко однородными по целевому протеиновому продукту, составляющему по крайней мере
50ь, а чаще более 80 гранулы.
Настоящие новые виды гранул могут быть легко выделены из лизатов клеток, они являются стабильными к промывке низкими концентрациями мочевины или детергентов, Промывка удаляет белки, которые связаны. не специфически в грануле, Выделение, которое генерирует высоко специфический активный материал, представочистке чужеродных белков. Все последующие стадии очистки, следовательно, упрощаются. Особенно полезным является тот факт, что компоненты клеточных стенок могут быть легко отделены от гранул.
Полагаем, что образование гранул изобретения изолирует такой чужеродный белок, чтобы не происходило нарушения нормального клеточного метаболизма и nðåæäaâðåìåíí0é гибели клеток, Некото18лб412
25
ЗО
35 генерирования дополнительных оснований 40 в мРНК, Водородное связывание между та-. кими комплиментарными основаниями при50
55 рые белки, такие как человеческий проинсулин, быстро деградируют в Е.coli è не накапливаются. Однако, когда такие белки кодируются в векторах, содержащих репликон неконтролируемого роста, проинсулиновый -белок образует. нерастворимые гранулы, которые защищают первоначально нестабильный белок от протеолитическогоо разложения, Следовательно, образование настоящего вида гранул является полезным не только для накопления нестабильных белков, но также для упрощения процедур выделения и очистки генных продуктов, Многие модификации и варианты настоя щих илл юстративных последовател ьностей ДНК являются возможными, Нап ример, вы рожден ность генетического кода допускает замещение нуклеотидов на всем протяжении областей, кодирующих полипептиды, а также замещения транслируемых стоп-сигналов TAG или TGA не спеАСТ . АСТ циально подтвержденный примером транслируемый стоп-сигнал ТАА . СледоваАТТ. тельно, как определено здесь выше, может быть одной из любых возможных последовательностей ДИК, которые кодируют аминокислоты 9 (лейцин) до 191 (фенилаланин) бГР. Такие последовательности могут быть выведены из.известной аминокислотной последовательности бГР и могут быть сконструированы по следующим традиционныМ синтетическим процедурам. Однако нуклеотидные триплеты должны быть выбраны в соответствии с известными принципами и экстраполяциями, рассмотренными у Цукера и Стейглера, 1981. Исследование нуклеи- новых кислот 9(1):133, чтобы избежать водит в результате к конфигурациям стержня и петли и свертыванию, которое снижает эффективность трансляции. Специалисты в данной области должны понимать, что все описанные выше модификации и вариации могут быть традицйонно синтезированы в полном соответствии с цитированными ранее синтетическими методиками. Следовательно, изобретение никоим образом не ограничивается специально представленными в примерах последовательностями ДНК и плазмидами, Векторы экспрессии и способ изобретения могут быть применены к широкому кругу организмов-хозяев, например, грамотрицательным прокариотным организмам, таким как Escherichia соП, E. co!i
К12 Е. coli К12 RV308, Е. coli К12 НВ101, Е.
coli K12 С600, E. coll K12 С600 Rg-М -, Е. coli
К12 RRI, Е. соИ К12 ММ294 и подобным. Хотя все варианты изобретения являются полезными, некоторые векторы и трансформанты являются предпочтительными, Предпочтительные векторы включают pCZ1920, pJR1, pJ1.3, pCZ112, рАТ1, рАТ1.3, рАТ2, рЛТ1.3, pASP1, pASP1,3. pCZ154, pCZ154.3, pCZ156, pCZ156,3, pASP2.З и pASP2, а предпочтительные трансформанты включают Е. coil
К12 RV 308/pJR1, Е. coll К12
RV308/pCZ1920, Е. coll К12 RV308/plRI, Е.
coll K12 RV308/pJRI,3, Е. coll .К12
RC308/рС2112» Е,-соИ К12 RV308/рАТ1, Е, coll К12 ВЧ308/рАТ1 3, Е. cali К12
RV308/pAT2, Е. cali К12 ВЧЗ08/рАТ2.3, Е, coli К12 RV308/pASP1, E. coli К12
RV308/pASP1.3, Е.coll 312 RV308/pCZ154, Е, coll K12 RV308/pCZ" 54.3, Е, соИ К12
RV308/pCZ156, Е. cali К12 RV308/pCZ156.3, Е, coll К12 RV308/pASP2Ç и Е. coll К12
RV308/pASP2. Иэ этой предпочтительной группы особенно предпочтительными являются плазмиды pCZ112, рС2154, pCZ154.3, рСЛ156, pCZ156.3, pASP2.3 и pASP2 и трансформанты Е. coli К12 RV308/pCZ112, Е. coll
К12 RV308/pCZ154, Е. coii К12
RV308/рС2154.3, Е. coli К12 RV308/pCZ156;
Е, coli К12 RV308/pCZ156.3, Е. coli К12
RV308/pASP2.З и Е.coll К12 RV308/ðÀÐ2.
Специалисты в данной област должны знать, что векторы экспрессии изобретения используются для трансформации подходящих организмов-хозяев, таких, чтобы производное бычьего гормона роста зкспрессировалось при использовании стандартных условий ферментации, Продукт. экспрессированный в виде высоко гомогенной гранулы и выделенный рутинными методами из полученного в результате лизата клеток-хозяев, является полезным для повышения молочной продуктивности и обычно для стимулирования роста крупного рогатого скота, Способы использования, введения и подходящие дозировки для крупного рогатого скота известны и описаны в Публикации
Европейского патентного ведомства N
0085036. страницы 7 — 9, приведенной здесь в качестве уровня техники. Следующие примеры далее иллюстрируют изобретение, описанное здесь, Пример 1, Конструирование плазмиды pNM789B.
А. Конструирование плазмиды pKEN021 и ее фрагмента Xbal-BamHI.
В качестве исходного материала используют фрагмент 5,1 kb полученный путем Xbal-BarnHI расщепления плазмиды рКЕКО21(106 на фиг.3). Плаэмида рКЕМ021
1838412 является производной pKEN111 (101 на фиг,1) и далее описана у Ли с сотр., 1981, g
Bact. 1.46; 861-866 и у Цвибеля и сотр„1981, J. 8ас, 145: 654-656), которая внесена в Е. со!! СС620 (NRRL номер хранения 15011) и которая имеет фрагмент примерно 2,8 kb, который содержит липопротеиновый ген Е.
coll. Описание этого фрагмента приведено
Накамура и Иноуе, 1979, Cell18: 1109-1117, В pKEN021 последовательность из 650 пар оснований между единственными сайтами рестрикции EcoRI u Sall pB 322 была заменена последовательностями, взятыми из липопротеинового гена Е, coll.
Последовательность липопротеинового гена (Накамура и Иноуе; 1979) включает фрагмент 462 пар оснований Al и !, идущий вверх от первого триплета (метионин) липопротеинового гена; который содержит промотор, 5 нетранслируемый участок и участок связывания рибосомы. Единственный сайт рестрикции Xbal локализован в сайте связывания рибосом 16 пар оснований перед метиониновым сигналом инициации трансляции. Pvull сайт рестрикции, локализующий 105 пар оснований вверх от концевого кодона трансляции структурального гена, был заменен на сайт рестрикции
BamHI при добавлении синтетического линкера ДНК (5 ССССАТССССЗ, полученного из Коллаборатив Рисерч). Кодирующая последовательность для последних тридцати пяти аминокислот липопротеина, сигнал окончания трансляции, и последовательность, соответствующая 3 нетранслируемому участку информационной РНК, следуют за BamHI сайтом, Плазмида pKEN021 также включает некоторые периферические по. следовательности 850 пар оснований; не относящиеся к липопротеиновому гену и локализованные вниз от него в хромосоме
Е; coll. Эти последовательности включены как следствйе способов и сайтов рестрикции ферментов, использованных при первоначальном выделении гена.
Ссылаясь на фиг.1, 2 и 3, плазмида
pKEN021 получена из рКЕМ111 следующим образом: примерно 50 мкг pKEN111 (101 на фиг.1) переваривают 25 ед, фермента рестрикции Hpall в 300 мкл буфера, содержащего 20 мМ Трис. HCI, рН 7,4, 10 мММ9С!2 и B мМР-меркаптоэтанола, при 37 С в течение 2 ч, Смесь дважды экстрагируют 300 мкл смеси 50:50 фенола и хлороформа и извлеченную водную фазу затем осаждают 2,5 обьемами этанола и 0,1 объема 3М ацетата натрия. Шарик ДНК растворяют в 100 мкл злектрофоретического буфера и фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле (акриламид: бис отношение равно 29:1 для
50 всех гелей. за исключением того, гд» отмечено), Гель окрашивают в растворе, содержащем 0,5 мкгlмл этидинийбромида и визуализируют полосы при длинноволновом ультрафиолетовом облучении.Изолируют полосу 950 пар оснований и извлекают из геля электроэлюцией в мешок. После экстракции фенолом/СНС!з и осаждения этанолом извлеченную ДНК (приблизительно
2,5 мк) растворяют в 25 мкл TEN (10 мМ
NaCl, 10 мМ Трис, НС!, рН 7,4 и 1 мМ этилендинитрилтетраацетата натрия (ЭДТА) рН
8,0).
Примерно 2 мкг фрагмента Hpall 950 пар оснований переваривают ферментом рестрикции Alu I в 200 мкл буфера, содержащего 50 мМ NaCI, 6 мМ Трис, HCI (рН 7,6), 6 мМ М9С!2 и 6 мМ р-меркаптоэтанола, в течение 2 ч при 37 С. ДНК фракционируют на 6%-ном полиакриламидном геле и извлекают и очищают описанными ранее способами фрагмент Alul 462 пар оснований.
Фрагмент 462 пар оснований Alul (приблизительно 1 мкг) растворяют в 10 мкл Т4 ДН К лигазного буфера (66 MM Трис. HCI, рН 7,6, 10 мМ MgClz, 10 мМ дитиотрейтола, 0,4 мМ
АТР), содержащего 150 пикомолей фосфорилированного EcoRI линкера (5 GGAATTCC3 из Коллаборатив Рисерч) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы. После инкубации в течение 16 ч при 4 С смесь нагревают 10 мин при 65 С и разбавляют до 100 мкл добавлением EcoRI буфера (100 мМ Трис. НCI, рН
7,2, 50 MM NaCI, 10 мМ MgCIz, 6 MM P-ìåðкаптоэтанола) и 40 ед. фермента EcoRI, После 2 ч при 37 С образец удобно экстрагируется фенолом (СНС!з и осаждается этанолом. Затем ДНК растворяют в 20 мкл Т4 ДНКлигазного буфера, содержащего
0,1 ед, Т4 ДНК лигазы и 0,1 мкг pBR322 (102 на фиг.1), которую затем линеаризуют
Есор, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой. После лигации при 4 С в течение
16 ч полученную в результате ДНК используют., чтобы удобно трансформировать Е.
coll штамм К12 НВ101. Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 12 мкг/мл тетрациклина и изолируют плазмиды из устойчивых колоний путем быстрой щелочной экстракции, описанной у
Бернбойма и Доли, 1979. Исследование нуклеиновых кислот 7: 1513:1523. Отбирают плазмиду (103 на фиг.1), содержащую 466 пар оснований фрагмента Xbal-BamHI, и используют в качестве исходного материала для следующей описанной стадии.
Около 2 мкг этой плазмиды (103 на фиг.2) переваривают 2 ед. фермента Hind !!! в 50 мл Hind !!! буфера (60 мМ NaCI. 10 мМ
Трис. HCI, pH 7,4. 10 MlvJ МЕСЬ и 6 мМ
1838412
/1-меркаптоэтанола) в течение 1 ч при 37 С.
После экстракции фенолом/СНС1з и осаждения этанолом ДНК растворяют в 200 мкл буфера, содержащего 300 MM NaCI, 30 мМ ацетата натрия, рН 4,25, 1 мМ ZnCIz и 200 ед, Sl нуклеазы (Майлс Лебораториз). После
1 ч при 15 С реакцию останавливают экстракцией фенолом/СНС1з и осаждением этанолом, Полученную в результате ДНК растворяют в 10 мкл Т4 ДНК лигазного бу- 10 фера, содержащего 20 пикомолей фосфорилированных BamHI линкеров (5 CCGGATCCGG3 из Коллаборатив Рисерч) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы, После 16 ч при 4 С реакционную смесь нагревают 10 мин при 15
65 С для инактивации лигазы, а затем разбавляют до 100 мкл в BamHI буфере (150 мМ
МаС1, 20 мМ Трис, H CI, рН 8,0, 10 MM Mg Clz, б мМ Р-меркаптоэтанола), содержащем 20 ед. фермента ВагпН1. После 2 ч при 37 С 20 смесь очищают на 1%-ном агарозном rene, Гель окрашивают и извлекают злюцией больший фрагмент (примерно 4.5 kb) после охлаждения, а затем очищают экстракцией фенолом/СНСlз и осаждением этанолом, 25
Извлеченный фрагмент с BamHI липкими концами растворяют в 20 мкл Т4 ДНK лигазного буфера, содержащего 0,1 ед. Т4 ДНК лигазы, После 16 ч при 4 С используют ДНК для трансформации Е, coli НВ101, Транс- 30 форманты отбирают по устойчивости к ампициллину (Ap") при 100 мкг/мл и скринируют на чувствительность к 10 мкг/мл тетрациклина (Tc). Несколько плазмид, полученных по описанной ранее про- 35 цедуре Вирнбойма, из колоний, которые являются AprTcs, были исследованы на отсутствие Hindlll сайта и присутствие единственного BamHI сайта. Последовательный перевар Есой1. Sall дает фрагмент 466 пар 40 оснований и фрагмент 305 пар оснований, Отбирают плазмиду (104 на фиг.2) с этими характеристиками l1 затем модифицируют для превращения EcoRI сайта, локализованного выше Ipp промотора, в Hind ill сайт рестрикции.
Переваривают 2 мкг плазмиды (104 на фиг.2) в 100 мкл Есор буфера с 0,2 ед. EcoRI в течение 10 мин при.37 С. Реакцию останавливают нагреванием в течение 10 мин 50 при 65 С, а затем после экстракции фенолом/СНСlз осаждают ДНК этанолом, растворяют в 200 мкл Sl нуклеазного буфера, содержащего Sl нуклеазу в количестве 1000 ед,/мл и проводят реакцию при 12 С в тече- 55 ние 1 ч, Реакцию останавливают экстракцией фенолом/СНС1з и осаждением этанолом. Полученную в результате ДНК ресуспендируют s 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пикомолей фосфо4 рилированного Hind III линкера (5 CCAAGCTTGG3 из Коллаборатив Рисерч) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы. После 16 ч при 4 С смесь нагревают 10 мин при 65 С, разбавляют до 150 мл в Hind lll буфере, содержащем 10 ед,: фермента Hind ill, инкубируют
2 ч при 37 С, а затем фракционируют на
1%-ном агарозном геле. Самую большую полосу (эквивалентную единственному отрезку плазмиды) обычно извлекают и очищают, растворяют в 20 мкл Т4 лигазного буфера. содержащего 0,2 ед. лигазы, инкубируют при 4 С в течение 16 ч, а затем используют при трансформации в Е. coll
НВ101. Отбирают трансформанты по устойчивости к ампициллину, изолированные плазмиды анализируют с помощью рестрикционного ферментного анализа. Отбирают плазмиду(105 на фиг.2) с фрагментом ЕсоИHind Ill из 500 пар оснований и используют как вектор клонирования для введения 3 участка Ipp гена.
Переваривают около 2 мкг плазмиды (105 на фиг,3) в 50 мкл буфера Sall рестрикции (150 мМ NaCI, б мМ Трис. HCI, рН 7,9, 6 MM МцС12, 6 мМ Р-меркаптоэтанола) с 2 ед. Sall в течение 1 ч при„37 С, а затем разбавляют в 150 мкл буфера BamHi, содержащего 2 ед. BamHI. После 1 ч при 37 С прибавляют 2,5 ед. щелочной фосфатазы и продолжают инкубирование в течение 1 ч при 65 С. Материал экстрагируют фенолом/СНС1з, осаждают этанолом, растворяют в TEN и используют в качестве клонирующего вектора для Ipp Т-фрагмента, Для получения фрагмента, содержащего область 1рр 3, переваривают 10 мкг pKEN
ill (101 на фиг.3) в 200 мкл H pal буфера (20 мМ KCI, 10 MM Трис. HCI, рН 7,4, 10 MM
MgClz и б мМ /3-меркаптоэтанола) с 10 ед.
Hpal в.течение 2 «37 С, После экстракции фенолом/СНСlз и осаждения этанолом. растворяют ДНК в 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пикомолей фосфорилированного . Sall линкера (5 GGTCGACC3, из Коллаборатив Рисерч) и
2 единицы Т4 ДНК лигазы, а затем инкубируют 16 ч при 4 С. Лигазу инактивируют при нагревании при 65"С в течение 10 мин. Полученный в результате материал разбавляют в 100 мл. в Sall буфере, содержащем 10 ед, Sall, и инкубируют 1 «37 С, затем разбавляют в 300 мл в Pvuli буфере (60 мМ
NaCI, б мМ Трис. ICI, 7,5, 6 мМ М9С12, 6 мМ
/З-меркаптоэтанола), содержащем 10 ед. рестриктивного фермента Pvulll. После 1 ч при
37 С ДНК фракционируют íà 5%-ном полиакриламидном геле. Извлекают примерно
0,5 мкг фрагмента 950 гар оснований, очищают и растворяют в TE. Разбавляют 0,2 мкг
1838412 фрагмента в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пикомолей фосфорилированного ВатН! линкера (5 ССООАТСССОЗ, из Коллаборатив Рисерч) и 2 ед. Т4 ДН К лигазы, а затем инкубируют 16 ч при 4 "С. Полученную в результате
ДНК загем нагревают в течение 10 мин при
65 С, разбавляют в 100 мкл BamHI буфера, содержащего 20 ед. Вагп Н!, инкубируют при
37 С в течение 2 ч, а затем фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле, чтобы удалить избыток линкерных молекул, Полученный в результате фрагмент 950 пар оснований, имеющий BamHI u Sall липкие концы„очищают традиционным способом и растворяют в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего как 0,2 мкг клонирующего вектора, описанного ранее, и 0,2 ед. Т4
ДНК лигазы. После инкубирования в течение 16 ч при 4"С используют ДНКдлятрансформации в Е. соИ К12 НВ101, Получают плазмиды из устойчивых к ампициллину трансформантов и традиционно анализируют Sall-BamHI фрагмент. Описанную плазмиду (примерно 5,2 I.b) обозначают
pKEN021 (106 на фиг.3).
Переваривают 10 м / м е р к а п то э т а н о л а) . и <-. п о л ь з у я 1 0 е д. ВагпН!, в течение 1 ч, затем 10 ед. Xbal в течение евое 1:i при 37 С.. Желаемую переваренную Xbal-BamHI ДНК затем обрабатыван)т 2.5 ед щелочной фосфатазы в течение 1,5 ч при 65 С экстрагируют фенолом /CHCla, собирают при осаждении этанолом и растворяют в 50 мкл TEN для дальнейшего использования (107 на фиг.3). Б. Конструирование плаэмиды pNM575. В качестве источника фрагмента ДНК, содержащего кодирующую последовательность для участка гена человеческого гормона роста используют плазмиду pt rpED50chGH800 (108 на фиг.4) описанную Мартиалом с со,р. 1979, Science 205:602607, Этот фрагмент также может быть сконструирован синтетически (Итакура с сотр. 1988-и Кри с сотр. 1978) или может быть получен с использованием известных методик, описанных Гудманом с сотр, 1979; Методы в Знзимологии 68;75-90, путем выделения MPHК, кодирующей человеческий гор 10Н роста, из гипофиза человека. Участок гена человеческого гормона роста плазмиды ptrpED50chGH800 содержит единственный Smal сайт рестрикции 6 пар оснований ни>ке от кодона окончания трансляции гена. Зтот сайт был заменен на сайт BamHI при использовании следуюв1ей процедуры: переваривают 6 MKr плазмиды 6 ед, Smal в 200 мкл буфера Smal рестрикции (15 мМ Трис. HCI, рН 8,0, 6 мМ MgCI„, 16 л1М KCI и 6 MM /3-меркаптоэтанола) в течение 1.5 ч при 37 С, После окончания переваривания 5 проводят экстракции фенолом (СНС!з и извлекают ДНК осаждением этанолом, затем растворяют ее в 24 мкл TEN, Прибавляют 40 пикомолей фрагмента фосфорилированного ВагпН! адаптера (Коллаборатив Рисерч) к 10 0,5 мкг(0,2 пикомоля концов) переваренной выше плазмиды к 16 мкл лигазного буфера, содержащего 2 ед. Т4 ДНК лигазы. Смесь инкубируют 2 ч при 22 С, 16 ч пои 4 С и затем 10 мин при 65 С. Генерируют BamHI 15 липкие концы путел традиционного переваривания BamHI регтрикционным ферментом. Фермент расщепляет линкерную последовательность, а также BamHI сайт, локализованный у начала клонированной последовательности ДНК человеческого гормона роста. Зто дает фрагмент 691 пар оснований с липкими BaniHI концами, который выделяют на 6%-ном полиакриламидНоМ геле, а затем извлекают обычным 25 способом, Извлеченный фрагмент ДНК лигируют (используя 0,2 ед. Т4 ДНК лигазы в 20 мкл буфера в описанных ранее условиях) с 0,2 мкг переваренной BamHI и обработанной шелочной фосфатаэой рВ 322 (102 на фиг,4). После 16 ч при 1 С материал испогьзуют для трансформации в Е.coli штамм JA221/NRRL NB-15014 по существу в соответствии с процедурой трансформации Венсинка с сотр. 1974, СеИ 3:315-325. Отбирают 35 трансформанты на агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, а затем изолируют обычным способом плазмиды и идентифицируют их с помощью анализа рестрикционными ферментами и гель-элект40 рофореза. Желаемые плазмиды, обозначенные как pNM575 (109 на фиг.4), содержат BamHI фрагмент приблизительно 700 пар оснований, и амплифицируют их обычным способом для дальнейшего ис45 пользования, В. Конструирование плазмиды pNM702, Последовательность ДНК зрелого человеческого гормона роста содер..кит сайт РпоД11, который имеет 47 пар оснований от первого нуклеотида. Переваривают 25 мкг pNM575 в 250 мкл BamHI буфера с 25 ед. BamHI при 37 С в течение 1 ч, Фрагмент 591 пара оснований с BamHI липкими концами обычно выделя от ía 6%-ном полилакрпла55 мидном геле и очищают, После очистки фрагмента одну треть его (эквивалентную 8 кг плазмиды) переваривают в 100 мкл Рп Д11 буфера (6 мМ NaCI, 6 мМ Трис, HCI, рН 7,4, G MM MgCIz, 6 мМ /3-меркаптоэтанола) с 2,5 ед. РпиД11 в течение 1,5 ч при 37 C. 1838412 Используют электрофорез на 6 -ном полиакрила)лидном геле и стандартные процедурыи извлечения для выделения фрагмента 538 пар оснований ДН К, содержащего кодирук) щую посл вдова гол ь ность для последних 175 аминокислот гена после транслируемого Гтоп"си)нала. Фрагмонт двунитевой ДНК (110 на фиг.5) был синтезирован фосфотриэфирным методом для соединения области Ipp п ромо- 1р тора с участком, кодирующим человеческий гормон роста, Двунитевый фрагмент ДНК (110 на фиг,5) имеет следующую последователь)10cTb: 15 г 1 9 СТЛСЛСССТЛТТАЛТЛАТСТТСССАТТССАТСАТСАТСАТЛАСТТСССAA1I Ю ЮЮЮ Ю ° Ю ° I II 1 ° ° i11 3 ° tcccATAATTATTACAAGGGTAAccTACIACIACIAIICAAGGGTT- 20 Фрагмент был получен известным фосфотриэфирным способом, по которому были получены следующие сегменты: 30 )) CTAGAGGGTAT 2) TAATAATGTTCC 3) CATTGGATGAT Л) GATGATAAGTTCC 9) CAACCATTCCC 6) ттйтсслссс 7 ) TTTTTGACAACG О) CTATGCTCCG 9) СЛТТЛТТЛАТАСССТ 10) ЛТСССАЛ 11) сттлтслтслтслтссл 12) GGTTGGGAA 13) GGATAAGGGAAT 14) СТСЛАААЛСССТ 19) CGGAGCATAGCGTT 40 Используя приготовленные выше сегменты проводят реакции соединения, катализируемые Т4 лигазой, как описано ниже: 1) Соединяют 5 -нефосфорилированный сегмент 1 с 5 -фосфорилированным сегмен- 50 том 2 в присутствии 5 -фосфорилированного сегмента 9, используя Т4 лигазу, для образования дуплекса 1 ДНК (Броун с сотр., 1979, Методы в Энзимологии 68:109-151). Дуплекс выделяют с помощью препаратив- 55 ного гель-электрофореза на 15 -ном полиакриламиде. 2) Соединяют 5 -фосфорилированный сегмент 3 с 5 -фосфорилированным сегмеитом 4 в присутствии 5 -фосфорилированного 3с сслттсссттлтсслссстттттслсллссстлтсстссс 3 †"""0" ° ° s э ° ° 1 I I с ;тлл .:СсллтлсстсссллллйстсттссслтАсслссс 3 сегмента 11, используя Т4 лигазу, для образования дуплекса 2 ДНК, который очищают с помощью электрофореза на 15%-ном полиакриламидном геле, 3) Соединяют 5 -фосфорилированный сегмент 5 с Б -фосфорилированным сегментом 6 в присутствии 5 -фосфорилированных сегментов 12 и 13, используя Т4 лигазу, для образования дуплекса 3 ДНК, который очищают электрофорезом на 15%-ном полиакриламидном геле. 4) Соединяют 5 -фосфор)ллированный сегмент 7 с 5 -фосфорилированным сегментом 8 в присутствии 5 -фосфорилированного сегмента 14 и 5 -нефосфорилированного сегмента 15, используя Т4 лигазу, для образования дуплекса 4 Д1-!К, которь)й очищают электрофорезом на 15%-ном полиакриламидном геле. 5) Соединяют вместе дуплексы ДН К 2, 3 и 4 с помощью Т4 лигазы для образования дуплекса ДНК 5, который очищают электрофорезом на 15%-ном полиакриламидном геле. G) Прибавляют 5 -фосфорилированный сегмент 10 и дуплекс 5 ДНК в присутствии Т4 лигазь. к дуплексу 1 ДНК. Полученный в результате дуплекс ДНК (110 на фиг.5) очищают на 10%-ном полиакриламидном геле с помощью электрофо реза. Этот дуплекс ДН К затем энзиматически фосфорилируют, используя Т4 полинуклеотид киназу и ( P/ÀÒP по следующей установленной процедуре. 5 Конструируют плазмиду экспрессии pNM702 с поиощь)о ферментного присоединения 0,1 пикомоля (0,4 мкг) Уба!-Вап)Н! фрамгента плазмиды pKEN021 (107 на фиг.5). 0,025 пикомолей синтетического фрагмента ДНК(110 на фиг.5) и 0,3 пикомолей (0,08 мкг) фрагмента 538 пар оснований (из 109 на фиг.5) в 24 мкл лигационного буфера, используя 1,5 ед. Т4 ДНК лигазы. Поо сле инкубирования в течение 16 ч при 4 С смесь используют для трансформации в Е.coli А211, кa!: описано ранее, Отбирают трансформанты на агаровых пластинах, содержащих 100))кгlмл ампициллина, и куль-. тивируют обычным образом как предпочтительный источник желаемой плазмиды экспрессии. Определяют экспрессию человеческого гормона роста по стандартной радиоиммунологической процедуре (Твомей с сотр„ 1974 Clir) Chem 20;389-391) и определяют наличие по крайней мере 2 миллионов молекул на клетку. Д. Конструирование плазмиды pNM789. Испол ьз уют плазм иду P NM702 (111 на фиг.б), плазмиду экспрессии гормона чело1838412 22 веческого роста, в качестве исходного материала для конструирования плазмиды э!1спрессии Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Àsð-AspАз р-Lys-б ГР, Используют плазмиду рВР348 (112 на фиг.б), описанную Миллером с сотр., 1980, J .. В lol. Chem, 255:7521-7524. в качестве истачника двух фрагментов ДНК, содержащих кодирующую последовательность участка гена бычьего гормона роста. Плазмида содержит 831 пар оснований последовательности, кодирующей бычий гормон роста, .к онированной в Pstl сайт рестрикции р8322. В качестве альтернативы методу, ог1исацному Миллером с сотр., 1980, последс»вательность бычьего гормона роста может быть сконструирована синтетически (Итакура с сотр., 1977, и Кри с сотр., 1978) или же может быть также получена из инфорМационной РНК, выделенной из бычьих 20 гипофиэов по уже рутинным процедурам, описанным Гудманом с сотр., 1979, Последовательности, кодирующие человеческий гормон роста. и бычий гормон роста, являются очень похожими и показывают много гомологии. Особенно полезны. ми при конструировании плазмиды экспрессии бычьего гормона роста являют-. ся.фрагменты, генерированные при переваривании рестрикционным ферментом Pvull. 30 Размер продуцированных фрагментов составляет 497 пар оснований для человеческого гормона роста и 494 пар оснований для бычьего гормона роста, а соответствующие сайты рестрикции встречаются в одина- 35 ковых рамках считывания в обеих последа вател ьностях. Частично переваривают 10 мкг pNM702 (111 на фиг.б) с помощью 1 ед, Pvull в 200 мкл буфера Pvull рестрикции (60 мМ NaCI, 6 40 мМ.Трис. HCI, рН 7,5, 6 мМ М Clz, 6 MM Р-меркаптоэтанола) в течение 40 мин при 37 С. После этого реакцию останавливают нагреванием при 65 С в течение 10 мин, ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой и "5 отделяют фрагменты на 1%-ном агарозном геле. Линейный фрагмент ДНК (113 на фиг.б), размер которого соответствует ДНК с недостающим фрагментом Pvull 497 пар, оснований (серия опытов несколько быст- 50 рее, чем единственный разрез плазмиды), „был вырезан очищен и использован при конструировании промежуточной плазмиды (114 на фиг.б). Готовят фрагмент 494 пар оснований Pvull плазмиды рВР348 путем переваривания 10 мкг плазмиды в 200 мкл Pvull буфера, содержащего 10 ед. Pvull в течение 1 ч при 37 С. Выделяют фрагменты на 6%-ном полиакриламиднол» геле и визуализируют и очищают обычным способом целевой фрагмент 494 пар оснований (из 112 на фиг.б). Конструируют промежуточную плазмиду(114 на фиг,б) при взаимодействии 0,2 мкг плазмиды pNM702 Pvull фрагмента с 0,05 мкг фрагмента 494 пары оснований в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 2 ед, Т4 ДНК лигаэы, в течение 16 ч при 4 С, После трансформации и отбора трансформантов на устойчивость к ампициллину плазмиды подвергают обычному анализу на наличие и четкую ориентацию Pvull фрагмента 494 пар оснований. Плазмиды с фрагментом Pvull 494 пары оснований и фрагментом Xbal-Smal 440 пар оснований отбирают для использования при дальнейшем конструировании. Переварива!от 10 мкг промежуточной плазмиды (114 на фиг.7) с помощью 1 ед, Pvu1I в 200 мкл Pvull буфера в течение 5 мин при 37 С, После нагревания при 65 С.в течение 10 мин смесь наносят на 1%-ный агарозный гель и извлекают линейную ДНК, имеющую только один Pvull разрез на молекулу. очищают ее. Этот извлеченный материал (приблизительно 3 мкг) полностью переваривают 5 ед. Xbal и обрабатывают щелочной фосфатазой. Фрагменты наносят на 1%-ный агарозный гель и извлекают самый большой фрагмент "потерявший фрагмент 109 пар оснований между Xbal u первым сайтом Pvuil у человеческого и бычьего гормона роста по традиционной методике (115 на фиг.7). Последовательность ДНК для первых 23 аминокислот (69 пар оснований) бычьего гормона роста до первого Pvull сайта содержит два. Hpall сайта рестрикции, первый из которых содержит 23 пары оснований от первого нуклеотида кодирующей последовательности, Фрагмент 63 пары оснований (116 нэ фиг.7) был синтезирован фосфоротриэфирным методом, Этот фрагмент соответствует последовательности 19 пар оснований от Xbal сайта в сайте Ipp рибосомного связывания через ATG транслируемый старт-сигнал, после кодирующей последовательности для Phe-Pro- еы-Asp- . Asp Asp-Asp-Lys (24 пары оснований) и 20 нуклеотидов кодирующей последовательности бычьего гормона роста {от Ре до первого Hpall сайта). Фрагмент имеет следующую последовательность: ХЬа I 5 CTAGAGGGTATTAATAATGTT! ! ! ! ! ! I 1 ! ,3 ТСССАТААТТАТТАСААСССЛТТССЛТСАТСАТСЛТЛЛС! ! ! ! ! ! ! ! 1 ! ! GGGTAACCTACTACTACTATTC1тСССАСССАтСтСCTTGTC 3 и 11 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ЛЛСССТСССТЛСАССАЛСЛССС5! 15 5 При получении фрагмента 63 пары оснований готовят следующие девять сегментов; 1) CTAGAGGGTAT 2)TAATAATGTTCC 3) САТТ66АТ6ЛТ 10 4) GATGATAAGTTCC 5) CAG CCATGTCCTTGTC 6) АТ666ААСАТТАЧТААТАСССТ 7) ТТАТСАТСАТСАТССА 25 8) ATGGCTGGGAAC 15 9) CGGACAAGGAC Используя приготовленные выше сегменты, осуществляют реакции каталитического связывания Т4 лигазой, как описано выше: 20 а) соединяют 5 -нефосфорилированный сегмент 1 с 5 -фосфорилированным сегментом 2 в присутствии 5 -фосфорилированноr0 сегмента 6 с использованием Т4 лигазы для образования дуплекса 1 ДНК, который 25 очищают электрофорезом íà 15%-ном полиакриламидном геле; б) соединяют 5 -фосфорилированные " сегменты 3, 4 и 5 в присутствии 5 -фосфорилированных сегментов 7 и 8 и 5 -нефосфори- 30 лированного сегмента 9 с использованием Т4 лигазы для образования дуплекса 2 ДНК, . который очищают электрофорезом на 15%ном полиакриламидном геле; в) соединяют затем дуплексы 1 и 2 с 35 помощью Т4 лигазы для образования дуплекса ДНК (116 на фиг.7), который очищают электрофорезом на 15%-ном полиакрила- мидном геле. Этот дуплекс ДНК затем ферме н гати вн о фосфорилируют испол ьзуя Т4 40 полинуклеотид киназу и (у- Р/АТР в соотз2 ветствии с установленной процедурой, Фрагмент ДН К 46 пар оснований, который простирается от вышеуказанного Hpall сайта до Pvull сайта, может быть или скон- 45 струирован синтетически, или получен из первоначальной рВР348 плазмиды. Следовательно, переваривают 0,01 мкг плазмиды рВP348 в 400 мкл Pvuli буфера с 50 единицами Pvul в течение 2 ч при 37 С. После 50 экстракции фенолом и осаждения этанолом растворяют ДНК в 400 мкл Ры! буфера (50 мМ NaCI, 6 MM Трис, НО, рН 74, 6 мМ MgCI2, 6 мМ j3-меркаптоэтанола) с 50 ед. pstI втечение2ч при37 С, ФрагментыДНК 55 наносят на 6%-HblA полиакриламидный гель и извлекают фрагмент 135 пар оснований, содержащий желаемую последовательность 46 пар оснований, очищают его w стандартным методикам, Одну треть извлеченной ДНК (эквивалентно 33 мкг) подвергают ограниченному переваривани.о 1 ед. Hpall рестрикционного фермента в 100 мкл Hpall буфера (20 мМ Трис. HCI, рН 7,4, 7 мМ MgCI2, 6 мМ,,- P MepKallT03TBHona) в течение 40 мин при 37 С. После нагревания при 65 С в течение 10 мин фрагменты ДНК наносят на 5%-ный акриламидный гель (акриламид:бис соотношение 19:1) вместе с маркером соответствующего размера. >Келаемый фрагмент 46 пар оснований, полученный при частичном переваривании Hpall фрагмента в 135 пар оснований (из 112 на фиг.7), очищают по стандартным методикам. Инкубируют 0,2 мкг Xbal-Pvull фрагмент плазмидного вектора {115 на фиг.7), 3,2 пикомоля синтетического фрагмента 63 пары оснований (116 на фиг.7), и 0,5 пикомоля фрагмента 46 пар оснований (из 112 на фиг.7), в 10 мкл лигационного буфера с 2 ед. Т4 ДНК лигазы в течение 16 ч при 4 С. Лигационную смесь использ>ют для трансформации Е,coll JA221, и отбирают полученные трансформанты, которые содержат, следовательно, желаемую плазмиду pNM789, на устойчивость к ампициллину. Идентичность плазмиды pNM789 {117 на фиг.7) была подтвер>кдена традиционным скринингом в присутствии обоих фрагментов 494 лары оснований Vvull и 109 пар оснований XbalPvVll, Д, Окончательное конструирование плазмиды pNM789B. Для плазмиды pNM789 (117 на фиг.8) требуется изменение одного аминокислотного кодона для полного превращения в бычий гормон роста. Это осуц.,ествляется при удалении фрагмента 28 пар оснований от Pvull до. HamHI a рИМ789 и замене синтетическим двунитевым фрагментом, имеющим следу!ощую последовательность (118 на фиг,8); gI 31 С Тб-7б.! 77 С7 ДГ ! l 8 АС4С С бал ОЛ тССт4С, Переваривают 10 мкг pNM789 1 ед. Рчь1! в 200 мкл Pvull буфера в течение 5 мин пр!и 37 C, После нагрева при 65 С в течение 10 мин смесь разбавляют в 300 мкл добавлением ВаглН! буфера, переваривают полностью 10 ед. HamHI в течение 1 ч при 37 С, обрабатывают 5 ед, щелочной фосфатаэы и инкубируют 1 ч при 65 С, Выделяют фрагменты ДНК на 1%-ном агарозном геле и традиционным образом очищают фрагмент ДНК (119 на фиг.8), примерно соответствующий по размеру плазмиде pNM789 с един1838412 26 ственным разрезом. Лигируют 0,2 мкг этого фрагмента 5 пикомолями синтетического фрагмента с использованием 2 ед. Т4 лигаэы в 20 мкл лигазного буфера, Лигацию проводят в течение ночи при 4 С. После 5 трансформации выделяют несколько плазмйд и скринируют их на соответствующие фрагменты Pvull (494 пары оснований) и Х а!-BamHI (628 пар оснований). Плазмиды, содержащие указанные выше фрагменты, 10 составляют желаемую плаэмиду pNM789B (120 на фиг.8). Пример 2. Конструирование плаэми ды pCZ101 и E.coll К12 RV308/pCZ101. А. Выделение плазмиды ð1Ì-1 -АЗ, 15 Культивируют бактерии Е.соИ К12/р1М-. 1 ;АЗ (ЯВИ ¹ В-15733) в ТД-бульоне (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% хлористого натрия, рН 7,4) с 50 мкг/мл канамицина при 25 С в соответствии с тра- 20 диционными микробиологическими процедурами. Затем культуру разбавляют в соотношении 1:10 свежим бульоном и после 3 ) инкубации при 37 С около 0,5 мл культу. ры переносят в трубку Эппендарфа 1 5 мл и 25 центрифугируют примерно 15 с. Если нет других указаний, все манипуляции проводятся при комнатной температуре. Полученный в .результате надасадочный слой осторожно удаляют аспиратором с тонким 30 наконечникам и повторно суспендируют клеточный шарик примерно 0 100 мкл свежеприготовленного раствора лизацима {2 мг/мл), который содержит 2 мгlмл лизоцима., 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА {диамино- 35 те1 раацетата) и 25 мМ Трис. HCI, рН 8. Прибавляют примерно 200 мкл щелочного раствора SDS (додецилсульфата натрия) (0,2 н. КаОН, 1% SDS), трубку осторожно переворачивают и затем хранят при 0"С до тех 40 пор, пока не закончится лизис (примерно 5 мин). Затем цаибавляют примерно 150 мкл ЗМ ацетата натрия и содержимое трубки осторожно перемешивают переварачиванием в течение нескольких секунд. 45 Трубку выдерживают при 0 С па крайней мере 60 мин, а затем центрифугируют 15 мин для получения почти прозрачного надосадочного слоя. Надосадочный слой. переносят ва вторую трубку для центрифу- 50 гирования, в которую добавляют 3 объема .холодного 100%-ного эта нала. Затем трубку на 5 мин памегцают на сухой лед-этанол, полученный в результате осадок собира от центрифугираванием (5 мин), а надасадач- 55 ный слой удаляют отсасыванием. Собранный шарик растворяют в 100 мкл TE (10 мМ Трис HCI, рН 8,0, 1 MM ЭДТА), он представляет собой желаемую плазмиду рТМ-1 -АЗ ДНК. Б. Xbal-BamHI переваривание плазмиды pNM789B и генерация фрагмента примерно 0,6 кЬ Xbal-BamHI фрагмента. Инкубируют примерно 5 мкг плазмиды pNM789B ДНК в 50 мкл солевого буфера с 10 ед, каждого из рестрикционных ферментов BamHI u Xbal при 37 C в течение 1 ч. После добавления 5 мкл ЗМ ацетата натрия при рН 7,0 осаждают ДНК добавлением 2 объемов 100%-ного этанола. Целевой перевар ДНК растворяют в 100 мкл TE буфера и хранят при 0 С для дальнейшего использования. Солевой буфер обычно следующего состава: 100 мМ NaCI, 20 мМ Трис. HCI, рН 8,0. 10 мМ MgCI2, 5 мМ Р-меркаптоэтанола. В. Xbal-BamHI переваривание плазмиды р1М-1 -AÇ. Желаемое переваривание осуществляют по существу в соответствии с методикой примера 2,В, с тем исключением, что используют плазмиду р1М-1 -АЗ вместо плазмиды pNM789B, Растворяют целевую ДНК примерно в 100 мкл TE буфера и хранят при 0оС для дальнейшего использования. Г, Лигиравание и трансформация. Инкубируют примерно 1 мкг перевара плазмиды рТМ-1 -AÇ, 1 мкг перевара плазмиды pNM789B Xbal-BamHI, 40 мкг воды, 5 мкл (5 MM) ЛТР, 5 мкл лигацианной смеси и 5 ед. Т4 ДНК лигазы при 20 С 0 течение примерно 2 ч, Лигационная смесь может быть приготовлена в следующем составе; 500 MM Tpuc. H CI, рН 7,8, 200 мМ дитиотрейтола, 100 мМ MgClz. После инкубирования в течение 2 мин при 65 С и последующего охлаждения на льду полученную лига цио иную смесь используют для трансформации по существу в соответствии. с методикой трансформации Венсинка, 1974, СеИ 3:315, Е.coll К12 ВЧЗ08 на ТД пластинах (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% хлористого натрия, 1,5% агара, рН 7,4), содержащих 50 мкг/мл канамицина. Бактериальный штамм E.coll К12 Ю/308 был депонирован и является частью постоянно хранящейся коллекции культур Северной региональной исследовательской лаборатории, Пеория, Иллинойс, из которой он является доступным для публики под регистрационным номером NRRI=Â-15624. Некоторые из полученных в результате трансформантов, как показано электрафорезом на агарозном геле {Маниатис с сатр. 1982) и с помощью других тестов, содержат только целевую плазмиду примерно 10,8 kb. Такой трансформант здесь обозначен как E.coli К12 RV308/pVC101, ега отбирают. помещают на ТД агаровые пластины, содержа27 1838412 30 5 СТЛСЛСССТЛТТААТА ATG ТТТ CCA ССС ATG GCT CTA TCT GGT CTG ТТТ GCC АЛС GCI GIGCT 3 ° \111I ° GAC AAA CGG TTG CGA С. 5 ?G щие соответствующие антибиотики, а затем культивируют, используя традиционные микробиологические методики, Полученные в результате клетки используют для выделения плаэмиды pCZ101 по существу в соответствии с процедурой примера 2,И, Пример 3, Конструирование плазмиды рС21920 и Е,соП К12 RV308/pCZ1920. А. Конструирование фрагмента BamHIXbal около 10,2 kb плазмиды pCZ1920, Целевой фрагмент был сконструирован по существу в соответствии с методикой примера 2,Б, с тем исключением, что использовали плазмиду pCZ101, а не плазмиду pNM789B, Целевые рестрикционные фрагменты BamHI-Xbal примерно 10,2 kb традиционным образом отделяют и выделяют электрофореэом на агарозном геле (Маниатис с сотр„1982), а затем растворяют примерно в 100 мкл ТЕ-буфера и хранят при 0 С для дальнейшего использования. Б, Конструирование фрагмента BamHIHgiAI примерно 0,6 kb плазмиды pCZ101. .Целевой фрагмент был сконструирован по существу в соответствии с методикой примера 2,5, с тем исключением, что были использованы плазмиды pCZ101 и рестрикционный фермент IgiAI вместо плазмиды pNM789B и рестрикционного фермента ХЬаl Целевые фраfMåèты рестрикции ЬаглН1-HgiAI примерно 0,6 kb были традиционным образом отделены и выделены электрофорезом на агарозном геле (Маниа- тис с сотр. 1982), а затем растворены в примерно 100 мкл TE-буфера и хранились при 0 С для дальнейшего использования. В. Конструирование линкерной последовательности ДНК. I I 11 II I ° 1 I lit 3 TCCCAT dlITAT ТЛС AAA GGI CGG ТАС CGA GAT A A ССЛ Целевая линкерная последовательность была синтеэирована удобным образом пи модифицированной фосфотриэфирной методике по существу в соответствии с методикой Итакура с сотр, 1977 и Кри с сото, 1789. Вышеупомянутый способ синтеза также специально иллюстрирован в примере 1, Г. Лигирование и трансформация. Лигируют примерно 20 пикомолей линкера ДНК примера ЗВ, 1 мкг фрагмента BamHI-HgiAl примерно 0,6 kb плазмиды pCZ101, а полученную в результате плазмиду используют для трансформации;Е.coll К12 RV308 по существу в соответствии с методикой примера 2Г. Некоторые иэ полученных в результате трансформантов, как удобно показано электрофореэом на агарозном геле (Маниатис с сотр., 1982) и другими тестами, содержат только целевую плазмиду примерно 10,8 kb. Такие трансформанты, обозначенные здесь как Е.coll К12 RV308/pCZ1920, отбирают, наносят на пластины с ТД-агаром, содержащие соответствующие антибиотики, а затем культивируют, используя традиционные микробиологические методики, Полученные в результате клетки показывают ппи SDS —. гель-электрофореза, RIA и других тестах экспрессию вышеупомянутого MET-LYS-CLYASPN-SER-МЕТ-ALA-бГР производного на высоких уровнях. Поскольку плазмида pCZ1920 содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируеглого роста, максимальная экспрессия желаемого продукта производного бГР происходит при кульгивировании при температурах около 37 С, Пример 4, Конструирование плазмиды pJRI и Е,coti К12 RV308/ðJRI. Получают желаемые конструкции по существу в соответствии с методикой примера 3, с тем исключением, что линкерная последовательность примера 3,В была заменена на линкерную последовательность ДНК: 5 CIAGAGGGTAITAATA AIG АРЛ С С РАТ TCT AIG GCC TIC CCA GCC 3 TCCCATAATTAT TAC TIT CCC ТТЛ АСА ТР.<: CGG AA" C i CGG АТС ТСС ТТС ТСС ССС СТС ТТТ ССС АР.С ССТ СТССТ 3 ТЛС AGG, AAC AGG CCG GAC ЛАЛ CGG ТТС CGA С I Определенная выше линкерная последовательность может быть сконструирована lо существу в соотве1ствии с традиционной глетодикой Итакура с сотр„1977 и Кри с сотр. 1978. Бышеупоглянутый способ синтеза также специально проиллюстоирован в примере 1, Целевые трансформанты, обозначенные здесь как Е.coll К12 RV308/pJRI, поглещают на ТД агаровые пластины, содержащие соответствующие антибиотики, а затем культивируют обычным образом для последующего продуцирования и выделения плазмиды pJRI. Трансформанты также были показаны SDS-гель-электрофорезом, RIA и другими тестами, для экспрессии вышеопределенного производного МЕТ-PHE-РРО-ALA-VET-ALA R бычьег го гормона роста. Поскольку плазмида pJRI содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальная экспрессия целевого продукта производного бГР происходит при культивировании при температуре около 37 C. П р и M е р 5. Конструирование плазмиды рН17 Л4 Л1. 1838412 Частичная схема конструирования плазмиды РН17 Л4Л1 представлена на фиг.15, А. Конструирование плазмиды pBRHtrp. Плазмида pGMI несет Е,coli триптофановый оперон, содержащий делецию ALE1413 (Миоззари с сотр, 1798, Bacteriology, 1457-1466) и, следовательно, экспрессирует плавленный протеин, состоящий из первых 6 аминокислот trp лидера и приблизительно последней трети trp Е полипептида (здесь далее упоминается вместе «aw LE ), а также trp О полипептид целиком, все под контролем системы trp промотороператор. Е.coli К12 W3110-tna 2trpМ02/pGMI был депонирован в Американской коллекции типов культур (АТСС N 31622), à pGMI может быть удобно удалена из штамма для использования в описанных ниже процедурах, Примерно 20 мкг плазмиды переваривают рестрикционным ферментом Pvuli, который расщепляет плазмиду в пяти сайтах, Фрагменты генов затем объединяют EcoRI лин керами (состоящими из самокомплементарного олигонуклеотида последовательности: pCATGAATTCATG). обеспечивая EcoRI сайт расщепления для последующего клонирования в плазмиду, содержащую EcoRI сайт, Обрабатывают 20 мкг фрагментов ДНК, полученных из pGMI, 10 ед, Т4 ДНК лигазы в присутствии 200 пикомолей 5 -фосфорилированного синтетического йуклеотида pCATGAATTCATG и в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера (20 мМ Трис, рН 7,6, 0,5 мМ АТР, 10 мМ MgClz, 5 мМ дитиотрейтола) при 4 С в течение ночи. Затем раствор нагревают в течение 10 мин при 70 С для остановки лигации, Линкеры расщепляют перевариванием EcoRI и разделяют фрагменты, имеющие теперь EcoRI концы, используя электрофорез на 5 / -ном полиакриламидном геле (ЭПАГ). Выделяют три самых больших фрагмента из геля, сначала окрашивая этидинийбромидом, а затем локализуя фрагменты в ультрафиолетовом свете и вырезая из геля интересующие участки, Каждый фрагмент геля с 300 мкл 0,1х ГЕВ помещают в ванну для диализа и подвергают электрофорезу при 100 в в течение 1 ч в 0,1хТВЕ буфере „(TBE буфер содержит: 10,8 г Трис основания, 5,5 г борной кислоты, 0,09 r Nag ЭДТА в I л воды). Собирают водный раствор из диализной ванны, экстрагируют фенолом, экстрагируют хлороформом, и делают его 0,2 М по отношению к хлористому натрию. Затем извлекают ДНК из воды после осаждения этанолом. Фра менты, содержащие trp промотор!оператор с EcoRi липкими концами, были дентифицированы путем вставки чувствительной к тетрациклину плазмиды, которая при вставке промотор/оператор становится устойчивой к тетрациклину. Все операции выделения фрагмента ДНК, описанные здесь и далее в этом примере, осуществляются с использованием ЭПАГ с последующей электроэлюцией по описанному выше способу. Б, Конструирование плазмиды pBRH тгр, экспрессирующей устойчивость к тетрациклину под контролем trp промотора/оператора, и идентификация и амплификация фрагмента ДНК содержащего trp промотор/оператор, выделенного в "А" выше. Плазмида pBRH1 (Родригес с сотр. 1979, Исследование нуклеиновых кислот 6, 3267 — 3287 и АТСС М 37070) экспрессирует устойчивость к ампициллину и содержит ген устойчивости к тетрациклину, но не будучи ассоциированной с промотором, не экспрессирует такую устойчивость. Клетки, содержащие плазмиду, следовательно, являются чувствительными к тетрациклину, При введении системы промотор/операт ор в сайт EcoRi плазмида будет экспрессировать устойчивость к тетрациклину. Плазмиду pBRHi переваривают EcoRI. Фермент удаляют экстракцией фенолом с последующей экстракцией хлороформом, затем ДНК повторно суспендируют в воде после осаждения этанолом, Полученную в результате ДЧК в отдельных реакционных смесях объединяют с каждым из трех фрагментов ДНК, полученных в примере 5,А, и лигируют Т4 ДНК лигазой, как описано выше. Имеющуюся ДНК в реакционной смеси используют для трансформации компетентного Е.соИ К12 293/МВВ В-15625/ по стандартным методикам (Хершфилдс сотр. 1974, Ргос, Nat. Acad, Sci. USA 71:3455-3459).затем бактерии помещают íà LB-пластины (Маниатис с сотр.„1982), содержащие 20 мкг/мл ампициллина и 5 мкг/мл тетрациклина. Отбирают несколько устойчивых к тетрациклину колоний и выделяют плазмиду ДНК, обозначенную pBRH trp. Наличие желаемого фрагмента подтверждается ферментным рестрикционным анализом. Плазмида pBRHI rp экспрессирует ф-лактамазу, прида:ощую устойчивость к ампициллину, и содержит фрагмент ДНК, который включает trp-промотор/оператор, Фрагмент ДНК также кодирует первый протеин (обозначенный LE ), состоящий из расплава первых шести аминокислот trp лидера и приблизительно последнюю треть trpE полипептида, второй протеин (обозначенный Д ), соотвегствующий приблизительно первой половине trp Д полипептида, и третий 1838412 протеин, кодируемый геном устойчивости к тетра ци кл и ну. В. Конструирование плазмиды pSOM7 h2. Плазмиду pBRH trp переваривают рестрикционным ферментом ECORI и полученный в результате фрагмент, выделенный ЭПАГ и электроэлюцией, обьединяют с плазмидой pSOM11, переваренной EcoRI (Итакура с сотр„ 1977, 198:1056, патент США ¹ 4 366 246, патент Великобритании N 2 007 676А). Смесь лигируют Т4 ДНК лигазой и полученную в результате ДНКтрансформируют в E.colt E12 294, как описано ранее. Трансформированные бактерии отбирают на пластинах, содержащих ампициллин, а полученные в результате устойчивые к ампициллину колонии подвергают скринингу гибридизацией колоний (Грюнштейн с сотр, 1975 Procc. Nat. Acad. Sci. USA 72:3951-3965). Фраплент, содержащий trp промотор-оператор, выделенный из pBRH trp, а затеял радиоактивно меченый Р, используют в качестве зонда в описанной выше процедуре. Было показано, что некоторые колонии являются положительными к гибридизации колоний и были отобраны, Изолируют плазмиду ДНК и определяют ориентацию вставленных фрагментов с помощью рестрикционного анализа, используя в двойном переваре ферменты Bglll и BamHI, Колонии, содержащие желаемую плазмиду с фрагментом trp промотор/оператор в точной ориентации, были выращены на LB среде, содержащей 10 мкг/мл ампициллина. Желаемую плазмиду обозначали pSOM7 Ь2 и используют для последующих конструирований, описанных выше. Г. Конструирование плазмиды ptrp24. 1. Конструирование фрагмента гена, koдирующего дистальные области LE полипептида с сайтами рестрикции Bgtll u BamHI соответственно на 5 и 3 концах Ко ди рующего тяжа. Плазмиду pSOM7 Ь2 переваривают Hind Ill.ïoñëå переваривания лямбда экзонуклеазой (5 до 3 экзонуклеаза) в условиях, выбранных таким образом, чтобы переварить выше сайта рестрикции Bglll в LE, кодирующем участке. Растворяют примерно 20 мкг Hind И! переваренной pSOM7 h2 в буфере(20 мМ глицинового буфера, рН 9,6, 1 мМ MgClz, 1 м1Л /3-меркаптоэтанола), Полученную смесь обрабатывают 5 ед. лямбда экзонуклеаэы втечение 60 лин при комнатной температуре, Затем полученную.реакционную смесь экстрагируют фенолом, экстрагируют хлороформом и осаждают этанолом. N-терминал и 5 -концы были сконструированы с однотяжевым липким концом для облегчения присоединения к плазмидам, расщепленным EcoRI и В агп Н . Как может быть легко оценено, Bgl tl ñàéò в центре гена Для создания EcoR I остатка на дистальном конце фрагмента LE гена синтезируют преймер pCCTGTGCATGAT по усовершенствованному фосфотриэфирному методу 5 (Кри с сотр„1978) и гибридизируют на однотяжевом конце фрагмента LF гена, г1олученного при переваре лямбда экзонуклеаэой. Гибридизацию осуществляют при растворении 20 мкг обработанного лямбда экзонуклеазой продукта перевара Hind ill плазмиды pS0M7 h2 в 20 мкл воды и обьединения с 6 мкл раствора, содержащего приблизительно 80 пикомолей 5 -фосфорилированного олигонуклеотида, описанного выше, Синте15 тический фрагмент гибридизуют к 3 -концу LE кодирующей последовательности, à оставшуюся часть 1Е фрагмента наполняют полимеразой Клейноу 1, используя dATP, dTTP, dGTP и dCTP, Полимераза Клейноу 1 представляет собой фрагмент, полученный протеолитическим расщеплением ДНК полимеразы 1, Он содержит 5 — 3 полимеризующую активность, 3 — 5 экзонуклеотическую активность, но не 5 —. 3 25 экзонуклеотическую активность родительского фер лента (Кориберг, 1974, Чl.Н, Freeman and Со, 98), Реакционную смесь нагревают до 50 С и медленно охлажда от, до 10 С, после чего 30 прибавляют 4 глкл фермента Клейноу, После 15 мин инкубирования при комнатной те лпературе, последующего инкубирования в течение 30 мин при 37 прекращают реакцию добавлением 5 мкл 0,25 молярной ЭД35 ТА. Реакционную смесь зкстрагируют фенолом, экстрагируют хлопофорглом, .осаждают этанолом. ДНК последовательно расщепляют рестрикционным ферментом Bgl И и разделяют фрагменть C помошь.о 40 ЭПАГ, Ауторадиогоамма получена для выделенного из геля Р меченого фрагмента ожидаемой длины приблизительно 470 пар оснований, его извлекают электроэл1оцией, Как отмечалось, это фрагмент .Е (d) имеет терминал Bgl ll и тупой конец, совпадающий с началом праймера, 2. Конструирование плазмиды pTh й1. Конструируют плазмиду р П1 а1 путем вставки синтезированного гена для тимозина альфа 1 в плаз лиду pHR322, Синтез ДНК, кодирующей типозин альфа 1, включает синтез и последующую лигацию 16 нуклеотидов(Т1до Tte), что указано направляющей стрелкой на фиг.11. Вставляют met ATG в 1838412 34 способствует анализу рекомбинантных плазмид. Олигодеоксирибонуклеотиды от Т1 по Т16 были синтезировэны по модифицированному фосфотриэфирному методу Итакура с сотр., 1977, и Кри с сотр„ 1978. Различные олигодеоксирибонуклеотиды показаны в табл.1, Приведенный выше синтез является типичным при следовании процедуре для фрагмента Т1ь, как суммировано на фиг,12. Различные нуклеотидные фрагменты, которые использованы при синтезе T ДМТ 4,4 -диметокситритил; Се, 2-цианоэтил; R, n-хлорфенил; Bz, бензоил; An, анизоил; iBu, изобутил; Ру, пиридин; АсОН, уксусная кислота, EtgN, триэтиламин. Деблокируют полностью защищенные тридеоксирибонуклеотиды 4 (85 мг, 0,05 моля) и 2 (180 мг, 0,1 ммоля) у 5 -гидроксилов путем обработки 2 j, BAS в смеси.хлороформ/метанол 7:3 по обьему (10 и 20 мл соответственно) в течение 10 мин при 0 С. Останавливают реакции добавлением насыщенного водного раствора бикарбоната аммония (2 мл), экстрагируют 25 мл хлороформа и промывают водой 2 раза по 10 мл. Органические слои сушат над сульфатом магния, концентрируют до малого объема (около 5.мл) и осаждают добавлением петролейного эфира (фракция 35 — 60 С). Бесцветные осадки собирают центрифугированием и сушат в эксикаторе в вакууме, получают 6 и 8 соответственно, каждый гомогенен при ТСХ на силикагеле (Мерк 60 F254, хлороформ/метанол, 9:1), Превращают тримеры 1 и 3 (270 мг, 0,15 ммоля, 145 мг, 0,075 ммоля) в.их фосфодиэфиры (5 и 7) путем обработки смесью триэт и л а м и н / и и р ид и н / в ода /1; 3; 1, обьем/обьем, 10 мл/ в течение 25 мин при комнатной температуре. Удаляют реагенты на роторном испэрителе и высушивают остатки при повторном испарении безводного пиридина (3 х 10 мл), Объединяют тример 8 (0,05 ммоля) и тример 7 с TP Те (50 мг, 0,15 ммоля) в 3 мл безводного пиридина, реакционную смесь оставляют в вакуул1е при комнатной температуре на 2 ч. Анализ TCX показывает, что 95% тримера 8 превраща- ется в гексамерный продукт (визуализировано при детекции ДМТ группы при обрызгивэнии 10 /-ной водной серной кислотой и нагревании при 60"С). Реакцию закаливают при добавлении 1 мл воды, оэстворитель выпаривают в вакууме. После удаления пиридина, испаряющегося совместно с толуолом, деблокируют гексамер в 5 положении с помощью 8 мл 27,,-ной BSA, как описано выше для тримеров 4 и 2. Продукт 10 очищают на колонке с силикагелем (Мерк 60 Н, 3,5 х 5 см) при элюировании хлороформом!метаноломом с градиентом от 98;2 до 95:5 10 по объему, Фракции, содержащие продукт 10.выпаривают досуха, Подобным образом тример 5 сочетают с 6 и очищают полностью защищенный продукт непосредственно на силикагеле. Это последнее соединение бы15 ло деолокировано с 3 -конца смесью триэтиламин/пиридин/вода, как описано ранее, для получения фрагмента 9. Наконец, сочетают гексамеры 9 и 10 в 2 мл безводного пиридина с TP Te (75 мг, 2р 0,225 ммоля) в качестве конденсирующего агента. По окончании реакции (4 ч при комнатной температуре) смесь выпаривают на роторном испарителе, остаток хроматографируют на силикагеле. Получают 160 мг продукта 11 при осаждении петролейным эфиром, который оказался гомогенным по данным TCX. Полностью деблокируют часть (20 мг) соединения 11 в 0,5 мл пиридина при обработке 7 мл концентрированной гидро30 окиси аммония (8 ч при 60 С) и последующей обработке в течение 15 мин 80;(,-ной уксусной кислотой при комнатной температуре. После выпаривания уксусной кислоты твердый остаток растворяют в 4 мл 4 /-ной 35 гидроокиси аммония и экстрагируют 3 х 2 мл этилового эфира, Водную фазу концентрируют до 1 — 2 мл и часть наносят íà HPLC для очистки 12, Объединяют фракции, соответствующие основному пику (примерно 2 Azs< 40 единицы) и концентрируют до примерно 5 мл. Обессоливают конечный продукт 12 на Вио-геле Р-2 (1,5 х 100 cM) при элюции 2 0 % - H bl M B O Q H bl i t 3 T B H O Jl O M, растворитель при пониженном давлении досуха и снова суспендируют в 20 мкл воды, получают раствор А 54 = 10. Подтверждают последовательность 12 двумерным анализом последовательности. Полный типозин альфа i ген был собран 50 иэ 16 синтетических олигонуклеотидов по описанным ранее методам, детализированным для соматостатина (Итакура с сотр., 1977), инсулина (Гоеддел с сотр., 1979) и гормона роста (Гоеддел с сотр„1979, 55 281:544). Олигонуклеотиды Tz no T>g в количеств по 10 мкг были количественно фосфорилированы (у"Р /-АТР/Нью Ингленд Нюклеар) а присутствии Т4 полинуклеотид кипазы (Гоеддел с сотр., 1979), чтобы получить определенные активности приблизи37 1838412 38 с ипептида и соматостатина под контролем три п тофа нового п ромотора/оператора. Е, Конструирование линейной ДНК, имеющей Pstl остаток на 3 -конце и Bgl II остаток на его 5 -конце, связывающем ген, определяющий устойчивость к тетрациклину, Плазмиду рВ322 Hind !!! переваривают и выступающие Hind III концы переваривают Sl нуклеазой. Переваривание Sl нуклеазой включает обработку 10 мкг Hind III переваренной рВ322 в 30 мкл Sl буфера(0,3 М МаС!, 1 мМ ZnCIz. 25 мМ ацетата натрия, рН 4,5) 300 ед. Sl нуклеаэы в течение 30 мин при 15 С. Прекращают реакцию добавлением 1 мкл 30 х 51 нуклеазного стоп-раствора (0,8 M трис основания. 50 мМ ЭДТА), Смесь зкстрагируют фенолом, экстрагируют хлороформом, осаждают этанолом, а затем переваривают EcoRI, как описано выше, Полученный в результате фрагмент выделяют с помощью ЭПАГ с последующей электрозлюцией, он имеет EcoRI ëèïêèé конец и тупой конец, у которого кодирующий тяж начинается с тимидинового нуклеотида. Slпереваренный Hind ill остаток, начинающийся с тимидина, может быть присоединен к переваренному Полимеразой Клейноу I Bgl II остатку, чтобы восстановить В9Г Ii сайт рестрикции при лигации, Следо вател ь но, плазм иду р$0М7 Л2,полученную в примере 5В, Bgl !! переваривают и полученные Bglll липкие концы делают двутяжевыми обработкой полимеразой Клейноу 1, используя все четыре деоксинуклеотидных трифосфата. EcoRI расщепление полученного продукта с последующим ЭПАГ и злектроэлюцией маленького фрагмента дает линейную часть ДНК, содержащую триптофановый промотор/оператор и кодоны LE "проксимальной" последовательности выше Bgl II сайта ("LE (ð)"). Продукт имеет EcoRI конец и тупой конец, полученный в результате заполнения в Bgl lI сайте. Однако Bgl il сайт восстанавливается лигацией тупого конца к тупому концу указанного выше Sl переваренного Hind lil фрагмента. Итак, оба фрагмента лигируют в присутствии Т4 ДНК лигазы для образования рециркулярированной плазмиды рНКУ10, которая размножается при транс. формации в компетентные клетки Е.coll К12 294. Отбирают клетки, устойчивые к тетрациклину, несущие рекомбинантную плазмиду рНКУ10 и экстрагируют ДНК плазмиды. Переваривание Bgl il u Pst t с последующим выделением с помощью ЭПАГ и электроэлюции большого фрагмента приводит к целевому линейному участку ДНК, имеющему Pst I u Bgi ii липкие концы. Этот фрагмент 50 ДНК, полученный таким обра ом из рНКУ10. содержит источник репликации, и, следовательно, является полезным в качестве компонента для конструирования плаэ5 миды рН17 h4 Ь1, у которой оба гена, кодирующих плавленный протеин trpLE, полипептида и устойчивость к тетрациклину, контролируются trp промотором/оператором. 10 Ж. Конструирование лИнейной ДНК, имеющей trp промотор-оператор. Плазмиду pSOM7 Ь2 h4, полученную в примере 5,Д, подвергают частичному EcoRI перевариванию с последующим Pst пере15 вариванием. Полученный в результате фрагмент, содержащий trp промотор/оператор, выделяют с помощью ЭПАГ с последующей электроэлюцией. Частичное Есой! переваривание необходимо для получения фраг20 мента, который расщепляется вблизи 5 -конца соматостатинового гена, но ve расщепляется у сайта EcqR!, имеющегося между геном устойчивости к ампициллину и trp промотором/оператором. Устойчивость к 25 ампициллину теряется при Р$1 i разрезе в гене устойчивости к ампициллину, она может быть восстановлена при лигации с готовым производным линейной ДНК рНКУ10, полученным в примере 5,Е, 30 Синтетические олигонуклеотиды для человеческого проинсулина Соединение Последовательность Н1 AATTCATGTT Н2 CGTCAATCAGCA 35 H3 CCTTTGTGGTTC Н4 TCACCTCGTTGA Н5 TTGACGAACATG Нб CAAAGGTGCTGA Н7 AGGTGAGAACCA Н8 AGCTTCAACG Â1 AGCTTTGTAC В2 CTTGTTTG CGGT ВЗ GAACGTGGTTTC В4 ТТСТАСАСТССТ 45 В5 AAGACTCGCC В6 AACAAGGTACAA В7 ACGTTCACCGCA В8 GTAGAAGAAACC В9 AGTCTTAGGAGT В10 GATCCGGCG Пример 6. Конструирование плазмиды рМ608 и Е.coll К12 RV308/pNM608. А. Конструирование EcoRI-Нра! фрагмента примерно 253 пары оснований плаз55 миды pH17h451. Инкубируют при 37 С в течение примерно 1 ч около 5 мкг ДНК плазмиды pH17h4 Л1, 10 мкл (10х) реакционного буфера, 80 мкл воды и 5 мкл (5 ед.) фермента рестрикции Hpai, Реакционный буфер (10Х) 39 1838412 40 для Hpal рестрикционнго фермента готовят следующего состава: 100 мМ Трис. HCI, рН 7, 100 мМ М9С!г, 60 мМ Р-меркаптоэтанола, 200 MM KCI. Реакцию прекращают инкубированием при 70 С в течение 5 мин. После 5 охлаждения смеси на льду прибавляют примерно 12 мкл 1 М Трис. HCI, рН 7,2, 7 мкл воды и 1 мкл (10 ед,) рестрикционного фермента EcoRI. Полученную в результате смесь инкубируют сначала при 37 С в тече- 10 ние 1 ч, а затем 5 мин при 70 С. После охлаждения на льду экстрагируют полученную в результате ДНК каждым из фенолом и хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), а затем осаждают этанолом. Целевой фрагмент 15 EcoRi-Hpal примерно 253 пары оснований отделяют электрофорезом на полиакриламидном геле, извлекают электроэлюцией, осаждают этанолом, затем растворяют при мерно в 10 мкл TE буфера и хранят при 0 С 20 для дальнейшего использования, Б. Конструирование Нра! Tagl фрагмента примерно 34 пары оснований плазмиды рН17 hn Л1. Инкубируют при 37 С в течение 1 ч при- 25 мерно 20 мкг ДНК плазмиды pH17 hA h1 в 32 мкл (5X) EcoRI реакционного буфера, 124 мкл воды и 4 мкл рестрикционного фермента EcoRI (20 ед.). Реакционный буфер (5Х) для EcoRI рестрикционного фермента гота- 30 вят следующего состава: 250 MM NaCI, 500 мМ Трис. HCI, рН 7,2, 25 мМ Mgcb, 30 мМ Р-меркаптоэтанола. Реакцию заканчивают инкубированием при 70 С в течение 5 мин, Полученный в результате EcoRI фрагмент 35 862 пары оснований выделяют электрофорезом на 6 -ном полиакриламидном геле с последующей электроэлюцией и осаждением этанолом. Затем фрагмент растворяют примерно в 100 мкл Hpal буфера, содержа- 40 щего l6 ед, Нра рестрикционного фермента. После 1,5 ч при 37 С прибавляют 7,5 ед. Tag I рестрикционного фермента, продолжают инкубирование еще 1,5 ч и полученные в результате фрагменты отделяют на 7,5 - 45 ном полиакриламидном геле. Извлекают целевой Hpal-Tagl фрагмент примерно 34 пары оснований электроэлюированием и осаждением этанолом, затем растворяют его в 5 мкл ТЕ буфера, 50 B. EcoRI-Clat переваривание плазмиды ðÂ322. Инкубируют при 37 С в течение 1 ч и римерно 5 мкг ДНК плазмиды рН322, 10 мкл Clat реакционной смеси, 77 5 мкл воды и 7,5 55 мкл (15 ед,) Clai рестрикционного фермента. Реакционную смесь (10Х) для С!а! рестрикционного фермента готовят следующего состава: 100 мМ Трис. HCI. рН 7,4, 100 мМ MgClz, 60 мМ P-меркаптоэтанола, Реакцию заканчивают инкубированием при 70 С в течение 5 мин. После охлаждения смеси на льду прибавляют примерно 12,5 мкл Трис. HCI рН 7,2. 6,25 мкл 1 М NaCI, 2,5 мкл 0,1 М MgCIz и 1 мкл (10 ед,) EcoRI рестрикционного фермента. Полученную в результате смесь инкубируют 1 ч при 37 С, а затем 5 мин при 70 С, После охлаждения на льду полученную в результате ДНК подвергают электрофорезу на 1 -ном агарозном геле. Большой фрагмент извлекают электроэлюцией и осаждением этанолом, затем растворяют примерно в 20 мкл ТЕ буфера и хранят при 0 С для дальнейшего использования, Г, Лигирование и трансформация. Лигируют примерно 0,2 мкг EcoRI-Hpat фрагмента примера 6,А, 0,5 мкг Hpal-Tagl фрагмента примера 6,В и 0,1 мкг EcoRI-Clat перевара примера 6,В и используют для трансформации Е.coli К12 RV308 по существу по методике, описанной в примере 2Г. Некоторые из полученных в результате трансформантов, как показано электрофорезом на агарозном геле (Маниатис с сотр., 1982) и другими тестами, содержат только желаемую плазмиду примерно 4,6 kb. Отбирают такие трансформанты, обозначенные как Е.coli К12 RV308/pNM608, помещают на пластины с ТД агаром, содержащим соответствующие антибиотики, l . затем культивируют, используя традиционные микробиологические методики. Плазмида pNM608 представляет собой и является предпочтительным источником EcoRI-Clat (Tagl) фрагмента примерно 287 kb плазмиды рН 17 Л4 Л1". Пример 7. Конструирование плазмиды pCZ112 и E.coli К12 КНЗ08/рС2112. А. EcoRI-Ctal переваривание плазмиды pNM608 и генерация EcoRI Tagl фрагмента примерно 0,288 kb (такого же как EcoRI-Tagl фрагмент 0,288 kb плазмиды рХ1764 h1). Инкубируют примерно 5 мкг ДНК плазмиды pNM608 в 50 мкл солевого буфера с 10 ед. каждого из EcoRI u Clat рестрикционных ферментов при 37 С в течение примерно 1 ч, Солевой буфер следующего состава: 50 мМ NaCI, 100 мМ Трис, HCI, рН 7,5, 6 мМ MgClg, 2 мМ Р-меркаптозтанола. После добавцения 5 мкл 3 M ацетата натрия, рН 7,0, осаждают ДНК 3 объемами 100 -ного этанола. Целевой перевар ДНК растворяют в 100 мкл ТЕ буфера и хранят при О С для дальнейшего использования, Б, Конструирование линкерной последовательности ДН К. 5 CGACC ATG GAT САТ AAG TTT CCG GCT АТС ТСТ СТО 3 TGG TAC CTA CTA TTC AAA GGC CGA :AÑ AGA GAC 20. TCC (ИС CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3 AGG ССС GAC ААА ССС TTG CGA С 5 1838412 Синтезируют желаемую линкерную последовательностьь модифицирован н ым фосфотриэфирным способом по существу в соответствии с Итакура с сотр., 1977 и Кри с сотр., 1978. Вышеупомянутый способ синте- 5 за также был специально проиллюстрирован в примере 1. 1977 и Кри с сотр., 1978. Вышеупомянутый метод синтеза также специально иллюстрирован в примере 1. Желаемые трансформанты. обозначенные здесь как Е,coll К12 RV308/pATI, помещают на пластины с ТД-агаром, содержащим соответствующие антибиотики, а затем культивируют для последующего продуцирования и выделения плэзмиды 10 pASTI. Как показано SDS-гель-электрофорезом, RIA и другими тестами, трансформанты экспрессируют вышеупомянутое производное МЕТ бГР с высокими уровнями, Поскол ьку плазмида pATI содержит 15 термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, л1аксимальная экспрессия желаемого продукта производного бГР происходит при культивировании при температурах около 37 С. 20 Пример 9. Конструирование плазми25 ДНК; ссс Алс сст сп т з Ю 1 " CGG TTG CGA С 51 30 40 „ки, и затем культивируют для последующего продуцирования и выделения плазмиды 45 pASP1. Как показано SDS-гель-электрофо50 В, Лигирование и трансформация. Примерно 20 пикомолей линкерной ДНК примера 7,Б, 1 мкг перевара pNM608 примера 7,А, 0,5 мкг BamHi-EcoRl фрагмента примерно 10,2 kb плазмиды pCZ101 (полученного в соответствии с методикой примера 2;Б, с тем исключением, что используют EcoRl рестрикционный фермент и соответствующий буфер, а не Xbal рестрикционный фермент и буфер) и 1 мкг BamHlHgiAI фрагмент примерно 0,6 kb плэзмиды pCZ101 примера 3,Б подвергают лигации, а полученную в результате плазмиду используют для трансформации Е.coll К12 RV308 по:существу в соответствии с методикой примера 2,Г, Некоторые из полученных в результате трансфорл1а ITOD, KQK показано электрофорезом на агарозном гале (Мэниатис с сотр., 1982) и другими тестами, содержат только желаемую плазмиду примерно 10,8 kh, Такйе трансформанты, обозначенные здесь как Е,coll К12 RV308/рСЛ112, отбирают, по, мещают на ТД агаровые пластины, содержащие соответствующие антибиотики, н затем культивируют, используя традиционные микробиологические методики. Как показано электрофорезом на SDS-геле, RIA и другими тестами, полученные в результате клетки зкспрессируют вышеупомянутое производное MET-ASR-ASP-LYS-бГР с вы, сокими уровнями. Поскольку плазмида pCZ112 содержит репликон неконтролируемого роста, термоиндуцируемый, максимальная экспрессия желаемого продукта производного бГР происходит при культивировании при температуре около 37 С. Пример 8, Конструирование pATl плазмиды и Е.coll К12 RV308/pATI. Желаемое конструирование осуществляют по существу в соответствии с методикой примера 7 с тем исключением, что линкерную последовательность примера 7 заменяют линкерной последовательностью ДН <: 5 сслсА ATG TTc ccA сст ATG тст cTA TcT GGT 30 С 1 3 З 1 rent 3 TGT TAC AAG GGT CGA TAC AGA GAT ЛСЛ CCA сто ттт ссС ллс ст стсст 5 СЛС ЛЛЛ CGG TTG СГ,Л С 5 Определенная выше линкерная последовательность может быть сконструирована по существу в соответствии с традиционной методикой Итэкуря с сотр„ ды pASP1 и Е.coll К12 RV308/pASP1. Желаемые конструкции получают по существу по методике примера 7 с тем исключением, что линкерную последовательность примера 7 заменяют на последовательность 10 5 CGACC ЛтС GAT TTT CCG GCT ATG TCT CIG тСC С.С СТС IГВ i ° 1II I1 ° II I1I II ° 3 тГС TAC CTA AAA GGC CGA TAC AGC GAC AGG CC СЛ Вышеуказанная линкерная последовательность может быть сконструирована по существу в соответствии с традиционной методикой. Итакура с сотр., 1977 и Кри с сотр., 1978, Вышеуказанный способ синтезатакже. специально иллюстрирован в примере 1. Желаемые трансформанты, обозначенные здесь как Е.соН К12 RV308/pASP1, помещают на пластины с ТД-агаром, содержащим соответствующие антибиотирезом, ИА и другими тестами, трансформанты экспрессируют вышеопределенное производное МЕТ-ASP-бГР с высокими уровнями. Поскольку плазмидэ pASP2 содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальная экспрессия желаемого производного бГР происходит при культивировании при температурах около 37 С. Пример 10. Конструирование плазмиды pASP2 и E,coll К12 RV308/pASP2, Желаемые конструкции получают по существу по методике примера 7, с тем исключением, что линкерную последовательность 1838412 примера 7 замеряют на последовательность ДНК: ccG сст ATG тст cTG тсс Gcc cTG 111 !I\ !I\ ° II 111 1 I ВII I\I GGC CCA TAC AGA GAC AGG CCG GAC стсст С 5 10 5 CGATC ЛТС GAT TTT ВВВ !1! ° ° 1 3 TAG TAC CTA AAA GCC AAC GCT В!! !i ° 1!! cGc ттс ссл I I ЛЛА 10 5 СТЛСЛСССТЛТТЛАТЛ ATG,TTT ССА GCT АТС TCT СТЛ ТСТ 1111111 ° 11 ° В ° ° ° ° \!11 ° 11 IВI ° IВ I!I ° ° I 3 TCCCATAATTAT TAC AAA GGT CGA TAC AGA GAT AGA GGT стс ттт Gcc AAc GcT стсст 1 ° I t ° I l l t l ° ССА CAC AAA CCG TTC ССЛ С Э Определенная выше линкерная последовательность может быть сконструирова- 45 на по существу в соответствии с традиционными, методиками Итакура с сотр,. 1977, и Кри с сотр., 1978. Вышеуказанный способ синтеза специально иллюстрирован в примере 1. 50 Желаемые трансформанты, обозначенные здесь как Е,соИ К12 RV308/ðÀÒ2, помещают на пластины с ТД-агаром, содержащим соответствующие антибиотики, а затем культивируют для последующего 55 получения и выделения плазмиды рАТ2. Как было показано SDS-гель-электрофорезом, RlA и другими тестами, трансформанты экспрессируют определенное выше производное МЕТ-бГР с высокими уровнями..1 Вышеуказанная линкерная последовательность может быть сконструирована по существу в соответс1вии с традиционной 10 методикой Итакура с сотр., 1977 и Кри с сотр., 1978. Вышеуказанный способ синтеза также специально иллюстрирован в приме.ре 1. Желаемые трансформанты, обозначен- 15 ные здесь как Е,coll К12 RV308/рАР2, помещают на пластины с ТД-агаром, содержащим соответствующие антибиотики, и затем культивируют для последующего продуцирования и выделения плазмиды 20 pASP1, Как показано SDS-гель-злектрофорезом, RlA и другими тестами, трансформанты экспрессируют вышеопределенное производное МЕТ-ASP-бГР с высокими уровнями. Поскольку плазмида pASP2 25 содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальная экспрессия желаемого производного бГР происходит при культивировании при температурах около 37 С. 30 Пример 11. Конструирование плазмиды рАТ2 и Е.coll К12 ВЧ308/рАТ2. Осуществляют желаемые конструирования по существу по методике примера 3, . с тем исключением, что линкерная последо-, 35 вательность примера З,В заменена линкерной последовательностью ДНК: 10 5 сслсс лтс crT ттт ccc ccT лтс тст стс тсс ссс стс t ° I I I I 3 тсс ТАс слл AAA ccc cGA тлс AGA GAc лсс ссс слс Tii GCC ЛЛС GCT CTGCT ! I1 I 11 I ЛЛЛ CGG TTG CCA С 5 Определенная выше линкерная последовательность может быть сконструирована по существу в соответствии с традиционной методикой. Итакура с сотр., 1977 и Кри с сотр., 1978. Вышеуказанный способ синтеза был специально иллюстрирован в примере 1. Желаемые трансформанты, обозначенные здесь как Е.соИ К12 ВЧ308/рС2154, помещают на пластины с ТД агаром, содержащим соответствующие антибиотики, и культивируют для последующего получения и выделения плаэмиды pCZ154, Так же показано SDS-гель-электрофорезом, RIA и другими тестами, что трансфор1ланты 3КСпрессируют вышеупомянутое производное МЕТ-VAL-бГР с высоким уровнем. Поскольку плаэмида pCZ154 содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальная экспрессия желаемого производного бГР происходит при культивировании при температуре около 37 С. Пример 13. Конструирование плазтлиды pCZ155 и Е.coll К12 RV308/ðÑZ155. Желаемые конструирования осуществляют по существу в соответствии с методикой примера 7, с тем исключением,,что заменяют линкерну о последовательность примера 7 линкерной последовательностью ДНК: 10 5 cGAcc лтс cc1 ттт ссс сст лтс тст стс тсс GTc cTG III III III 1 TGG ТЛС ССЛ AAA GCC CGA TAC ACA GAC AGG CAG GAC 3 ттт ссс ллс GcT clccT э ° \ I AAA cGG ттс cGA c 5 Определенная выше линкерная последовательность может быть сконструирована по существу в соответствии с традиционной методикой Итакура с сотр., 1977 и Кри с сотр., 1978. Указанный выше Поскольку плазмида рАТ2 содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальна экспрессия желаемого производного происходит при культивировании при температуре около 37сС, Пример 12, Конструирование плазмиды pCZ154 и Е,coll К12 RV303/рСЕ154. Осуществляют желаемые конструирования по существу в соответствии с методикой примера 7, с ем исключением, что линкерную последовательность примера 7 заменяют на линкерную последовательность ДНК: о 1838412 яб 10 5 с э сслтл лтс слт ттт ссс сст лтс тст стс,cc ccc стс! тлт, тлс тл ллл ссс сял тлс лсл с>!с Act ccc CAc ттт ссс ллс сст стсст з ллл сс:с ттс ссл с 5 Определенная выше линкерная последовательность может быть сконструирована по существу в соогветствии с традиционной методикой Игакура с со3р. 1977 и Кри с сотр.. 1978. Указанный выше способ синтеза также был специально иллюстрирован в примере 1. Желаемые трансформан1ы, обозначенные здесь как Е.coli К12 RV308/pCZ156, были. помещены на пластины с ТД-агаром, содер>кащим соответствующие антибиотики, затем проводят традиционное культивирование для последующего получения и выделения плазмиды pCZ156. Также показано SDS-гель-электрофорезом, RIA и другими тестами, что трансформанты экспрессируют вышеупомянутое производное MET-ALP-бГР с высокими уровнями. Поскольку плазмида pCZ156 содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальная экспрессия желаемого производного бГР происходит при культивировании при температуре около 37 С. Пример 15. Конструирование плазмиды pCZ103 и Е.coli К12 ВЧЗ08!-pCZ103. Растворяют 10 мкг плазмиды РС2101 в 10 мкл 10Х BstE11 реакционного буфера (1,5 способ был также иллюстрирован специально в примере 1. Желаемые трансформанты, обозначенные здесь как Е.coii К12 RV308/pCZ155, помещают на пластины с ТД-агаром, содержащим соответствующие антибиотики, а затем культивиоуют для последующего получения и выделения плазмиды pCZ155, Также было показано, SDS-гель-электрофорезом, RIA и другими тестами, что трансформанты экспрессируют указанное выше производное МЕТ-ALA PHE-PRO-ALA-METSER-LEU-SER VAL-б ГР с высокими уровня- ми. Поскольку плазмида pCZ155 содержит -. термоиндуцируемый репл33кон неконтролируеглого роста, максимальная экспрессия >келаемогс3 производного бГР происходит при культивировании при температуре около 37 С. Пример 14, Конструирование плаэмиды pCZ156 и Е.coii К12 RV308/рС2156, Проводят желаемые конструирования по существу по методике примера 7 с тем исключением, что линкерную 33ослсдова.тельность примера 7 заменя3от на линкерну3о последовательность ДНК: М NaCI, 60 мМ Трис. НС!, рН 7,9, 60 мМ MgCIg, 60 MM 2-.меркаптоэтанола и 1 мг/мл BSA). и 88 мкл воды и 2 мкл (20 ед.) рестрикционного фермента BstE11, полученную в результате реакционную смесь инкубируют при 60 С в течение 2 ч. После экстракций фенолом и хлороформом и нескольких осаждений этанолом ДНК обрабатывают 0,25 М раствором ацетата натрия. Суспендируют около 0,1 мкг ДНК пере5 10 варенной BstE11 плаэмиды pCZ101 в 100 мкл лигазного буфера. После добавления 100 ед. Т4 ДНК лигазы и инкубирования при 16 С в течение 2.ч лигированную ДНК используют для традиционного трансформи15 трансформангов по сущесгву в соответствии с методикой примера 2,А. Пример 6. Конструирование векторов, происходящих из плазмиды pCZ103 для экспрессии производных бычьего гормона роста. Так как BstE11 делеция, сдела3гная при конструировании плазмиды pCZ103, не воздействует на последовательность, кодируlo щуо протеи33 бП-, плаэмиды, происходящие иэ плаэмиды pCZ103 изобретения, экспрессируюг то >l(8 самое производное (>сГР, что и их дубликаты, происходящие из плаэмиды pCZ101. Так KGK плазмиды изобретения, проис35 ходящие из рСЕ103, были сконсгруированы по существу в соответсгвии C методикой примеров, в которых были сконструированы их дубликаты, происходящие иэ pCZ101, в табл.2 представлено кратко сум3лирова33 3ое 40 конструирование плаэмид, происходящих из pCZ103. В 3абл.2 перечислены плазмиды, :происходящие иэ pCZ103, соответствующий пример, описы33а3ощий констрyèpoÂÇHие дубликата, происходящего из pCZ101, и размер только отлича3ощегсся tj.,pëãìåíòà ДНК, включенного в конструирование. Плазмиды, происходящие иэ pCZ103, были использованы для.традиционной трансформации Е.соИ К12 RV308. Полученные в результате трансформанты экспрес- сируют вышеупомянутые производные бГР, Поскольку плаэмиды, происходящие из pCZ103, содержат термоиндуцируемый ре55 пликон неконтролируемого роста, максимальная экспрессия происходит при культивировании при температурах около 37 С. рования Е.coli К12 RV308, Отбирают : трансформанты Е,соИ К12 RV308/рС7103 на канамицине и идентифицируют рестрикционным ферменгным анализом ДНК их плазмиды, Выделяют плазмиду pCZ103 из 1838412 Д аблица 1 Синтетические олигонуклеотиды для гена тимоэин I Соединение Последовательность Длина Время удерживания при анализе высокоэффективной жидкостной хроматографией, мин* А-А-Т-Т-С-,А-Т-G-Т-С Т-G-А-Т-G-С-Т-6-С-Т-6-Т-Т-G-А Т-А-С-Т-Т-С-Т-Т-С-Т-G-А G-А-Т-Т-А-С-Т-А-С-Т-А-А-А G-С-А-6-С-А-Т-С-А-G-А-С-А-Т-G G-А-А-G T-А-Т-С-А-А-С-А А 6-Т-А-А-Т-С-Т-С-А-G-А-А А-А-G-А-Т-С-Т-Т-Т-А-G-Т G-А-Т-С-Т-Т-А-А-G-G-А-G А-А-G-А-А-G-G-А-А-G-Т-Т G-Т-С-G-А-А-6-А-G-G-С-Т G-А-G-А-А-С-Т-А-А-*Г-А-6 С-Т-Т-С-T-Т-С-Т-С-С-Т-T -T-С-G-А-С-А-А-С-Т-Т-С 6-Т-Т-С-T-С-А-6-С-С-Т-С G-А-Т-С-С-Т-А-T T-А * at ambient temperature при комнатной температуре. Таблица 2 Примечания Соответствующий пример Отличающийся использованный рестрикционный агмент Вектор, происходящий из pCZ103 Другие использованные фрагменты ДНК били такими же, как 11 pJR1,3 РАТ2.3 Использован BamH1Xbal рестрикционный фрагмент 9,3 кв плазмиды рС L103 вместо BamHI-Xbal рестрикционного фрагмента плазмиды pCZ101 в укаэанных примерах, Отметим, что Bam Hl-Hgl Al рестрикционные фраг менты 0,6 kb плазмид pCZ101 и рС2103 являются идентичными Другие использованные фрагменты ДНК были такими же, как pATt.3 pAsPI.3 pAsP2.3 pCZ1S4.3 pCZ155.3 рС2156.3 Использован BamHIЕсоЮ -рестрикционный фрагмент 9,3 kb плазмиды pCZ103 вместо BamHI-EcoRI фрагмента рестрикции 10,2 kb плазмиды CZ101 9 12 13 14 использованные в указанных примерах Т1 Т2 Тз Т4 Т5 Т6 Тт Т8 Tg Т1о Т11 Т12 Т1з Т14 Т15 Т16 12 13 12 13 12 12 12 12 12 12 12 12 17.4 24.3 20.3 22,0 24,8 20,1 22,6 20,2 20,4 21,1 20,5 20.4 19.9 20.5 20,2 17,2 1838412 CTC TTT GCC AhC CC? GTCCT-3 11! III Ill !1! III I GAC AAh CCG TTG CGh С-5 С1С ТТТ ССС SAC CCT С?ССТ-Э Ill !fl IlI lll III СЛС ЛЛЛ ССС ТТС ССЛ С-5 ТТТ ССС AAC CCY CTGCT-Э III III III IIf ЛЛЛ ССС ТТС ССЛ С-5 Формула изобретения 1. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, заключающийся в том, что осу ществляют лигирование фрагмента BamHI-Xbal плазмиды pCZ101 размером 10,2 kb или BamHI EcoRI фрагмента той же плазмиды с Ipp Йромотором и репликоном, теряющим контроль числа копий при 37 С, с BamHI-Xbal-фрагментом плазмиды pCZ101 или pCZ103 размером 0,6 kb, коди- . рующим аминокислоты с 15 до 191 бычьего гормона роста и ДНК-линкером, содержащим нуклеотиды, кодирующие последовательность активации трансляции, стартовый кодон и кодон для N-конца производного бычьего гормона роста, при этом в случае, когда для лигирования берут BamHI-Xbal-фрагмент плазмиды pCZ101 используют линкер с последовательностью 20 нуклеотидов T -fTA0A0GGTATTAATA ЛТО AAA GGG AAT тГТ ЛТССГ ТГГГГЛСГГ IlIflIffIIlI llf Ill lIl ((((1(!(1(((и(ВИ! A - ТГСГАТАЛТГАТ ТАГ TTT Ccr TTA ЛСЛTAC ссСАЛСссГГсс ATG ТГГ Тта TCC ыГГТГTTT GCC AAC GCT CTGCT-s 25 Ill lII II(Ill,I((I(I I(I ((((((((((ТЛГ Лбб AAC ЛСС ГГС бЛГ AAA ГСС Гтб CGA Г-5 и получают плазмиду pCZ1920, кодирующую МеТ-Lys-Gly-Asp-1й-S ЕВ-MET-А! аbGH, или линкер с последовательностью 30 нуклеотидов CIA GAGG0 TATTAAYA ATG Ттт ГГА СГГ ЛТС.сс Г Cfh ГГГсст ,. f! f f f I f l f ll f fll Ill lIl Ill fl f (li fff ill lit 3 TCCCATAA ТТЛТ TAC Ahh JGTCGG TAC CGA GATACAГГЛ стс ттт erc ллс rcT стсст-Г I I I III I I I I I l I II 1, . 35 слГ ллл сбб ттс cGA ct T 7 и получают плазмиду р(й1, кодирующую МЕТ-PHe-PRO ALa-MET-Ala-ЬОН, или линкер с последовательностью нуклео.гидов 5 -CTAGAGCGYATTAATA АТС TTT ССЛ. GCY ATG ТСТ СТЛ ТСТ CGI ! I III! I!I!11 11I i!I 1! Iii 11 1 !It !!! 1!! Ill 3 -TCCCATAATTAY ТЛС МЛ GGY CGA TAC AGA GAI ACA ССА CTC ТТГ ССС AAC ССТ CYCCI-Э 11! ! I I I i I I! l i l I СЛС МА CCG ITG CCA С-53 и получают плазмиду рАТ2, кодирующую Мес bGH, в случае, когда для лигирования берут BamHI-Xbal-фрагмент плазмиды pCZ103, линкер имеет последовательность 50 нуклеотидов 5 СТЛСЛСССТЛТТМТЛ АТС ТТТ ССЛ ССС АТС ССТ СТЛ TCT CGY !!!!!!1! Н Н Ill lii III lil 111 111 lll lit Iit 3 "TCCCAIAATTAT ТАС AAA C T CCG TAC CCA CAT ACA CCA CTG TIY CCC hAC ГСТ CIGCT"3 111 Ill lli lll !!1 i ° CAC AAA CCG TTG CCA C-5 и получают плазмиду рЯ1„3 кодирующего Мес-PHE-PRO-Ala-BGH или линкер с последовательностью нуклеотидов 5 -CTACACCGTATTAATA ЛТС ТТТ ССЛ GCI ATG TCT CTA ТСТ GGT lllllllllltl lll III Ill III III lll Ill lll lIl Э -ТССГАТЛЛТГА? ТЛС hhh CGT CGA TAC AGA CAT АГЛ CCА и получают плазмиду рАТ2,3, кодирующую МЕТ-bGH, при этом в случае, когда для ли-. гирования берут BamHI-EcoRI-фрагмент плазмиды pCZ101 или pCZ103, его дополнительно лигируют с EcoHI-Cia!-фрагментом плазмиды pNM 608 с ДНК-линкером, кодирующим последовательность активации трансляции, стартовый кодон и кодон для Й-конца производного бычьего, гормона, причем в случае лигирования фрагмента плазмиды pCZ101 используют лин кер с нуклеотидной последовательностью 5 -ССАСС ATG GAT GAT АЛО Тт? ССС CCT ATG ТГТ CTG lll lll III III lll III III ill Ill lll lII Э -TGG TAC СТЛ СТЛ ТТС ЛЛЛ ССС CGA TAC ЛГЛ GAC TCC GCC CTG ЯI CCC AAC GCY GTGCT-3 1II lIl III I ll III 11:.! !!1 I ACG CCG СЛС AAA ССС ТТС ССЛ С-5 при этом получают плазмиду pCZ112, кодирующую MET-Asp-Азр-Lys-bGH или линкер с последовательностью нуклеотидов 5 -CGACA ЛТС TIC CCA GCY ATG .ТС? СТЛ ТСТ ССТ 1Il !!! IIl lII iII 1Il, lII !!! !!! lII TGT ТЛС AAG GGT CGA TAG AGA Ch? AGA CCA при этом получают плазмиду PAST,1, кодирующую MET-Азр-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов 5 -ССЛСС ЛТС СЛТ ТТТ ССС ССТ ЛТС ТС? СТС ТСС GCC СТГ 111 111 !!I.I!! III 111 111 1!I 1!! I!l !II !II 3 TGG lAC СТЛ ЛЛЛ ССС ССЛ TAC ACC СЛС ACG ССС ГЛС при этом получают плазмиду pASTPI, кодирующую МЕТ-ЬОН, или линкер с последовательностью нуклеотидов л -cchTc ATc слт TTT ссс сст ATC тст спс тсс ccc ccc riT ccc ллс ccT nccT-3 1(1 III III III III III III III III III III III III III III. III TAc Thc cTh AAh ccc ссл тлс л<л слс, лсc ccc cnc; ллл ссс ттс ссл с-л 1838412 50 при этом получают плазмиду pASP2, кодирующую MET-ASP-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов Асс лтО 6 т ттт ccG Ост ATG тст стл TCC ill III ltl lIt ttI lIl III lII III 111 ill III 3 "TCG TAC Chh AAA 66(. ССЛ TAC ЛСЛ СЛC AGG CCG GAC ТТТ ССС ЛЛС СОТ СТССТ-3 III III lIt 11! I hAA CCG lT6 CCA С-3 при этом получают плазмиду pCZ154, кодирующую MET-VAi -bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов Р Ь -CGACC ATG ОСТ TTT CCC GCT ATG ТСТ CTG ТСС СТС СТО Iit II! 1II III III 111 1)I 111 III 111 III 111 3 -тсс тлс ссл ллл ссс ссл тлстлсл слс.лсО слО Слс TfT ССС AAC CCT CIGCT-3 lIl III !11 III I АЛЛ CGG ТТС ССЛ С-3 при этом получают плазмиду pCZ155, кодирующую М ЕТ-А! А-Р Н Е-PRO-ALA-МЕТ-SERLEU-SER-VAL-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов О -СОЛТА ЛТС СЛт ТТТ ССО СОТ ЛТС ТСТ СТО ТСС СгтС СТО III III 111 III III III II1 1!! III.III III III 3 -ТЛТ ТЛС СТЛ ЛЛЛ CGC CCA ТЛС ЛОЛ СЛС ЛСО ССО СЛС ТТТ ССС ЛЛС CCT CTGCY-3 1!! 1Ii 111 111 I ЛЛЛ CCC TTG CGA С-3 ! при этом получают плазмиду pCZ156, кодиру!ощу1о MET-ASP-СН, в случае, когда для лигирования берут Вагт1НI Ec0Rl-ôðàãìåèò плазмиды pCz103 использу1от линкер с последовательностью нуклеотидов 3 -сслсл ATG ттс ссл сст ATG TGT стл тт.Г Сст III III III III III III 111 III III 111 IGT TAc AAG G6T ссл thc лсл Слт ЛОА ссА CTG ТТТ GCC ЛЛС CCT GTGCY-3 III ill IIl III llI СЛС ЛЛЛ CGC ТТС С6Л С-3 4 при этом получают плазмиду рАТ1.3, кодирующую MET-bGH, или линкер с последомтельностью нуклеотидов 33-СОЛСС ЛТС СЛТ ТlT CCG СОТ ATG ТСТ С16 ТСС GGC CTG. И 111 111 111 111 !11 И 111 111 !11 1!! И ! 3 -TGG TAC CTA AAÀ ССС ССЛ ТЛС ЛСС СЛС AGG CCG ОЛС ТТТ ССС АЛС CCT GTGCT-3 1It iII III III I ЛАЛ CCG TTG CGh 6-3 при этом получают плазмиду рАЯР1.3; код!1г-рующую МЕТ-ASP-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов СЛ 76 ATG GAT TTT ССО GCT ЛТО TCT CTG ТСС CGC CTG II Ilt lIl III III tII III III ill 1!! ill III ЛС ТЛС CTA ЛЛЛ ССС ССЛ ТЛС ЛСА СЛС ЛСС ССС.САС ТТТ ССС ЛЛС .GCT CTGCT-3 1It IIi ttI tit 1 ЛАЛ CCG.TTG CCA 6-5, при этом получают плазмиду pAZP2.3, кодирующую MET-а à-bGH, или линкер с последовател ьностью нуклеотидов 5 S -ССЛСС ЛТС СТТ ТТТ CCG СОТ Л16 ГСГ СТС ТСС ССС СТО 1II 1!! !11 !!! Itl lli Ilt Ill III !!! III tlt 3 "YCG TAC CAA Ahh GGC ССЛ TAC ЛСЛ CAC ЛСС CCG CAC TTT CCC ЛЛС GCT GIGCT-3 ItI III 111 III 1 ААЛ CCG ТТС CGA С-3 10 при этом получают плазмиду pCZ154,3, кодирующую MET-VAL-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов 15 5 -сслсс ATG ccT ттт ccG сст hTc TcT cTG тсс GTc cTc ItI III-III III IIi Ill II! Il1 IIi III Itl III 3 -TCG тлс CGA ЛАА 1!ОС CGA ТЛС AGA GAC ЛСО СЛС Gl c 1TT GCC AAC 6CT СТССТ-3 111 III 111 III I ЛЛЛ ССО ТТС ССЛ С-3 > 20 при э3ам получают плазмиду pCZ !55.3, кодирующую MET-А! А-РНЕ-PRO-ALA-МЕ! SER-LEU-SER-VAL-bGH, или линкер с последовательностью нуклео1идов 25 .т. -сс т г тс i:hr ттт СсС ССт стС тСг с-С тсС ССС Сгт rrr ссс l С (r(Crea .) , ll1 И. 1 1!1 lll ll! tll III lll 111 Itl lll Ill И 1 1 11 1 11 И 1 1 " 3 тст »«тл ВЧ. гсс ссл rhC /.ст rhC Лс ссс Chr hh CC 30 при этом полу 1ают плазмиду pCZ156.3, t .одирующую MET-ASP-Ьб Н; 2. Способ биосинтеза производного бычьего гормона роста, предусматриваю35 щий конструирование рекоГлбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, трансформацию получе11ной ДН К штамма Eschericbia col!, выращивание 40 трансфорГлантов в питательной среде и выделение целевого продукта, о т л и ч а 1ошийся теГл, что, с целью повышения выхода целевогоо продукта, конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pCZ110 4Г- или pCZ153, или рСЕ154, трансформируют 45 штамм Е.соИ К12 ЯЧ38, а выращивание проводят при 25 С до достижения логарифмического роста, затем клетки пвресевают на свежую питательную среду того 3<е состава и выращивают при 37ОС. Приоритет по признакам: 06.03.84 по п.1; 26.07.84 по п.2. pKEN111 « Нра ц rn HI Sal E Есо RI Pvu EI Eco RI.,Есо RI Linkers Т4 Ligase ) Eco Xba I Eco RI Hind III Barn HI НраП 980bp Нра ц Fragment ) AIU I 462Ьр Aiu I Fragment 466bp Есо Fragment u II P Нра II Hpal p8R322 Eco RI АИсаБпе Phosphatase 1838412 ХЬа I Есо В 8am HI SaI 1 PEco Rt Partial Dtgesttcn /$! Nuclease Hind И Linkers Т4 DNA Ligase Hind 1Ц r Ь е Т4 bNA Ligase ХЬа I Исо RI Bam HI Нед Ш aI I ч PIasmid 103 (Figure 1) Ф HIn(j it($1 Nuctease Bam HI Linkers т4 DNA Ligase ° ° Bam Н1 Т, DNA Ligase Есо Rl 183В412 Ийегв Llgase Barn HI Sal 1 Plasmld 105 (Figure 2) Sal I 8am Н1 Alkaline Phospl atase Plasmid pKEN111 (101 in Figure 1) Hpa I Gal I Linkers Т, DNA Ligase За! 1 Pvu П Pfasrrtid pOR322 (Ю2 ft> Figure 1) АИсаИпе Phospftafase Ham g юп for vmarI 0Yá {11 окопе ВлтН1 110 ,ХЬа t Plasmid pNtVt575 (109 in Figure 4) 13am Hl б91bp 8am Н! Fragment ° ° Fnu Dll 538 Ьр Bam Ht, Fnu Dtt Fragment Fn«Oil Syrftlretic Fragment Г !асrnid рКЕМЭ21 ХЬа l-Bam Hl— digesled (f07 in Figure Э, Н fdШ pNM702 u Dl l vu ll Pvu II 8am ill (Риг.5 Pvu I I Sat I 1838412 р1гр EDSOchG H800 1838412 pBP348 Pst I Sma Hind 111 ХЬа Pvu I u11 щазе Pvu ll Hind I I f Sail ba1 Pvu I1 рИМ685 ma l Pvu 11 Sal 1 Plasmid рй 5602 (111 Ь Figure 5) Pvu I I Partial Digestion Pvu 11 Pst1 494 bp Fragment чи 11 am HI 1838412 48 gure 6) Hlnct Ш gment аП tial sation ment Sal I Hind l l I pNMT89 Pvu II am HI Sat 1 114 (in Figure 6) P vu П Partial bigestion Xba I Alkaline Phosphatase Xt. t tIp Synthetic F ment а1 Нра П Pvu П 1838412 Syn the tic Fr grnent Hind II l DNA igase Sal l pNM7898 иП rn Ht Sal I Plasmid pNM789 (117 п Figure 7) . Pvu II Partial Digestion 8am Ht Alkaline Phosphatase ::I "., 318 8ап) Н! Рчо И Pvu I I Codingeqvence or Bovine Growth Hormone 1838412 Есо RI gi Af am HI pCZ 1920 Есо RI Ира I Hgi At .Есо Rt Hpa1 Hgi At mHI Bs (° < Я (A 4 4 Г4 z о у и u" O сС )у )1- (7 о U. о (((CL о О «(< и СФ Q «(О с4 и Г4 ° Г4 ((oL о Г(Z л CL Ш С > Ф Г! > C(4 (4 Г() о; ю, СЧ 4 (((л и (r. o о v CL ar ГЭ «Г ао (3 (м и —:( (a ае а ° Т и 4 сз О ° (4 Г4 Р4 ( (i г(l о сС c-g v I- «( (3 l (С (» с( о II- ( о (lф r1 < (— (Ig «-ь .(4 ( о и (v (( (р (g о о (> о ° Q О 4(In (с а (о и, < (n а4 х Ъ» а Ш (4 Я а С4 И < (7 (— (( (J "( о (\.(а О I« (5 О (» «(О - Э Ую и 4I и й о i о г(I С (( ф и — О а о=а-о о О а н О=а-О д о и — -. о » Е о llt о 0 « „ о=а-о н =0 и — —: о а л о=а-о Ф О ((О а „ о=а-о д о. . 3 о Е с Ct о о а оса-о Ф о и — 0 a: о= -о о I-— „о=а-о д о и — -.-о IЕ О ш О O а оса- CI 0 о сс о=а-о о с- (° (C q оса"n cI О f3 — (у (Е n) — а» СЧ) 4 -! — в 1838412 аС и о и — (-. о=а-о о 0 а о=а-о н 0 а „О=а-0 о=а-о Ф О 0 а о=а-о н о .(— - . » Е v О сс „о-.. -о д "о о а о= -о о ÎCC о=а-о и и — - О а О=4--О о ОСС о=оа-О - — -. о=а-o а О .1 о Е о о .с= о Ф „и) о> > CQ m 4 Р, У О. 4 — С- Гсй о о О Г( — X Ф Ф о а (6 ц vZ - in ш ° ( д о и — с-:о сс о=а-о „о=c -о д о о а 0=(L-о н ° О «аоа-О в о а о=а-о и О, Л о 0 CC „оса-о Фн О и — (-.-. 0 а O=a-0 о о а „ 0= -о о о а Оса-О о=(i-о о 3. О (C о=а-о 4I O о — -. Ео P y î о -х Фо,т Ф v ((с ° — о яи Я с «(Ф и — О а о=а-О о 1 о к 04(-О и -0 о а о=а-о Ф 0 о — ( о=а-о О ОЭ 0 «С но= -о и — 0 а 0=c-О о 1 1 О сс о=с -о @ о и — оса--о о ь- — - 0 а о=а о о ь-— о а э О=а-р m o «р Л (Е 1838412 Есо RI am HI 1 ТЕ 5 4 То Т19 T11Т19 Т5 Т6 Т7 Т6 Т13 Т14 Т15 Т16 ъ ДрТ тсг Т4 ОИА Ligase Bam HI Есо RI thymo sin Др HI РН1104 рЕЗ НР911 ФШ BamHI Р911 В t Т eee ° e ссссссс —— НраИ BamHI 1Г Есо RI r r r r r - — qaaaaa a -- -29 30 31 Э2 ЭЭ 1re 1re er9 вр ой IIo Icc сосlc GG 0ac T Tc 10а осо 0 Сcf C To 29 30 31 32 1Te rre erp 449 IIG ACT C0C CGi0 ITCC 11С 104 ОСС 0СС"ТА130 IIIICCGGIfCCG0TCCCC ттттоасс 14жосассс EcaRI, Hpalf EcoRI Bamk1, Н оа11 Нра11 BamHl " -ь Hpa l I pSOM7d ad I соЯ! partial, Pall EcoRl d РЕII i rrp pO LE luSIOO ЕСОН1 ° Bgll BamHI 44* ° А 1rrrrM P5l I EcoRi \P 4139 4549 911 eer 1ee оат 1сс сто ССа 4ЭС 04С IS ° 9 55|1 1ц5100 р 1 2 pie phe iii41 pire eel GII 11С Ito TTC GTC с1Т AI0 14С ааа С*0 Дрй 1а 114 Il1 1тт P 511 --- - оооооо ---- 4ccccc Есо RI Bam HI Есо RI 1838412 (A)„ EcoRI Reverse lIanscriPIase+dNTP s с + BamM1 linker 5 CCGGATCCGG(l) 3 Pslr Tc" А„Я! Psl I Terminal trensterase + dGTP (А(„С (T)„G ССССС ECoRI BamH! Нра! Р ! (cn Human Insulin cDNA BamKl Ps!I, 6 Составитель Н. Барнабишвили Техред М, Моргентал Ксрректор Л. Пилипенко Редактор Заказ 2905 Тираж Подписное Е)НИИПИ Государственного комитета по зобрстениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 (A!„3 П) ООССТАООСС 5 Denature RNA/DNA hybrid KIenow Pol t Оэтн! (A)„CCGGATCCGG 3 (T)„GGCCTAGGCC 5 ! Ы Nuclease Ter min at Iran Аяяся! Trans form E. colr Select Tce f Screen
