Способ определения активности пектолитическихферментов
О П И С А Н И Е 204276
Союз Советскиз
Социалистически»
Республик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Зависимое от авт. свидетельства №
Заявлено 05.Х.1966 (№ 1106178/28-13) с присоединением заявки №
Приоритет
Опубликовано 20.Х.1967. Бюллетень № 22
Дата опубликования описания 28.XII.19á7
Кл. 6а, 22/04
МПК С 12k
УДК 663.11:577.15.08 (088.8) Комитет по аелам изобретений и открытий при Совете бвинистров
СССР
Авторы изобретения
Заявитель
А. П. Рухлядева и Г. Т. Кретинина
Всесоюзный научно-исследовательский институт ферментной и спиртовой промышленности
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ
Количество ферментного раствора
Температура реакции гидролиза — 30 С
1
Известен способ определения активности пектолитических ферментов путем ферментативного гидролиза раствора пектина с последующим количественным определением расщепленного пектина.
Предложено после процесса гпдролиза на гидролизат действовать сернокислым цинком, инактивируя при этом ферменты и осаждая продукты пектолиза. По количеству продуктов пектолиза, не осажденных сернокислым ци., ком, судить о количестве расщепленного в процессе гидролиза пектина, причем это количество неосажденных продуктов определять на интерферометре по разности показателей преломления между исследуемым раствором и контрольным (эталоном) .
Это повышает точность определения и ускоряет процесс.
Способ заключается в следующем. В пробирку наливают 20 мл 1%-ного раствора свекловичного пектина и 10 мл ферментного раствора, приготовленного на разбавителе. Содержимое пробирки перемешивают и выдерживают в термостате при 30 С в течение 1 час для проведения реакции гидролиза пектина. После этого к реакционной жидкости добавляют
2 мл 15о/о-ного раствора сернокислого цинка для инактивации фермента и для осаждения макромолекулярных продуктов пектолиза. Содержимое пробирки перемешивают и фильтруют.
Полученный прозрачный раствор является исследуемым. Одновременно готовят контрольный раствор. Для этого в пробирку наливают 2 льг 15% ного раствора сернокислого цинка, 20 мл дистиллированной воды и 10мл того же ферментного раствора. Содержимое пробирки перемешивают.
Затем интерферометром ИТР-2 определяют разность показателей преломления исследуе10 мого и контрольного растворов (An), получаемую в результате наличия Hp осаждаемых сернокпслым цинком продуктов пектолпза в исследуемом растворе.
Замер Ла производят в кювете с длиной
15 грани 4 сл. Для получения точных результатов необходимо брать на анализ такое количество ферментного материала, чтобы Ла=
=250-:-1250. За единицу пектолитической активности принимают такое количество фер20 мента, которое гидролизует 1 г пектина до продуктов, пе осаждаемых раствором сернокислого цинка, грп соблюдении строго определенных следующих условий.
Количество субст- — 20 мл 1% íîãî раст25 рата вора свекловичного пектина — 10 мл
- 204276
3,9 — 4,1
Величина рН реакционной среды
Время гидролиза
1 час (.оставитель М. И. Андреева
Текред Л. Я. Бриккер Корректоры: М. П. Ромашова и С. Ф. Гоптаренко
Редактор В. Ф. Чулкова
Заказ 4191 9 Тираж 535 Подписное
ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР
Москва, Центр, пр. Серова, д. 4
Типография, пр, Сапунова, 2
Соотношение фермент-субстрат в среде, обеспечивающее гидролиз пектина на 30%.
Количество осади- 2 мл 15%-ного раствотеля ра сернокислого цинка.
Полученное значение An подставляют в следующее уравнение:
0,07585 Л п + 12,59
ПкА„= или ед/мл, m. 1000 где IIkA, — пектолитическая активность анализируемого ферментного материала, в принятых единицах; m — количество ферментного материала, взятого на анализ в г или мл;
0,07585, 12,59 и 1000 — постоянные коэффициенты, полученные по законам аналитической геометрии.
Э1о уравнение составлено на основе изучения зависимости между разностью показателей прел:мления исследуемого и контрольного растворов и количеством единиц активности ферментного препарата, взятого для проведения ферментативной реакции.
1l р и м е р. Для анализа препарата фермента Aspergillus niger берут навеску его в 0,1 г и переводят ее в колбу на 50 сма, разбавителем доводят объем в колбе до метки. Перемешав содержимое колбы, берут из нее 10 мл раствора и переносят в колбу на 50 сма, доведя объем разбавителя до метки. Затем из получснного перемешанного раствора отбирают 10 мл для проведения ферментативной реакции, что соответствует содержанию ферментного препарата в количестве 4 мг. .1осле приготовления исследуемого и контрольного растворов определяют An на интерферометре. Опо равно 733. Подставив это значение в уравнение, находят
ПкА = = 1705 ед/г
0,004 1000
При определении активности пектолитических ферментов по описываемому способу
15 расхождение в среднем составляет +-2,5%, а
3fG значит, что способ более точен.
Предмет изобретения
Способ определения активности пектолити20 ческих ферментов путем ферментативного гидроли а раствора пектина с последующим количественным определением расщепленного пектина, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения и ускорения
25 процесса, после процесса гидролиза производят осаждение продуктов пектолиза и инактивацию ферментов сернокислым цинком, а количественное определение расщепленного в процессе гидролиза пектина проводят по ко30 личеству продуктов пектолиза, не осажденных сернокислым цинком, причем это количество устанавливают на интерферометре па разности показателей преломления между исследуемым раствором и контрольным (этало35 ном) .
