Способ получения лизоцима

 

Использование: биотехнология, пищевая и медицинская промышленность. Сущность изобретения: в разжиженную белковую фракцию яйца добавляют 0,6- 1,4%-ный раствор аммиака. Выделение лизоцима проводят путем сорбции, осуществляемой последовательным пропусканием через сорбент силохром марки СХ-ЗВ, предварительно уравновешенный стартовым растворителем, в качестве которого используют 0,6-1,4%-ный раствор аммиака , раствор белка и снова стартового растворителя с последующей элюцией лизоцима смесью 0.8-2,0%-ного раствора уксусной кислоТы с 0,1-0,3 М хлористого натрия, после чего раствор лизоцима подвергают концентрированию на полых волокнах. 70 L,

(5!) 5 С 12 N 9/36. А 23 J 1/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПЛТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товариымзнакам (21) 5000076/13 (22) 01.08.91 (46) 15,02.93. Бюл. N. 6 (71) Центральный институт усовершенствования врачей (72) В.Н.Морозов, С.А.Самарин. Э.Г.Щербакова, Т.П.Журавлева, С.С.Жуков, В.П.Чупрунов и А,В.Кучмий (73) Центральный институт усовершенствования врачей (56) Патент Франции М 256972,кл. С 12 N

9/36, опублик. 1985.

Авторское свидетельство СССР

М 7123438, кл. С 12 N 9/36, 1977, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОЦИМА

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности. в частности к технологии получения лизоцима из белка куриных яиц. Лизоцим используется как лекарственный препарат в качестве пищевой добавки и в молочной промышленности для обогащения защитными факторами продуктов детского и лечебного питания.

Целью изобретения является упрощение технологического процесса.

Сущность изобретения состоит в том, что в качестве щелочного раствора используют 0,6-1,4 -ный раствора аммиака, а выделение проводят путем сорбции, осуществляемой последовательным пропусканием через силохром "СХ-3В", предварительно уравновешенный стартовым растворителем, в качестве которого используют 0.6-1,4 -ннй раствор аммиака раствора белка и снова стартового растворителя с,,ЕП„„ 2000005 С (57) Использование: биотехнология, пищевая и медицинская промышленность. Сущность изобретения: в разжиженную белковую фракцию яйца добавляют 0,61,4 -ный раствор аммиака. Выделение лизоцима проводят путем сорбции, осуществляемой последовательным пропусканием через сорбент силохром марки

"СХ-ЗВ", предварительно уравновешенный стартовым растворителем, в качестве которого используют 0,6-1,4 Д-ный раствор аммиака, раствор белка и снова стартового растворителя с последующей зл юцией лизоцима смесью 0,8-2,07ь-ного раствора уксусной кислоТы с 0,1-0,3 М хлористого натрия, после чего раствор лизоцима подвергают концентрированию на полых волокнах. последующей злюцией лизоцима смесью

0,8-2,0%-ного раствора уксусной кислоты с

0,1-0,3 М хлористого натрия, после чего раствор лизоцима подвергают концентрированию и диафильтрации на полых волокнах.

Впервые для выделения лизоцима в качестве сорбента используется макропористый силикагель силохром марки "CX-ЗВ"

ГОСТ 10973 или ТУ 38,101832-80, который является слабым катионообменником на основе бурсиликатного стекла. Силохром "CX3B" обладает высокой проницаемостью, не уплотняется, не деформируется, не подвержен биодеструкции, решен вопрос с его химической стерилизацией, Ь настоящее время имеется отечественный изготовитель выпускающий сорбент в требуемых количествах, В предлагаемом техническо.л решении отработаны условия сорбции лизоцй; а на сорбенте с использован .ем 0,6-1.4;!,-ного

2000005 раствора аммиака в связи с тем, что гидрофобные свойства самого лизоцима, а также влияние аминных групп на водородные связи между стеклом и белком позволяют в условиях, предложенных авторами, выделить лизоцим, исключая сорбцию сопутствующих белков.

Без учета отработанных авторами условий при использовании раствора аммиака вместе с лиэоцимом сорбинается 20-30 кональбумина, который в кислой среде необратимо денатурирован, затрудняет смыв лизоцима, при этом меняется гидродинамика системы (снижается скорость потока) требуется дополнительная регенерация смолы, при которой большая часть ее теряется необратимо.

В предлагаемом способе силохром "СХЗВ" используется для выделения лизоцима, при этом исключается сорбция сопутствующих в исходном сырье белков (в отличие от известного способа). Такой неочевидный эффект авторами получен за счет использования свойств лизоцима, которые проявляются при взаимодействии с раствором аммиака и стеклом при определенных условиях, отработанных авторами, Способ осуществляется следующим способом.

Белок куриных яиц разжижают с помощью проточного гомогенизатора и смешивают с 0,6-1,4 -ным раствором аммиака в соотношении 1:5. Попадание желтка в белок недопустимо даже в малых количествах, так как это приводит к порче сорбента и снижению активности лизоцима. Полученный раствор белка профильтровывают через грубые фильтры (или марлю. сложенную в несколько слоев).

Для выделения лизоцима используют хроматографическую колонку промышленного образца; диаметр 150 мм, высота 720 мм, вместимость 12,8 литров. Для подачи в колонку растворов используют перистальтический насос НШР-15 М, Слежение за выходом белковой фракции проводят с помощью ультрафиолетового проточного детектора "Volcord $ll" производства фирмы LKB (Швеция), настроенного на длину проходящего света 280 нм. Колонку, заполненную сорбентом силохром "СХ-3В", уравновешивают стартовым растворителем. в качестве которого используют 0,6-1,4 -ный раствор аммиака. Затем полученный раствор белка закачивают насосом в, колонку.

После садки на сорбент проводят промывку этим же стартовым растворителем до полного выхода с пика несорбировавшихся белков ("проскока"). Для элюции лизоцим с сорбента через колонку смесь 0,8-2.0 -ного

55 раствора уксусной кислоты с 0,1-0.3 М хлористого натрия до полного элюирования лизоцима. Фракции элюата, содержащие лизоцим, собирают, диафильтруют и одновременно концентрируют на половолоконной ультрафильтрационной установке

УПВ-6, стерильно расфасовывают во флаконы и высушивают лиофильно. Весь цикл получения лизоцима длится 3-4 суток, при этом хроматография занимает 10-14 ч.

Пример 1. Белок 1000 куриных яиц (30 л) разжижают с помощью проточного гомогениэатора и смешивают с 0,6 -ным раствором аммиака в соотношении 1:5. Полученный раствор белка профильтровывают через грубые фильтры (или марлю, сложенную в несколько слоев). Для выделения лизоцима используют хроматографическую колонку промышленного образца: диаметр

150 мм, высота 720 мм, вместимость 12,8 литров. Для подачи в колонку растворов используют перистальтический насос НШР-15

М1 Слежение за выходом белковой фракции производят с помощью ультрафиолетового проточного детектора "Volcord Sll" производства фирмы LKB (Швеция). настроенного на длину проходящего света 280 нм. Колонку заполняют сорбентом силохром "СХ-ЗВ" и уравновешивают стартовым растворителем, в качестве которого используют 0 6 ный раствор аммиака. Полученный раствор белка закачивают насосом в колонку. После лиэоцима на сорбенте проводят промывку стартовым растворителем до полного выхода с колонки несорбировавшихся белков("проскока"). Для элюции лизоцима через колонку прокачивают 0,8 -ный раствор уксусной кислоты с 0,1 М хлористого натрия до полного элюирования лизоцима.

Фракции, элюата, содержащие лизоцим, собирают, диафильтруют и одновременно концентрируют на половолоконной ультрафильтрационной установке УПВ-6, стерильно расфасовывают во влаконы и высушивают лиофильно. Гомогенность полученного продукта подтверждают методом электрофореза в градиентном полиакриламидном геле. Активность лизоцима 9601060 ЕДlмг, что соответствует ТУ

64-3-208-85 на лизоцим-порошок. Масса полученного продукта — 65,4 r, Учитывая, что теоретическое содержание лизоцима в яичном белке составляет 2 от общей массы сухого белка, выход лизацима равен 95 от теоретического, Весь цикл получения лизоцима занял 3 суток, при этом хроматография — 10 ч.

Пример 2. Белок 1000 куриных яиц (30 л) разжижают и смешивают с 1,4 -ным раствором аммиака в соответствии 1;5, Рас2000005

Формула изобретения

Составитель

Техред М.Моргентал Корректор С.Лисина

Редактор

Заказ 3039

Тираж Подписное

НПО "Поиск Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 твор белка профильтровывают стартовым растворителем в качестве которого используют 1,4 -ный раствор аммиака, колонку с сорбентом силохром "СХ-ЗВ" закачивают полученный раствор белка. Затем проводят промывку этим же стартовым растворителем до полного выхода с колонки несорбировавшихся белков ("проскока"). Злюцию лиэоцима с сорбента проводят смесью 2 (,ного раствора уксусной кислоты с 0,3 М хлористого натрия, Собранный элюат лизоцима концентрируют и обессоливают на половолоконной ультрафильтрационной установке. расфасовывают и высушивают лиофильно. Выход лизоцима составил 65,3 г. Продукт гомогенен при определении электрофореэом в полиакриламидном геле.

Активность лиэоцима 1000 Едlмг, что соответствует ТУ 64-3-208-85 на лизоцим-лороСпособ получения лизоцима, включающий разжижение белковой фракции яйца, обработку щелочным раствором и выделение лизоцима иэ полученного раствора. о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения технологического процесса, в качестве щелочного раствора используют 0,6-1,4 ный раствор аммиака, а выделение проводят путем сорбции, осуществляемой. шок. Цикл получения занял 4 суток, при этом хроматография — 14 ч.

Таким образом, предлагаемый способ имеет следующие преимущества:

5 1. Позволяет упростить технологический процесс: сократить время выделения целевого продукта с 12 до 3-4 суток, исключить многостадийность, 10 установить необходимость использования больших емкостей, позволяет проводить выделение лизоцима без охлаждения.

2» Использовать для выделения целево15 го продукта отечественный дешевый сорбент, 3. Сократить рабочие площади.

4. Позволяет умен ь шить солевой соста в сточных вод.

20 последовательным пропусканием через силохром СХ-ЗВ, предварительно уравновешенный стартовым растврорителем, в качестве которого используют 0,6-1,4 -ный раствор аммиака, раствора белка и снова стартовго растворителя с последующей элюцией лизоцима смесью 0,8-2,0-ного раствора уксусной кислоты с 0,1-0,3 M хлористого натрия, после чего раствор лиэоцима подвергают концентрированию и диафильтрации на полых волокнах.