5-аргиниламинонафталин-1-(алкоксиэтил)сульфонамиды в качестве субстратов для анса-анализа ферментов, обладающих аминопептидазной активностью

 

Использование: в качестве субстратов для АИСА анализа ферментов обладающих амиполептидной активностью Сущность изобретения. 5-аргинил(амино)-нафтллин-1- (алкоп ттитГсул Л1д-1 Н(нафталин)30 N(H)CH2CH2-0-R, где R - метил, эгил пропил, изопропил, изобутил, метоксиэтип, этоксиэтил Реагент 1. бензилоксикарбонил-apiинил. Реагент 2. соответствующий бромгидрэт амиионафталинсульфамиц Условия реакции при охлаждении в ДМФА 4 табл.

(sПs С 07 С 311/36, 311/40

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

С) С)

C), ЬЗ о 4

Аг9 МН

$О МНСН2СН ОР, Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4951823/04 (22) 28.06,91 (46) 07.09.93, Бюл. Иг 33-36 (71) Институт молекулярной генетики РАН (72) Недоспасов А.А„Шарина И.Г, (73) Институт молекулярной генетики РАН (54) 5-АРГИНИЛАМИНОНАФТАЛИН-1-(АЛКОКСИЭТИЛ)СУЛЬФОНАМИДЫ В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТОВ ДЛЯ АНСА-АНАЛИЗА

ФЕРМЕНТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АМИНОПЕПТИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к области органической химии, конкретно к химии замещенных аминонафталинсульфонамидов, применяемых, например, в качестве субстратов при хроматографическом анализе ферментов, Изобретение может быть использовано в химической промышленности для получения замещенных 5-аминонафталин-1-сульфамидов и в биохимии при анализе аминопептидаз, Известны 5-аргиниламинонафталин-1сульфонамиды с углеводородными радикалами в сульфпнамидной группе, применяемые в качестве субстратов для определения ферментов, обладающих аминопептидазной активностью.

Недостатком известных соединений является их малый ассортимент, в то время как для дифференцированного определения индивидуальных ферментов с аминопептидазной активностью, находящихся в природных источниках в смеси, требуется большое разнообразие субстратов, Известен как субстрат для ферментов с аминопептидазной активность о 5-аргани. RU „, 2000297 C (57) Использование: в качестве субстратов для АИСА-анализа ферментов, обладающих ами»опептидной активнос1ью. Сущность изобретения; 5-аргинил{амино)-нафталин-1(anno- си)>тил(.п> л и> " """>. " "-ДН(нафтали»)ЯОг М(Н)СН2СН2-O-R, где R — метил, зтил. пропил, изопропил, изобутил, метоксизтип, этоксиэтил. Реагент 1: бензилоксикарбонил-аргинил. Реагент 2: соответствующий бромгидрат аминонафталинсульфамид. Условия реакции: при охлаждении в

ДМФА. 4 табл. лами нонафталин-1-сульфон .1лморфолин, Недостатком данного соединения является то, что оно лишь незначительно расширяет ассортимент субстратов для определения ферментов с аминопептидазной активностью.

Цель изобретения — расширение ассортиме»та субстратов для определения ферментов, обладающих аминопептидазной активностью.

Цель достигается тем, что в качестве субстра гон для определения ферментов, обладающих аминопептидазной активностью, предло>кены 5-аргиниламинонафTàl>èí-1(anêîêñèýTèn)-сульфонамиды общей >ормулы где R — метил, атил, пропил, изопропил, изобутил, ме1оксиэтил, этоксиэтил.

2000297

i >0<1 воздействии определяемых фер,",е I гов»3 гглесь предпоже>!ных новых суб Р, ГГ-В ><Роl<0...<)ДИГ От>ЦЕПЛЕНИЕ 3Р<ИНИПЭ С ()Г>,"3:>с в»ни:;. I 5-BминонэфT»пин-1-(элкок.<<э и, улье >н(>мидов. которые, разл 143/i -L .i/3;,i<-.0<игепями с су/>ь>1>онэл1идной

i; i. О!)Л3Д 3>ОТ СХОДНЬ>МИ СПЕК) Рэл ЬН ЫМИ

-"-Р<>СТ)1К3МИ, >10 P33>t<1«Н<0<1 ХООМ3ТОГ.)? ><Од>)ижностьк), что позволяет

/;.",ф Fir.:Н>,ИРОВДННО ОПРЕДЕПЯтЬ, ИС:;>>г) .<»тогрг>ф<л«егкие ме<оды. Тем

<-3r;, г. i ., >Яг "-;,Г . СЯ <30:3, 1(.»КНО< T\ VOЛИЧЕСГ с;::><с> u»i! Деп<лть г>рг>дукты <;рс))еолизэ

>.3+ дс>г ) и:) гу<>,.тГ)с) !О>). <>OI>0>) t.;3) <.I.tü<х инди>-.;,<,П;,НО 13"„,М,)0>l ДП УI>PП>1 Г)НИЯ ТОЧ,<г °;;. г;:>i<Ð,r./p»lis> <<<г<„ <<(я<с(<с«б/1изкои

"-.r ill>< I »,(i lrt)0F»! i1и1л впзгл10жнО бсьц! ;> . >и< . i(i cr)<бг т Г)<3 < Ов, имг; K) lit!1x спект

Р П».(С < . ОД>>1, ". > n (1/)З/>>Л«<11<Ы . XPC I .. KHMÈ K<РУЕМЫЕ

i I r< i)< > .> (Г> р< >дуKT >1 г Гг(<теолиээ)

ВОF. > < (<3>. г>г>/3»«åí>)h>p 3/>«>3/<лемь<е вег*,,/i были си»1 зирс>вэны конденсацией lli > < <1>», 60>« ">3< 3 3<1<1>>0><3

,,:- f >11<1,< ...I П 1<»Г>! >, iIc . .е iopy.

:!, .. < 1:»,. r iri 01«с>г >«.>я 00 у Г ./>< >< i И 3>>г : i>!i>><. 1 Г>i)I>0>Л»МИ. ,"<« г г = .i r.l эл> .1>-<гг! ><)>l i )1дэзы 13(.illeOTBA г>г> >< . » (» и/)рг).iü13>ободнь<х»p, <. Hill<) < FlI1инон3фтл,>и>>суп>,фэ!л<<дэ. Г1о с/>!:Д><ии Об>От хром»т011) l(f>и

«Pr КИ

П р и M P р I. Синтез 5-(кэрбобензокси)аминонафтэлин-1-(дим(типен)суп ьфонэми дэ (проме>куточ><ое).

5,04 г (0,04 моль) 5-(кэрбобензокси)-эминонафтэпин-1-сульфохлорида при перемешивэнии нд MBIHèTHoé мешэлке рэгтворяют в 200 мл мегэнопэ, добэвпяют 3,7 мп (0,04 моль) Триэгипэминэ и 1,72 гл/! (0.04 моль) эзиридинэ (э)иленимина). Через 30 мин начинается выпэдение белого осадка. Перемешивэние продолжают в те«ение 2 ч. Зэтегл осадок отфильтровывают нэ вакуумном фильтре, промывают метэнолом, сушат нэд

КОН. Получают 5,01 г бесцветных кристаллов, с т.пл. 107" С, выход 92,2 ", При использовании в качестве растворителя этэнола выход 91 .

Пример 2. Синтез 5-(кэрбобензокси)аминонэфтэлин-1-(метоксиэтил)сульфонэ мида рэскрытием азиридинового цикла (промежуточное).

5 г 5-(карбобензокси)-аминонафталин1-(диметилен)сульфэмида и 1 мл эцетэта

ВГз е 150 мл абсолютного метанола кипятят в плоскодонной колбе с обратным холодильником. Через «ас охлаждают до комнатной температуры, добавляк)1 воду до появления

55 белой суспензии и оставляют стоять нэ ) « при температуре 10"C. Выпэвший осадок отфильтровывают, промыва>о1 на фильтре водой, сушат нэд КОН. Получэют 5,01 r бесцветных кристэллов с т.пп. 144"С,выход

92,2, Аналогичным способом были получены

5-(кэрбобенэокс<1)-эминон»фтэпин-1-(элкок сиэтил)супьфонэмидь< соотлетствен><О из этилового, п-пропилового, i-пропилового, iбутипового спиртов (см. табл,1).

Пример 3. Син)ез 5 (>г»рГ)обензокси)3МИНОНафтэЛИ><- 1-(З,Г>-д< ()K(.3>el)iÈ/,)Ñó/t(,.frîнэмидэ рпскрытием эзирид»куто <ное).

4 г 5-(кэрбобензоксv)»<4!1>to><»rfr,пи><-1(диглетипен)сульOHBM<1дэ г 1 0 лп ° .г>т<1/>целпозоп ьна «э грев»к>1 е Il/>00>."i/toll <0é колбе с обрэтным холод<1лы>>1кол1 и» кипящеи водяной бане. 1 мп эцетзг» Г3Г-3 Добэпляют е p330< pe Tylo смесь через 20 /alt<< смесь

ОХЛ 3ЖДF) >0), Д063 e/1 >1>01 !1 1 6 I-! г О >. В rj< Lr ДГ> расслоения смеси, Верхи,00 добавп>1ют 2 г ЛKòèF!èðîe»>III<ог<) угля, пpрг.:ме

II)ÈÂ3K) Т, 01, Л1 > Г»I<ОП <»СТИ«I<0 уПарИВЛ>ОТ. +063(3/>SIIOT НЕС;КОПЬК» К»ПЕПЬ г:Од ь до с! О >3 в /! с< > < и я б е /! 0 и !Ту (; l1 (г < 3 и и < 1 0 (т и в ляЮТ Стс.я)ь пр,l 10 С, Г»>,<п/3>3дпк

ОтфИЛЬтрОВЫПЗЮт, СQIJIBT Il»,r, F F.>Í. ПОЛУ <3ют 4,22 г бесцвет>н; Kpli<:!.>и I0i г. <.г>л.

64" С. в hl Ход 00, Анэлогичным способом бып гн)пучен 5(кэрбобенэокси)-эминонэфтэп ин-1-(3,6-ди оксэоктип)сульфонэмид иэ эт>лпцеплозопь ва.

Пример 4. Г1олучение бГ)с)л1! <1дрэтэ

5-эл1инонэфталин-1-(метокси)т(1/!)су/>ьфог<3мида.

7,04 г (0,016 Monb) 5-(к;)p6!OF>PIэ i ил)супьфо намида перемешивэк>т нэ»>а<нитной мешалке с 17 л1Л (0,051 моль НВ<) 3<ГЛ рэстворэ

НВ1 в УксУсной кислоте, ЧеРез 2 ч вь г> iellrl1

Полу«3>от 6,05 r продукта, выход 98,67 >.

Аналогичным обрэзогл снимают карбобензоксипьную защиту у всех остальных полученных производных 5-3M33(f>TBлин-1-(алкоксиэтип)сульфонэглидов с получением бромгидрэтов соответству>ощих аминонафтэпинсульфонэмидов (табл.4).

Пример 5. Получение 5-эргинипэминонэфтэлин-1-сульфонэмидов.

Нэвеску сухого кэрбобенэокси-эргинина (Z-эргинин) (40 ммоль) pe(.творяют при осторожном нагpP<33>дно<о диметилформэмидэ. В Трех<орпои колбе с

2000297

Arg — ИН

Н

l магнитной мешалкой, низкотемпературным термометром и хлоркальциевой трубкой охлаждают до -30 С 30 мл ДМФА и при перемешивании приливают в один прием 4 мл тионилхлорида. Температура быстро поднимается до -15 С. Убирают охлаждение и дают нагреться до комнатной температуры, снова охлаждают до -30 С и вливают в один прием предварительно охлажденный ранее

Z-аргинин, перемешивают в течение часа при 0"С. Навеску бромгидрата соответствующего аминонафталинсульфамида (20 ммоль) растворяют в ДМФА, добавляют 120 ммоль пиридина, полученный раствор вводят в реакционную смесь при охлаждении ниже -5 С, продолжают перемешивание 2 ч при охлаждении и затем еще несколько часов при комнатной температуре. За ходом реакции наблюдают при помощи ТСХ. После исчезновения нэ хроматограмме пятна исходного аминонафталин сульфонамида (АНСА) при перел1ешивании добавляют 250 мл этилацетата, а 300 мл гексана, оставляют раствор стоя гь при 4 "С до тех пор, пока он не просветлеет. Раствор сливают. остаток промывают 3 раза смегью этилацетат гексан, растворяют в 0.5 л воды и четырежды зкстрагируют бутанолом(40-40-40-40 мл), водную фазу отбрасывают, бутанольный слой промывают водой, 4 раза по 10 мл

5 МаНСОз, снова водой. упаривают в вакууме досуха, сушат в вакууме. К остатку добавляют 50 мл 3 М раствора НВг в уксусной кислоте, колбу закрывают хлоркальциевой трубкой и перемешивают, наблюдая за снятием защитной группы с помощью ТСХ.

По завершении реакции в колбу при интенсивном перемешивании вливают 200 мл сухого эфира, дают осесть осадку, жидкость сливают. осадок промывают эфиром еще трижды, растворяют в 500 мл воды. экстрагируют этилацетатом. нейтрализуют NaOH до рН 8,4, затем четырежды экстрагируют бутанолом по 30 мл, упаривают на роторном испарителе. остаток растворяют в спирте 20 мл, добавляют по 3 г активированного угля и инфузорной земли, перемешивают, фильтруют и упаривают досуха.

Продукт получают с выходом 12-220 из расчета на вступивший в реакцию AHCA.

Полученный продукт хорошо растворяется в полярных растворителях (воде, спирте) и плохо в неполярных (этилацетате, гексане).

Таким образом были получены субстраты: аргинил-5-аминонафталин-1-(метоксиэ тил)сульфамид, 5

55 аргинил-5-аминонафталин-1-(этонсиэт ил)сул ьфамид, аргинил-5-аминонафталин-1-(пропиок сиэтил)сул ьфамид, аргинил-5-аминонафталин-1-(изопроп иоксизтил)сульфамид, аргинил-5-аминонафталин-1-(изобуток сиэтил)сульфамид, аргинил-5-аминонафталин-1-(диоксаге птил)сул ьфамид, аргинил-5-аминонафталин-1-(диоксаок тил) .ул ьфамид (см. табл.2 — 3), Пример 6. Составляют эквимольную смесь семи Arg-АНСА-субстратов В 1 мл раствора содержится по 2 о.е. ((-300 нм) каждого из субстратов, 0,166 мл трис-HCI, 0,2 M буфера рН - 7,2. В пробирку типа

Еррепдог1 помещают 500 мкл смеги, добавляютт 30 л1кл раствора лейцинаминопептидазы, перемешивают, выдерживают до исчезновения голубой фп ллойд ц н.рл ° чри 25"С, добавляют 500 мнл экстрагента этилацетат — гексан (в соотношении 2:1), перемешивают и разделяют фазы путем центрифугирования. (Лз верхней фазы отбирают 10 мкл, высушивают на воздухе. Остаток растворяют в 30 мкл ацетонитрила. отбирают аликвоту

20 мкл и детектируют продукты протеолиза с помощью ВЭЖХ. Все продукты протеолиза имели л1аксил1умы и минимумы поглощения, а так же врел я удержания в колонке, соответствующие данным, представленным в табл.2.

Таким образом. продукты протеолиза, поученные при воздействии лейцинаминопептидазы на смесь субстратов, представленных новыми соединениями удается дифференцировать методами ВЗЖХ, Формула изобретения

5-Аргиниламинонафталин-1-(алкоксиэтил)суль >онамиды общеи формулы О И O-R, где R — метил. атил, пропил, изопропил, изобутил, метоксиэтил, этоксиэтил, в качестве субстратов для АНСА-анализа ферментов, обладающих аминопептидазной активностью.

2000297

Таблиця1

Физико-химические свойства 5 — (карбобенэокси) аминонафталин- 1 -сульфонамидов

Z* — Карбобензоксильная защитная группа.

Таблица2

Свойства 5-(аргинил) — аминонафталин-1-сульфонамидов

2000297

Продолжение табл, 2

*Колонка CGC Сепарон $6Х18детекция по УФ 254 нм, P=85 Bar элюэнт 35 ацетонитрил и 0,05М ацетат аммония, скорость элюции 0,56 мл/мин

ТаблицаЗ

2000297

Продолжение табл, 3

*- Выход дан на вступивший в реакцию АНСА.

Табл ица4

5 — (карбобензокси) аминонафталин-1 — сульфамиды; спектры ЯМР протонов

ЯМР протонов

3,10 (2Н) 3,15 (3H) 3,18 (ЭН) 3,32 (2Н)

5,27 (2Н) 7,49 (5Н) 7.60-7,84 (ЭН)

8,10 (1Н) 8,22 (1Н) 8,42 (1Н)

8.88 ДН) 9,83 1Н) 1,04 (ЭН) Э,1 (1Н) 3,29 (2Н) 3,34 (2Н)

5,32 (2Н) 7,30-7,61 (5Н) 7,61-7,91 (ЭН)

8,12 (1Н) 8,24 (1H) 8,41 (1Н)

8 58 1H} 8,86 L1H

0,86 (ЭН) 1,44 (2Н) 3.12 (2Н) 3,21 (2Н)

3,36 (2Н) 6,32 (2Н) 7,52 (5Н) 7,76 (ЭН)

8,12 (1Н) 8,26 (1H) 8,42 (1Н) 8,61 (1Н)

988 1Н

1.02 (бН) 3,09 (2Н) 3.34 (2Н)

3,25-3,60 (1Н) 5,32 (2Н) 7.38-7,60 (5Н)

7,60 — 7,91 (ЭН) 8,10 (1Н) 8,25 (1Н)

8.42 1Н 8.88 (1Н) 987 (1H

0,91 (6Н) 1,73 (1Н) 3.10 (2Н) 3,16 (2Н)

3,41 (2Н) 7,39-7,63 (5Н) 7,63-7,94 (3H)

8,15 (1H) 8,27 (1Н) 8,46 (1Н) 8„61 (1Н)

989 1Н

3,12 (2Н) 3,30 (3H) 3,32-3,60 (6Н)

5,32 (2Н) 7,38 — 7,65 (5Н) 8.12 (1Н)

7,65 — 7,91 (ЭН) 8.24 (1Н) 8,41 (1Н)

8,57 1Н 9,86 1Н

13

2000297

Продолжение табл 4

Составитель А.Недоспасов

Техред M.Moðãåíòàë Корректор М.Ткач

Редактор Т,Пилипенко

Заказ 3063

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

5-аргиниламинонафталин-1-(алкоксиэтил)сульфонамиды в качестве субстратов для анса-анализа ферментов, обладающих аминопептидазной активностью 5-аргиниламинонафталин-1-(алкоксиэтил)сульфонамиды в качестве субстратов для анса-анализа ферментов, обладающих аминопептидазной активностью 5-аргиниламинонафталин-1-(алкоксиэтил)сульфонамиды в качестве субстратов для анса-анализа ферментов, обладающих аминопептидазной активностью 5-аргиниламинонафталин-1-(алкоксиэтил)сульфонамиды в качестве субстратов для анса-анализа ферментов, обладающих аминопептидазной активностью 5-аргиниламинонафталин-1-(алкоксиэтил)сульфонамиды в качестве субстратов для анса-анализа ферментов, обладающих аминопептидазной активностью 5-аргиниламинонафталин-1-(алкоксиэтил)сульфонамиды в качестве субстратов для анса-анализа ферментов, обладающих аминопептидазной активностью 5-аргиниламинонафталин-1-(алкоксиэтил)сульфонамиды в качестве субстратов для анса-анализа ферментов, обладающих аминопептидазной активностью 

 

Наверх