Штамм гриба trichoderma reesei - продуцент целлюлолитических ферментов

 

Использование: в микробиологической промышленности и касается нового штамма- -продуцента внеклеточных цеплюпаз, используемых в пищевой промышленности, спиртовой и пивоварении, для экстракции растительных внутриклеточных вещеав для силосования кормов Сущность изобретения: получен штамм-продуцент с повышенной продуктивностью, позволяющий при одностадийной ферментации обеспечить высокую активность фермента в ферментационной среде при высоком выходе фермента с единицы массы использованного субстрата Мутант Trichoderma reesei BCM 182/КК (ВГНКИ-28) получен с помощью парасексуальных процессов из исходной культуры T/eesei krtet 43803. Мезофипек Оптимальная температура роста мицелия 32° С. оптимум образования целлюлозы 28° С. Штамм имеет ферментные системы, позволяющие расти на целлюлозе, крахмале, хитине , пектине, ксмлане, паминарине, лихенине. Способен утилизировать молочную кислоту. Катабопитная репрессия биосинтеза цеплюлаз практически отсутствует . При росте на среде, содержащей 1% аморфной целлюлозы, относительная активность цеппюлаэ не изменяется при внесении в среду до 5% глюкозы или 5% глицерина При культивировании на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома достигается уровень активности в 3,5 - 42 ед/мл FPA (время культивирования 110 ч), при культивировании на лактозе - 18J2 ед/мп (81 ч), при культивировании на концентрированной молочной сыворотке - 12 - 14 ед мл (100 - 110 ч) 2 табл.

ОПИСАНИЕ N305PKTKHNSI

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5027083/13 (22) 19.1291 (46) 30.1093 Бюл Na 39-40

РЗ) Синицын Аркадий Пантелеймонович (54) ШТАММ ГРИБА (TRICHODERMA REESEl> — ПРОДУЩМТ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (57) Иатользование: в микробиологической промышленности и касается нового штамма- -продуцента внеклеточных цеппюпаз, используемых в пиЫ Ю для экстракции раститепьйых внутриклеточных веществ дпя силосования кормоа Сущность изобретенитс rNlvpl6H штамм-продуцент с fl08blLUeHHGQ продуктивностью, позволяющий при одностадийной ферментации обеспечить высокую е(тивность фермента в ферментационной среде при высоком выходе фермента с единицы массы использованного субстрата Мутант Trichoderma reesei ВСМ 182/КК (ВГНКИ-28) получен с помощью парасексуальных ()9) R (и) 2 0194 91 (51) И 1 14 С1XN9 4Х процессов из исходной культуры Txeesei (п И

43803. Мезофипен. Оптимальная температура роста мицелия 32 С, оптимум образования целлюлозы 28 С. Штамм имеет ферментные системь1 позволяющие расти на целлюлозе, крахмале, хитине, пектине, ксилане, ламинарине, лихенине. Способен утилизировать молочную кислоту. Катвболитная репрессия биосинтеза целлюлаз практически отсутствует. При росте на среде, содержащей 1% аморфной целлюлозы, относительная активность целпюлаз не изменяется при внесении в среду до

5% глюкозы ипи 5% глицерина. При культивировании на жидкой питательной среде на основе саекповичного жома достигается уровень активности в

3,5 — 42 ед/мл FPA (время культивирования 110 ч), при культивировании на лактозе — 182 ед/мл (81 ч). при культивировании на концентрированной молочной сыворотке — 12 — 14 ед мп (100 — 110 ч). 2 табл

2001949,лабавлс-.i eì биатина при непрерывной ф" регента,ии достигается активность цел алаз 17 ? ед/мл FPA (здесь и далее пб

:екс : " А" — акти чо.ть целлюлаэного 50 ..амплекса, определенная по фильтровальчай бу а; е и еыреженная в международных е.иницах согласна рекомендациям IUPAC:

Т К."паве., Pure ana Appl, Chem., vol.

59,iso.2 ар. 257-268), что соответствует вы- 55

::аду 21 ° ед г РА на 1 r целлюлаэы.

,1= ".- -.ы мутанты T.reesel. каарые г:ри использовании в качестве источника углерода глюкозы образуют целлюлвзы, С not- ощь о л утанта Т.reesel VTT-9-79t25 на

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма продуцента внеклеточных целлюлаэ и других ферментов, лиэирующих клеточную стенку. Получаемые целлюлазы и/или мультиферментные комплексы могут быть использованы для биодеградации целлюлоза- и гемицеллюлоэосодержащих субстратов, в том числе отходов промышленности и сельского хозяйства, для биодеградации живых и мертвых клеточных стенок растений, использоваться в качестве добавок в кормах, а также в пищевой промышленности, спиртовой промышленности и пивовврении, для экстракции растительных внутриклеточных веществ, для силосования кормов в сельском хозяйстве.

Известны штаммы - продуценты целлюлаз и способы их аэробного культивирования.

Известные способы различаются главным образам видами применяемых штаммав грибов, субстратами, используемыми для ферментации, и условиями проведения процесса. Стоимость полученных ферментов главным образам определяется уровнем активности целлюлаз в ферментационной

- еде каржью (поадуктивнастъю) обра"оваии ферментов. выходом ферментов с един: ;,ы массы использованного с бстрата, с сv; . ею субстра1з.

iU ел мы грибов рада Trichoderma явля-! .,icл наиболее активными продуцентами цел::алаэ. цельн 1;авышения их способности к лрадукц. и целлолаз и адаптации к

Салее,лешев: IM средам были получены различи; е мутант Т.reesei, Например, в авт. св. СССР М 591502 и М 745933 описаны штаммы Trlcholderma vlride "6-7" и "44", .. редназначенные преимущественно для куг;ьтивирааания на средах на основе свекловичного жома В патенте США М 4472504 списана получение целлюлаз мутантом

T.reesei MCG 80, который получен из мутанта T.reesel ВитСЗО, При использовании питательнай среды с 8$ HQA целлюлозой и

45 питательной среде, содержащей 4 глюкозы и 47 твердого остатка зерна после этэноль ной ферментации, достигалась целлюлаэная активность 6,4 ед/мл РРА. Если вместо глюкозы применялась целлюлоза, то достигалась примерно та же активность целлюлаэ (Материалы 3-го Европейского конгресса по биотехнологии, Мюнхен, ФРГ, 10 — 14.09.84: М.Ballz.

Cellulase production by Mutant strains of

Trlchoderma reesel on non-cellulosic media).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является мутант Т.reesel 1МЕТ 43803 (патент ГДР

00 291673), который обеспечивает высокую продуктивность по целлюлаэам и высокий (до 10 ед/мл FPA при культивировании на лактозе) уровень активности целлюлаэы вследствие частичного уменьшения катэболитной репрессии биосинтеза ферментов.

Этот штамм характеризуется следующими признаками. Культивируется типичным для всех штаммов Trlchoderma образом (например, нэ картофельно-декстрозном агаре или на агвре споруляции). Агар Чапека-Доукса не подходит, т.к. использование нитратов как источника азота данным штаммом не осуществляется, Температурный оптимум куль -эирг.алания 28-30 С, время культивирования 5-6 сут. плюс 5-7 сут при комнатной температуре до полного развития штамма. i lepecee;now с помощью конидий, цвет кочидий:,еленый, изначально желто-эе ен и При:.ультивировании на картофельно-декстроэном агаре после 5-6 сут роста диаметр колонии 70-80 мм. Колонии рыхлые, концентрические.

Мутант является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лэктозу, глицерин, ксилоэу, Фруктоэу в комбинации с аморфной цел: юлоэой.

Целью изобретения является получение высокоактивного дерепрессированного штамма — продуцента целлюлаэ. пригодного для культивирования на дешевом сыще в присутствии высоких концентраций сахаров, в том числе на молочной сыворотке, и обеснечивающего высокие уровень активности целлюлаз в фсрментационной среде и выход ферментов с единицы массы использованного субстрата.

Сущность изобретения заключается в том, что для достижения поставленной цели получен мутант с повышенной продуктивностью, паз лляющий при адностадийной фер. ;ентаци ". обеспечить высокую активность фермента E ферментационной среде при высоком выходе фер ента с единицы массы использованного субстрата. При этом в процессе ф .рментации скорость абразова2001949

2 (, фруктозы, или 2 глицерина. Слой мицелия существенно тоньше. чем на картофельном агаре, диаметр колоний 70 — 80 мм, 40 конидии образуются через 4 сут роста, споруляция слабая. выделение пигмента не наблюдается. Через 10 — 12 сут. роста колония занимает всю поверхносгь чашки Петри.

Минимальная среда с 1 ф,-ной аморф- 45 ной целлюлазой. Мицелий тоньше, более рыхлый, пигмент в среду не выделяется. Через 4 сут. роста диаметр колоний 70 — 80 мм.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых суб- 50 стратов (глюкоза, фруктоэа, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий без пеллетиэации, удельная начальная скорость роста мицелия составляет 0,3 ч, в

-1 конце культивирования 0,1ч, 55

-1

<Эизиолого-биохимические признаки.

Меэофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32 С (30-34 С), оптимум для обраэовачия целлюлазы 28 С(26-30 С). Оптимальный рН роста и секреции целлюлаз ния ферментов сохраняется постоянной и высокой, а для культивирования мутанта используются дешевые субстраты.

Мутант Т.reesel ВСМ 18.2/КК получен с помощью парасексуальных процессов иэ исходной культуры T.reesel IMET 43803. В результате трехступенчатой селекции с последующим отбором клонов, Мицелий септирован и сильно раэветвлен, формируются после 30-32 ч роста в виде боковых ответвлений гиф, На комплексных средах агара (картофельно-декстрозный агар, агар для споруляции, СМ-агар) колонии растут быстро, До начала споруляции (2 сут.) колонии белые (прозрачные), плоские, с гладкой поверхностью, В дальнейшем образование конидий (фиалоспор) происходит после слабого индуцирования видимым светом, и на 3 сут колония приобретает зеленоватую окраску.

Образование воздушного (объемного) мицелия не наблюдается.

СМ-агар. Через 5 — 6 сут роста при 30 С диаметр колоний около 40 мм, колонии достаточно плотные, компактные, концентрические. с неровными краями, наблюдается выделение в среду желтого пигмента. Прорастание на всю поверхность чашки Петри не происходит.

Картофельно-декстрозный агар. На 5-6 сут роста диаметр колонии 70 — 80 мм, Колонии более рыхлые, конценгрические, неровность краев менее выражена. Наблюдается слабое выделение желтого пигмента в среду. Через 10 — 12 сут. роста колония занимает всю поверхность чашки Петри.

Минимальная среда с 2 глюкозы или

3 5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при р Н

2,5, но образование целлюлаэ не происходит.

Реэистенция к нистатину слабая. При повер;.ностном культивировании устойчив до концентраций 0,5 мкг/мл, при концентрации 2 мкгlмл рост полностью подавляется. При добавлении в среду дигитонина (4 мкг/мл) или бенгальского розового (30 — 50 мкгlмл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилоэу, О-маннит, маннозу, трегаллоэу, L- и О-арабинозу. сорбозу. сорбит, 2-деэокси-D-глюкозу (в присутствии гл1окозы), рибоэу, деэоксирибозу (в присутствии глюкозы), 5-тио-D-глюкозу (в присутствии глюкозы и 2-дезокси-О-глюкозы).

ke ассимилирует: 1-рамноэу. О-глюкозамин, 2-дезокси-О-глюкозу, дезоксирибозу, дезоксигалактоэу, 5-тио-О-глюкозу, Использует аммонийную и белковую формы азота, не использует нитратную форму.

Имеет соответствующие ферментные системы. позволяющие расти на целлюлозе, крахмале, хитине, ксилане, ламинарине, лихенине. Способен разжижать желатину.

Способен утилизировать молочную кислоту (быстрее, чем лактоэу) при концентрациях ниже ингибирующих.

Катаболитная репрессия биосинтеза целлюлаз практически отсутствует. Проверка катаболитной репрессии биосинтеэа целлюлаз заключается в следующем.

Конидии пересеваются в пробирку с минимальной средой. содержащей аморфную целлюлозу и исследуемый репрессор или антиметаболит. Диаметр пробирки — 9 Mh1, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирка инкубируется 96 ч при 30 С и 20 ч при 45 С.

Мерой уровня биосинтеэа целлюлаэы является глубина расщепления целлюлазы в пробирке.

Табл. 1 показывает действие антиметаболитов и легко утилизируемых субстратов на образование целлюлаз.

Trichoderma reesel ВСМ 18.2/КК культивируется в аэробных условиях методом глубинной ферментвции в питательной среде, содержащей один или несколько субстратов — индукторов биосинтеза целлюлаз и/или образования ферментов. лизирующих клеточную стенку. Задача может достигаться и в случае наличия в питательной среде субстратов, не являющихся индукторами. Мутант способен при подходящем проведении процесса на основе использования растворимых субстратов, например глюкозы или

2001949

Пример 1. Культивирование осуществляют на жидкой питательной среде следу- 30 ющего состава: 40 г/л свекловичного жома;

14 г/л солодовых ростков, 6 г/л (NH4)2SO4;

2 г/л КН Р04; 0.6 г/л Mg$04 7Н20; водопроводная вода рН 5,4.

Засев ферментационной среды осущвст- 35 вляют водной суспенэией конидий культуры, выращенной на картофельно-декстрозном ага ре из расчета 10 конидий на 100 мл среды.

Процесс ферментации проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл при объ- 40 еме среды 100 мл на качалке при 30 С и 200

o6/мин.

Через 110 ч культивирования уровень активности составляет 3 5-4,2 ед/мл по фил ьтровальной бумаге. 45

Пример 2. Культивирование осуществляют на жидкой питательной среде следующего состава:

20,0 г/л молочного сахара (96 лвктозы); 3,0 г/л KHzPO4; 4,8 г/л (йН4)г$04; 0,4 50 лактозы, выделять в культуральную среду полный ферментный комплекс целлюлаэ.

Характерным и отличительным признаком штамма является состав внеклеточных белков. определяемый поданным изоэлектрофокусирования в поливкриламидном rene в диапазоне рН 3,0-10,0 (готовая пластина фирмы "Серва", ФРГ, краситель — Кумассси 6-250), табл. 2.

Примеры использования атвммв

Trlchoderma reesel ВСМ 18.2/КК для получения целлюлолитических ферментов.

Для получения исходного посевного материала культуру штамма выращивают нв картофельно-декстроэном вгаре при 30 С в течение 6-8 сут.

Приготовление исходного посевного материала возможно и нв сыпучей среде следующего состава. r:

Свекловичный жом 190

Солодовые ростки 150

Пшеничные отруби 410

Водопроводная вода 750

В каждую из колб объемом 750 мм вносят 25-30 г указанной среды и культивируют при 30 С в течение 5-6 сут беэ перемешивания.

25 г/л М9$04 х 7Н20; 0.4 г/л СаС! ; 30 г/л экстракта пшеничных отрубей (3 ф); 4,0 r/n целлюлазы микрокристаллической; 5 мг/л

FeS04 х 7Н20; 1,6 мг/л М9$04 х 7Н20;

1,4 мг/л Zn$04 х 7HzO; 2.0 Mr/ë CoS04 х

7Н20.

Начальное значение рН 5,45.

Процесс ферментации проводят в ферментере объемом 200 л при 30 С. Рабочий объем ферментера в начале ферментации

110 л, к 81 ч 150 л. Режим ферментации— дробное добавление лактозы; начальная концентрация лактоэы 20 г/л, после утилизации лактозы на начальной фазе ферментации (после 24 ч) уровень лактоэы контролируется автоматически и поддерживается постоянным на уровне 1 — 3 / . Общий расход лактозы за время ферментации (81 ч) составляет 44,8 л раствора концентрацией 20$.

Уровень активности составляет 18,2 ед/мл FPA при времени культивирования

81 ч. Это соответствует выходу 245 ед. FPA с 1 г лактозы.

Пример 3. Культивирование осуществляют на среде и условиях, аналогичных описанным в примере 2, однако вместо раствора лактозы используют концентрированную молочну.о ыворотку с содержанием лактозы на урпвн 20 и с предварительно отделенными 6<-.. " . ми сыворотки путем нагрева и коагуляции или путем ультрафильтрации.

Уровень акт вности зависит от концентрации молочной кислоты в сыворотке и составляет 10-14 ед/мл п.ри времени культивирования 100 †1 ч. (56) Авторское свидетельство СССР

N. 591502, кл, С l2 и 9/42, 1978.

Патент CU А Ч. 4472504, кл. С 12 N 9/42, опублик. 1984.

M.Ba8z, Се lulаse production by Mutant

strolns of Trichoderma reesel on noncellulosic Мейа.

Материалы 3-го Европейского конгресса по биотехнологии Мюнхен. ФРГ, 1014.09.84, Патент ГДР М 291673, кл. С 12 N 9/42, опублик. 1991.

2001949

Таблица 1

Репрессия образования целлюлаэ субстратами/антиметаболитами: относительная активность целлюлаэ (в мм расщепленной целлюлозы) при росте на 1ф-ной аморфной целлюлозе

Н.P.— íåò расщепления.

Таблица 2

Спектр характеристических внеклеточных белков Trlchoderma reesei

ВСМ 18.2/KK при культивировании на лактозе в условиях примера 2.

2001949

Продолжение табл. 2

Составитель А, Синицын

Техред М.Моргентал Корректор В. Патрушева

Редактор Л. Павлова

Заказ 3156.Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035. Москва, Ж-35. Раушская наб,. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Формула изобретения

Штамм гриба Trlchoderma reesel ВГНКИ28-продуцент целлюлолитических ферментов.