"способ получения препарата "протолизин" из коммерческого препарата "протосубтилин"

 

Использование, в офтальмологии для лечения внутриглазных кровоизлияний различной этиологии и локализации и помутнений стекловидного тепа, а также в биохимической практике в качестве аналитического реагента Сущность изобретения способ заключается в экстракции ферментов из коммерческого препарата Протосубтилин. отделений балластных веществ обессоливании ферментного раствора , ионообменной хроматографии на карбоксиметилцеплюлозе, ультрафильтрации, осаждений протеиназы ацетоном и лиофилизации Разработаны оптимальные условия проведения процесса очистки, позволяющие на стадии ионообменной хроматографии получить протеолитическую фракцию , свободную от примеси посторонних ферментов , с выходом по активности 49 - 50% Конечный продукт Протолизин представляет собой белый или светло-бежевый амфорный порошок, растворимый в воде и изотоническом растворе хлорида натрия Протеолитическая активность протолизина при действии на казеинат натрия (температура 30 °С) составляет 2,7 - 32 ед/мг белка Зона наибольшей стабильности протеиназы рН 7,0 - 8,0, температура 5-10°С Оптимальные условия действия температура 50°С, рН 7,0 - 7,5 Ингибиторы - ионы тяжелых металлов, металлохелатные агенты Изоэлектрическая точка 83, молм 30,5 - 34,о «Да Препарат катализирует гидролиз пептидных связей, образованных аминогруппами гидрофобных аминокислот , и не действует на пептидные связи образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот, активно расщепляет белки и пептиды, содержащие ароматические аминокислоты 1 зп ф-лы е

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ

ЬЭ

4Р

Ф

ОО

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5048498/13 (22) 1?.06.92 (46) 30.11.93 Бюл. ¹ 43 — 44 (71) Научно-производственное объединение "Биотехнология" (72) Рафаловская ТЯ:, Шишкова ЭА (73) Научно-производственное объединение "Биотехнология" . (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА "ПРОТОЛИЗИЙ" ИЗ КОММЕРЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

"ПРОТОСУБТИЛИН" (67) Использование: в офтальмологии для лечения внутриглазных кровоизлияний различной этиологии и локализации и помутнений стекловидного тела. а также в биохимической практике в качестве аналитического реагента. Сущность изобретения: способ .заключается в экстракции ферментов из коммерческого препарата "Протосубтипин", отделений балластных веществ, обессоливании ферментного раствора, ионообменной хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе, ультрафильтрации, осаждений протеиназы ацетоном и пиофилизации, Разработаны оптимальные условия проведения процесса (19) RU (11) 2ОО3688 П. (51) 5 С12Х9 ОО С ИМ9 56 очистки, позволяющие на стадии ионообменной хроматографии получить протеолитическую фрак— цию, свободную от примеси посторонних ферментов, с выходом по активности 49 — 50%. Конечный продукт "Протолизин" представляет собой белый или светло-бежевый амфорный порошок, растворимый в воде и изотоническом растворе хлорида натрия. Протеолитическая активность протолизина при действии на казеинат натрия (температура

30 С) составляет 2,7 — 32 ед/мг белка. Зона наибольшей стабильности протеиназы рН 7,0 — 8,0, температура 5-10 С. Оптимальные условия действия: температура 50 С, рН 7,0 — 7,5. Ингибиторы — ионы тяжелых металлов, металлохелатные агенты

Изоэлектрическая точка 8,3, мол.м. 30,5 — 34,о кДа.

Препарат катализирует гидролиз пептидных связей, образованных аминогруппами гидрофобных аминокислот, и не действует на пептидные связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот, активно расщепляет белки и пептиды, содержащие ароматические аминокислоты. 1 з.п, ф — лы.

2003688

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментной отрасли микробиологических производств, и может быть использовано при получении очищенных ферментных препаратов для медицины или для применения в качестве биохимических реактивов в научно-исследовательской практике, Данное изобретение решает задачу получения препарата "Пратолизин", представляющего собой высакоочищенную металлапротеиназу, свободную от примеси сппутс гвующих ферментов, Протолизин може быть использован в офтальмологии для лечения внутриглаэных кровоизлияний различной этиологии и локализации и помутнЕний стекловидного тела, а также в биохимической практике в качестве анали ического реагента для изучения структуры белков и пептидов, Приведенные способы получения высокоочищенной протеиназы многостадийны и характеризуются невысокими выходами конечного продукта.

Предлагается способ получения высокоочищенного препарата металлопротеиназы (протол изина) из коммерческого препарата "Протосубтилин", содержащего металлопротеиыазу. а-амилаэу, j3-1,3 — 1,4глюканаэу и другие белковые примеси. Способ состоит в экстракции ферментативного комплекса из протосубтилина, отделении балластного осадка, гель-фильтрации ферментного раствора ионообменной хроматографии, концентрировании методом ультрафильтрации протеолитической фракции, осаждении протеиназы ацетоном и лиофилизации, Для зкстракции ферментов из протосубтилина используют дистиллированную воду или 0,002 — 0,01 M буферный раствор рН 6,27,5, содержащие 0,1-0,5;ь СаС12, необходимого для стабилизации металлопратеиназы и коагуляции балластных белков, Балластные вещества отделяют центрифугированием.

Затем с целью подготовки ферментного раствора к хроматографии проводят его обессоли в ание методом гел ь-фил ьтрации.

Для этого используют колонки с мелкопаристыми сорбентами, имеющими крупные гранулы (например, сефадекс 6-25, молселект

G-25, биогель Р-6).

Гель-фильтрацию осуществляют в среде

0,002-0,01 M буферного раствора при рН

6.2 — 7,5, причем скорость протока ферментного раствора через колонку с гель-сарбентом должна быть в пределах 0,60 — 0,85 мл/см мин, что позволяет получить белког вую фракцию с наименьшим разбавлением, свободную от солей и пигмента.

Ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе проводят в среде того же буфера, что и гель-фильтрацию. С целью максимальной очистки протеиназы ат сопутствующих белков, пигментов и других примесей, а также повышения выхода целевого продукта в процессе хроматографии сарбцию фермента необходимо вести со скоростью протока 0,10-0,15 мл/см мин, а элюцию протеиназы следует проводить

0,18 — 0,22 M раствором NaCI в 0,002 — 0,01 M буфере со скоростью протока 0,15 — 0,35

MR/ñì мин. Проведение сорбции с меньшей

2 скоростью удлиняет процесс хроматографии и приводит к увеличению потерь фермента за счет инактивации. Увеличение скорости сорбции выше оптимальной величины снижает сорбционную емкость ионообменника па отношению к протеинаэе.

Указанные пределы скорости элюции также оптимальны, так как обеспечивают мин,мальное разбавление пратеолитической фракции, Концентрирование элюата протеиназы осуществляется методом ультрафильтрации через полупраницаемые мембраны или полые волокна с размером пор, обеспечивающим задержание в концентрате белков с мал.м. выше 15 кДа (например, мембрана

УПМ-20, волокно ВПУ-15-ПА). С целью снижения потерь фермента в процессе концентрирования и улучшения качества конечного продукта ультрафильтрацию необходимо проводить при рН 7,2 — 7,5, что соответствует зоне наибольшей стабильности пратеиназы, до величины протеолитической активности концентрата 8 — 11 ед/мл. Увеличение степени концентрирования приводит к инактивации фермента, а уменьшение степени концентрирования затрудняет процесс последующего осаждения протеиназы.

В обоих случаях это приводит к снижению выхода целевого продукта. Для стабилизации протеиназы в процессе ультрафильтрации в концентрат при достижении величины его активности 3,5-4,0 ед/мл можно ввести хлористый кальций из расчета 1,3 — 1,5 мг на единицу активности, Осаждение протеиназы.из концентрата проводится ацетоном при рН 8,2 — 8,4, т,е. вблизи изоэлектрической точки металлопротеиназы.

Полученный осадок лиофилизируют, Пратеолитическая активность препарата "Протолизин" при действии на казеинат натрия (температура 30 С) составляет 2,7—

3,2 ед/мг белка. Препарат не содержит примеси посторонних ферментов. Это белый или светло-бежевый аморфный порошок, растворимый в воде и изотоническом рас2003688 творе хлорида натрия, Зона наибольшей стабильности металлопротеиназы: рН 7,0—

8,0, температура 5 — 10 С. Оптимальные условия действия: температура 50 С, рН

7,0-7,5. И н гибиторы — ион ы тяжелых металлов, металлохелатные агенты. Изоэлектрическая точка 8,3, мол.масса 30,5 — 34,0 кДа.

Препарат катализирует гидролиз пептидных связей, образованных аминогруппами гидрофобных аминокислот, и не действует на пептидные связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот, активно расщепляет белки и пептиды, содержащие ароматические аминокислоты, Пример 1. Для получения препарата

"Протолизин" 120 г коммерческого препарата "Протосубтилин" с протеолитической активностью 70 ед/г и содержанием белка 35 мг/г растворяли в 500 мл дистиллированной воды, добавляли к полученному раствору

0 66 r хлористого кальция. Величину рН ферментного раствора устанавливали равной

7,2, Общий объем полученной смеси доводили до 600 мл. Нерастворившийся осадок отделяли центрифугиронанием. Ферментный раствор с протеолитической активностью 12,8 ед/мл направляли на гель-фильтрацию через сефадекс G-25. Сефадекс, загруженный н колонку обьемом 5 л, уравновешивали 0,0025 М фосфатным буфером рН 7,2. На колонку наносили 598 мл ферментного раствора со скоростью 0,75 мл/см в 1 мин и после гель-фильтрации получали обессоленную ферментную фракцию объемом 2000 мл с протеолитической активностью 3,0 ед/мл. Полученный ферментный раствор направляли на ионообменную хроматографию, которая проводится на карбоксиметилцеллюлозе (KM-целлюлозе), загруженной в колонку обьемом 1,2 л, Ионообменник уравновешивали 0,0025 M фосфатным буфером рН 7,2, Скорость нанесения обессоленного ферментного оаствора íà KM-целлюлозу равна

01, мл/см мин, Затем колонку промывали исходным буфером, содержащим 0,2 М

Ма С ; со скоростью 0,2 мл/см мин. При э 1-ом элюируется металлопротеиназа. Фракция металлопротеиназы объемом 2500 мл имела активность 1,2 ед/мл. Концентрирование протеолитической фракции проводили методом ультрафильтрации через полисульфонамидную мембрану типа УПМ-20 при рН раствора 7,2, В результате получен концентрат объемом 180 мл с активностью 10,8 ед/мл. Далее протеиназу осаждали ацетоном при рН 8,2 и осадок лиофилизировали.

Получено 0,52 г высокоочищенного препа5

55 рата "протoj",èýèH" с активностью 2200 ед/г и содержанием белка 700 мг/г.

Пример 2. Способ получения препарата "Протолизин" из протосубтилина аналогичен способу, описанному в примере 1, до стадии гель-фильтрации. Для этого использовали колонку с биогелем Р-6, уравновешенным 0,01 M ацетатным буфером рН

6,2. На колонку наносили 598 мл ферментного раствора со скоростью 0,85 мл/см мин. После гель-фильтрации получа2 ли 1880 мл обессоленного раствора с протеолитической активностью 3;2 ед/мл, Этот раствор наносили на колонку с KM-целлюлозой, уравновешенной 0,01 M ацетатным буфером рН 6,2, Скорость протока составляет

0,12 мл/см2мин. Элюцию протеиназы проводили исходным буфером, содержащим

0,22 М NaCI со скоростью 0,35 мл/см мин.

В результате получали протеолитическую фракцию объемом 2750 мл с ",êòèâíoñòüþ

1,1 ед/мл. Концентрирование элюата протеиназы проводили ультрафильтрацией через мембрану УПМ-20 при рН раствора 7,5. Концентрат фермента объемом 207 мл и активностью 9,5 ед/мл направляли на осаждение ацетоном. Осаждение проводили при рН

8,3. Осадок лиофилизиронали. Б результате получено 0,5 г высокоочищенного препарата с активностью 2100 ед/г и содержанием белка 660 мг/г, Пример 3. 350 г протосубтилина с протеолитической активностью 70 ед/г и содержанием белка 36 мг/г растворяли ь 1500 мл 0,0025 M фосфатного буфера рН 7,5, K полученному раствору добавляли 8,7 г хлористого кальция. Общий объем полученного растнора довели до 1750 мл. Нерастнориншиеся частицы удалили центрифугиронанием. Фугат объемом 1700 мл с активностью

13 ед/мл подвергали обессоливанию методом гель-фильтрации на молселекте G-25.

Для этого использовали 2 колонки объемом

5л каждая. Обессоливание проводили н среде 0,0025 M фосфатного буфера рН 7,5. На каждую колонку с сорбентом наносили по

850 мл ферментного раствора со скоростью

0,6 мл/см мин, Обессоленный раствор обьемом 5400 мл с активностью 3,3 ед/мл подавали HB ионообменную хроматографию, Колонку объемом 4 л с КМ-целлюлозой уравновешивали 0,0025 M фосфатным буфером рН 7,5, На колонку наносили обессоленный ферментный раствор со скоростью 0,15 мл/см мин, Элюцию протеиназы проводи2 ли раствором 0,18 M NaCI в исходном буфере, пропуская его через колонку с

KM-целлюлозой с той же скоростью. Элюат объемом 8,8 л с активностью 1.0 ед/мл концентрировали методом ул ьтрафил ьтрэ ции

2003688

Формула изобретения

Составитель P.Bàñèëîe

Техред M.Ìoðãåíòaë Корректор Н, Ревская

Редактор Л.Павлова

Заказ 3309

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 через полое волокно марки ВПУ-15-ПА до объема 1,76 л. Протеолитическая активность концентрата составляла 3,5 ед/мл. В концентрат вносили 9,24 г СаС1г и подвергали его дальнейшему концентрированию до содержания протеиназы в растворе 10,7

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

«ПРОТОЛИЗИН» ИЗ КОММЕРЧЕСКОГО

ПРЕПАРАТА «ПРОТОСУБТИЛИН», заключающийся в том, что проводят экстракцию ферментов дистиллированной водой или буферным раствором 0,002 - 0,01 M при рН

6,2 -7,5 в присутствии 0,1 - 0,5,(СаОг, отделение балластных веществ, обессоливание ферментного раствора методом

Гель-фильтрации в среде буферного раствора 0,002.- 0,01 М при рН 6,2 - 7,5 со скоростью протока 0,60 - 0,85 мл/смг мин, ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе в том же буфере со скоед/мл, Объем концентрата составлял 550 мл, Далее протеиназу осаждали ацетоном при pH 8,4 и осадок лиофилизировали, Препарат "Протолиэин" имел активность 1920 ед/г

5 и содержание белка 670 мг/г. Из 350 r протосубтилина получено 1,7 г протолизина. ростью протока раствора при сорбции 0.10

10 - 0,15 млlсм мин, при элюции - 0,15 - 0,35 г мл/см мин, используя в качестве элюента

0,18 - О;22 M раствор NaCI. концентрироваwe методом ультрафильтрации через полупроницаемые мембраны или полые

15 волокна с диаметром пор, обеспечивающим задержание белков с мол.м. выше 15 . кДа, до содержания протеиназы в концен.tpate 8 - 11 ед/мл, осаждение ацетоном при рН 8,2 - 8,4 и лиофилизацию.

20 2. Способ по п,1, заключающийся в том, что в концентрат по достижении величины его активности 3,5 - 4,0 ед/мл вводят

СаС1г из расчета 1,3 - 1,5 кг на единицу протеолитичес кой активности.