Способ ферментативного определения микроколичеств ртути

 

Использование: определение микроколичеств ртути, экспресс-анализ объектов окружающей среды. Сущность: последовательно смешивают ферментный препарат на основе пероксидазы, раствор тиомочевины и анализируемую пробу, а также растворы пероксида водорода и орто-дианизидина. При этом в качестве ферментного препарата используют водорастворимый твердый раствор пероксидазы в хитазане, а анализируемую пробу вводят через 3 - 7 мин после раствора тиомочевины. В момент введения пероксида водорода начинают отсчет и фиксируют время появления красно-коричневого окрашивания в ячейке с полученным раствором. Определение концентрации ртути в диапазоне 10^-3-10^-5мкг/мл проводится по градуировочному графику.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения микроколичеств ртути, и может быть использовано для экспресс-анализа объектов окружающей среды.

Известны способы [1,2] ферментативного определения солей ртути (II) по ее ингибирующему эффекту на ферменты уреазу и холинэстеразу, заключающиеся в предварительной инкубации пробы с иммобилизованным ферментом и последующим определением скорости ферментативного гидролиза специфических субстратов (мочевины и эфиров холина соответственно) с помощью потенциометрических датчиков. Указанные способы неселективны, требуют подготовки пробы и специального оборудования, включая ион-селективные датчики и ферментсодержащие мембраны.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по сущности и предложенному решению (прототипом) является способ [3] , заключающийся в том, что к анализируемой пробе последовательно добавляют предварительно выдержанную в течение 4 ч смесь 2 х 10^-9 раствора пероксидазы и 2,5 10^-4 М раствора тиомочевины; 8 ˙10^-3 М раствор о-дианизидина, 0,2 М раствор бифталата калия и едкого кали, 5˙ 10^-2 раствор пероксида водорода. Содержание ртути в пробе определялось с помощью спектрофотометра по временной зависимости поглощения полученной смеси при λ = 403 нм. Предел обнаружения ртути 1˙ 10^-5 мкг/мл. Однако указанный способ весьма продолжителен, использует малостабильные водные растворы пероксидазы, которые необходимо готовить ежедневно, требует специального оборудования для регистрации аналитического сигнала.

Целью изобретения является снижение трудоемкости и упрощение процесса измерения, а также сокращение продолжительности анализа.

Цель достигается тем, что в процессе анализа последовательно смешивают ферментный препарат на основе пероксидазы, раствор тиомочевины и анализируемую пробу, а также растворы пероксида водорода и орто-дианизидина, регистрируют изменение окраски раствора, в качестве ферментного препарата используют водорастворимый твердый раствор пероксидазы в хитазане, а анализируемую пробу вводят через 3-7 мин после раствора тиомочевины.

При использовании предлагаемого изобретения повышается устойчивость во времени ферментного препарата: активность пероксидазы в твердом растворе хитазана сохраняется в течение полугода, отпадает необходимость использования малоустойчивых во времени водных растворов пероксидазы, которые необходимо готовить ежедневно и хранить в холодильнике . Сокращается с 4 ч до 3-7 мин продолжительность предварительного контакта фермента и тиомочевины. При продолжительности контакта менее 3 мин не наблюдается существенного изменения чувствительности пероксидазы к ртути, при увеличении продолжительности контакта более 7 мин перестает изменяться .

Кроме того, появляется возможность визуальной индикации сигнала и использования способа в полевых экспедиционных условиях.

Выявленные отличия в аналитической и других смежных областях науки и техники для решения указанных задач не используются.

П р и м е р 1. Для приготовления твердого раствора пероксидазы смешивают 0,1% -ный водный раствор хитазана и 2 ˙10^-5 раствор пероксидазы в объемном соотношении 10: 1. Смесь тщательно перемешивают и дозируют в ячейки планшета для иммунологических исследований и сушат в токе воздуха при 50^оС. Непосредственно перед началом анализа в ячейку вносят фталатный буферный раствор (рН 5,0), содержимое перемешивают до полного растворения ферментного препарата. После этого в ячейку вводят последовательно 0,02 мл 2,5˙ 10^-4 М раствора тиомочевины, через 5 мин добавляют 0,02 мл раствора нитрата ртути, через 10 мин 0,01 мл 2,5˙ 10^-3М раствора о-дианизидина, 0,01 мл 10^-2 М раствора пероксида водорода. В момент введения пероксида водорода включают секундомер и фиксируют время появления красно-коричневого окрашивания в ячейке. Определение концентрации ртути в диапазоне 10^-3 - 10^-5 мкг/мл проводится по градуировочному графику, линейному в координатах lgC_Hg2+ = 0,673 - 7,27 (t_o/t_i), где t_o - время достижения красно-коричневого окрашивания в ячейке с контрольным раствором в отсутствии ртути; t_i - время достижения красно-коричневого окрашивания в ячейке с анализируемым на ртуть раствором; C_Hg2+ - концентрация нитрата ртути.

При концентрации нитрата ртути 10^-3 мкг/мл обнаружено (1,1±0,3)˙ 10^-3 мкг/мл при стандартном отклонении S = 2,9 ˙10^-4 (Р = 0,90).

П р и м е р 2. Условия определения как в примере 1. Концентрация нитрата ртути 10^-5 мкг/мл. Найдено (0,8±0,2) 10^-5 мкг/мл при стандартном отклонении S = 2,3˙ 10^-6 (Р = 0,90).

П р и м е р 3. Условия определения как в примере 1. Концентрация нитрата ртути 10^-4 мкг/мл. Найдено (0,9±0,25) 10^-4 мкг/мл при стандартном отклонении S = 2,7˙ 10^-5 (Р = 0,90).

П р и м е р 4. Условия определения как в примере 1. Раствор нитрата ртути добавляют через три минуты после раствора тиомочевины. Концентрация ртути 10^-3 мкг/мл. Найдено (0,9±0,3) 10^-3 мкг/мл при стандартном отклонении S = 3,2 ˙ 10^-4 (Р = 0,90).

П р и м е р 5. Условия определения как в примере 1. Раствор нитрата ртути добавляют через семь минут после раствора тиомочевины. Концентрация ртути 10^-3 мкг/мл. Найдено (0,9±0,2) 10^-3 мкг/мл при стандартном отклонении S = 2,2˙ 10^-4 (Р = 0,90).

Формула изобретения

СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОКОЛИЧЕСТВ РТУТИ, предусматривающий последовательное смешивание ферментного препарата на основе пероксидазы, раствора тиомочевины, анализируемой пробы, растворов пероксида водорода и ортодианизидина, регистрацию изменения окраски раствора и спектрофотометрическое определение количества ртути в анализируемой пробе, отличающийся тем, что в качестве ферментного препарата используют раствор пероксидазы в хитазане, а анализируемую пробу вводят через 3 - 7 мин после раствора тиомочевины.