Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 человека

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения очищенного препарата рекомбинантного интерлейкина-2. Целью изобретения является повышение активности и обеспечение высокой степени очистки целевого продукта. Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 человека, секретируемого дрожжами saccharomyces cerevisiae из культуральной среды штамма GRF 18-pJDB(ALPHOIL) (ВКПМ У -1038), состоит из следующих основных этапов: выращивания клеток штамма GRF 18-pJOB(ALPHOIL) на минеральной среде с пониженным содержанием неорганического фосфата; концентрирования интерлейкина-2 с помощью СМ-сефадекса или СМ-целлюлозы; очистки интерлейкина-2 хроматографией на смоле с обращенной фазой, лиофильного высушивания интерлейкина-2 в присутствии маннитола. Рекомбинантный интерлейкин-2 человека имеет удельную биологическую активность 10-30 млн.ед/мг. Электрофоретическая чистота свыше 90% и удельная биологическая активность в тесте на индукцию пролиферации клеток линии CTLL-2 10-30 млн. международных ед/мг белка. 2 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения очищенного препарата рекомбинантного интерлейкина-2 человека из культуральной среды штамма дрожжей S.cerevision ВКПМ-У-1038, секретирующего интерлейкин-2 в культуральную среду.

Цель изобретения - повышение активности и обеспечение высокой степени очистки целевого продукта.

Способ получения рекомбинантного интерлейкина-2 из культуральной среды штамма Saccharomyces cerevisial ВКПМ У-1038 (GRF 18-pJDB(ALPHOIL) состоит из следующих основных этапов: - выращивания клеток штамма GRF 18-pJDB(ALPHOIL) на минеральной среде с пониженным содержанием неорганического фосфата; - отделения клеток дрожжей центрифугированием от культуральной жидкости; - сорбции интерлейкина-2 на СМ-сефадекс или СМ-целлюлозе, отделения сорбента седиментацией и последующей элюции интерлейкина-2 высокосолевым буфером; - очистки интерлейкина-2 хроматографией на смоле с обращенной фазой (Octyl = Si 300 Polyol фирмы "Serva" или аналогичной) и лиофильного высушивания интерлейкина-2 в присутствии маннитола.

Получаемый по этому методу интерлейкин-2 человека характеризуется электрофоретической чистотой свыше 90% и имеет удельную биологическую активность в тесте на индукцию пролиферации клеток линии CTLL-2 10-30 млн. международных ед/мг белка.

П р и м е р. Штамм дрожжей S.cerevisial GRF 18-pJDB (ALPHOIL) (депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ У-1038) выращивают в 2 л минеральной среды SC, состав которой: 0,67% Jeast Nitrogen Base фирмы "Difco", 2% глюкозы. Кроме основных компонентов, среда должна содержать L-гистидин в концентрации 50 мг/мл. Выращивание продолжают в течение 48 ч при температуре 30^оС в качалке со скоростью 170-190 об/мин. Далее клетки отделяют от среды центрифугированием, промывают один раз стерильной водой и переносят в 4 л свежей минеральной среды, аналогичной среде SC, также содержащей гистидин, но имеющей пониженное содержание неорганического фосфата (вместо 1500 ед/л однозамещенного фосфата калия у среды SС - 30 мг/л однозамещенного фосфата калия и 1500 мг хлористого калия). Дрожжевые клетки культивируют в этой среде в указанных условиях в течение 24-48 ч. За это время культура достигает оптической плотности 5-8 при 600 нм.

Культуральную среду отделяют от клеток центрифугированием, затем, в случае необходимости, доводят рН среды до 4,8 добавлением разбавленной натриевой щелочи и вносят в среду 150 мл суспензии СМ-сефадекса С-25 (фирмы "Фармация", Швеция) или СМ-целлюлозы (Servacel СМ 23, "Реанал", Венгрия). Суспензию медленно перемешивают с помощью механической мешалки в течение 3 ч при 4^оС. Далее смолу отделяют декантацией, промывают 3 раза 0,5-литровыми порциями 30 мМ натрий-цитратного буфера, рН 4,8 и суспендируют в 0,4 л 1,5 М натрий-цитратного буфера рН 4,8. Суспензию осторожно перемешивают 8 ч при 4^оС, после чего смолу промывают один раз 200 мл того же буфера. Элюаты объединяют, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин и наносят на колонку с обращенно-фазным носителем.

Хроматографию проводят на колонке 22х250 мм со смолой в обращенной фазе Ostyl = Si 300 Polyol, средний размер зерна 10 мкм ("Серва", ФРГ). Для проведения хроматографии необходим жидкостной хроматограф, например "Altex" ("Бекман", Австрия) или аналогичный прибор с двумя жидкостными насосами высокого давления и возможностью программирования линейного градиента. Смолу уравновешивают 0,1% трифторуксусной кислотой и после нанесения со скоростью 10 мл/мин препарата интерлейкина-2 с предыдущей стадии и промывки в течение 5 мин с той же скоростью 0,1% трифторуксусной кислотой проводят элюцию с помощью следующей программы, состоящей из серии линейных градиентов двух растворов: элюент А-0,1% трифторуксусная кислота, элюент В-0,1% раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле: 0 - 5 мин 0 - 30% В 5 - 10 мин 30 - 40% В 10 - 40 мин 40-60% В 40-45 мин 60-80% В Элюция проводится со скоростью 10 мл/мин, причем элюат собирается фракциями по 15-18 мл. В ходе хроматографии непрерывно регистрируется оптическая плотность элюата при 280 нм. Как правило, пик интерлейкина-2 легко обнаруживается в конце хроматограммы (фиг.1), в области градиента, соответствующей примерно 55% концентрации ацетонитрила. Из фракций в той области, где предполагается элюция интерлейкина-2, отбирают аликвоты по 100 мкл, высушивают их в вакууме, растворяют в 0,125М трис-гидрохлоридном буфере, рН 6,8, содержащем 1% додецилсульфата натрия и 1% меркаптоэтанола, и прогревают 2 мин при 100^оС. Подготовленные таким образом пробы анализируют электрофорезом в 15% полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер - 0,2М глицин, оттитрованный трис-основанием до рН 8,3, буфер для геля 0,375М трис-гидрохлорид, рН 8,9, оба буфера содержат 0,1% додецилсульфат натрия). Электрофорез ведут в пластинах геля 100х150х1,5 мм при мощности 25 Вт в течение 3 ч. Гели окрашивают 0,025% раствором кумасси R-250 в 25% изопропаноле и 7% уксусной кислоте при нагревании до 80^оС в течение 30 мин. Отмывку проводят 7% уксусной кислотой при нагревании до 80^оС в течение нескольких часов при периодической смене раствора. Результаты электрофоретического анализа позволяют точно определить границы пика интерлейкина-2.

Фракции, содержащие интерлейкин-2, объединяют, добавляют маннитол до концентрации 5 мг/мл, разливают аликвотами по 5-10 мл и лиофильно высушивают.

Каждая из приготовленных таким образом аликвот препарата интерлейкина-2 человека может быть растворена в 0,5-1 мл воды, без добавления додецилсульфата натрия или других денатурирующих агентов.

Чистоту препарата и концентрацию интерлейкина-2 проверяют, проводя электрофорез одной из порций препарата. Условия электрофореза указаны. Помимо образцов интерлейкина-2 на тот же гель наносят заведомо известные количества бычьего сывороточного альбумина (1, 2, 4 мкг). После прокрашивания и отмывки проводят сканирование геля на спектрофотометре DU8 ("Бекман", Австрия) при длине волны 600 нм. Сравнивая площади пиков альбумина и интерлейкина-2, определяют количество интерлейкина-2 в образце. Как видно из фиг. 2, препарат интерлейкина-2, полученный по предлагаемому методу, имеет высокую чистоту.

Общий выход очищенного интерлейкина-2 составляет 2-4 мг (из 4 л исходной дрожжевой культуры).

Биологическая активность рекомбинантного интерлейкина-2, очищенного по предлагаемой схеме, соответствует биологической активности нерекомбинантного интерлейкина-2 человека, очищаемого из культуры человеческих клеток, и составляет 10-30 млн. инт.ед./мг белка.

Способ поясняется фиг.1 и 2. На фиг.1 представлен профиль элюции препарата интерлейкина-2 с колонки Ostyl = Si 300 Polyol, стрелкой показано положение пика интерлейкина-2; на фиг.2 - результат сканирования электрофоретограммы очищенного препарата интерлейкина-2, синтезированного и секретированного и секретированного дрожжами Caccharomyces cerevisiae.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА, предусматривающий культивирование штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-1038 на минеральной среде с пониженным содержанием неорганического фосфата и отделение культуральной жидкости от биомассы центрифугированием, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и обеспечения высокой степени очистки целевого продукта, сорбируют интерлейкин-2 из культуральной жидкости на СМ-сефадекс или СМ-целлюлозу, отделяют сорбент седиментацией, элюируют интерлейкин-2 высокосолевым буфером, элюат подвергают хроматографии на смоле с обращенной фазой и фракции, содержащие интерлейкин-2, лиофильно высушивают в присутствии маннитола.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2