Вещество, обладающее противоопухолевой активностью

 

Изобретение относится к медицине и касается применения известного соединения, относящегося к химическому классу стероидов, а именно 6-метилпрегна-4,6-диен-3 β 17 a -диол-20-она диацетата (1, ацетомепрегенол, диацетат мепрегенола, диамол) по новому назначению. Известно его применение в качестве гестагена контрацептивного и лечебного средства при акушерской и гинекологической патологии. Целью изобретения является расширение ассортимента противоопухолевых средств для лечения гормонозависимых форм рака. Это достигается использованием известного лекарственного вещества диацетата 6-метилпрегна-4,6-диен-3 b 17 a -диол-20-она (ацетомепрегенола) в новом качестве, а именно гормонального противоопухолевого средства. 14 табл.

Изобретение относится к медицине и касается известного соединения ряда оксипрогестерона, а именно 6-метилпрегна-4,6-диен-3 β-17α -диол-20-она диацетата [ацетомепрегенола (1), диацетата мепрегенола (2), диамола (3)] формулы (1): CH₃--O Известно, что соединение I обладает гестагенным действием. Ацетомепрегенол применяют в качестве контрацептивного и лечебного средства при акушерской и гинекологической патологии (1).

Впервые предлагается использовать соединение I в медицине в качестве противоопухолевого средства.

Известен гормональный противоопухолевый препарат-капротан прегн-4-ен-17 α -ол-3,20-диона формулы А: известный в медицинской практике под названием окси прогестерона капронат, широко применяемый для лечения запущенных форм рака молочной железы и рака матки.

Этот препарат вводится только парентерально и в массивных дозах до 5 г в неделю. Кроме того, при длительном применении препарата наблюдается адаптация к нему и, как следствие, прекращение действия.

Наиболее близким по структуре и фармакологическому действию к изобретению является стероидный противоопухолевый препарат 6-метил-прегна-4,6-диен-17 α -ол-3,20-диона ацетат формулы Б: Препарат Б известен в медицинской практике под международным названием мегестрола ацетата и применяется для лечения запущенных карциономы груди и рака тела матки.

Однако препарат можно вводить лишь одним способом пероральным его в относительно высоких дозировках (до 320 мг в день), отсутствует избирательность гормонального действия (отчетливо выражена антиандрогенная активность).

Поскольку характерным для большинства противоопухолевых гормональных препаратов является адаптация организма к примененному веществу и ослабление вплоть до прекращения их действия, то проведение поиска новых гормональных противоопухолевых препаратов является необходимым.

Целью изобретения является новое средство для лечения гормонозависимых форм рака, обладающее улучшенным противоопухолевым действием.

Это достигается использованием известного лекарственного вещества 6-метил-прегна-4,6-диен-3 β 17 α -диол-20- ондиацетата формулы I в новом качестве, а именно, в качестве гормонального противоопухолевого средства.

Противоопухолевая активность заявляемого препарата формулы I (ацетомепрегенола) изучалась в экспериментах: на крысах с карцино-саркомой Уокера (пример I, табл. 1-4); с опухолью РМК-1 (пример 2, табл. 5-10); на мышах С₅₇Вl с аденокарциномой 755 (пример 3, табл. 11); на мышах SНR со спонтанными опухолями молочных желез (пример 4, табл. 12);
на мышах ДВА₂ и С₃Н с опухолями молочных желез, а также проведено сравнение активности ацетомепрегенола (1) и ацетата мегестрола (Б) при пероральном введении (пример 5, табл. 13);
на мышах БД F₁ с карцино-саркомой 755, а также первой и второй генерациями трансплантируемой опухоли молочной железы (ОМЖ) и сравнение активности препарата I и капроната оксипрогестерона (А) при парентеральном введении (пример 6, табл. 14).

П р и м е р 1. Влияние ацетомепрегенола на карциносаркому Уокера у крыс.

Исследование проведено на 38 крысах-самках в массой тела 100-110 г. Карциносаркома Уокера перевита подкожно. Препарат вводился в виде водной суспензии перорально в дозах 1,5, 15 и 150 мг/кг ежедневно в течение 14 дн. начиная со следующего дня после перевивки опухоли.

Результаты измерения объемов опухолей в различные сроки наблюдения представлены в табл. 1.

Данные табл. 1 позволяют сделать вывод о способности препарата формулы (1), примененного в дозе 150 мг/кг ежедневно внутрь, статистически значимо тормозить у крыс рост карциносаркомы Уокера на 37,5-48,9% При использовании препарата в дозах 1,5 и 15 мг/кг не отмечалось стимулирующего действия на опухолевый рост, а наблюдалась тенденция к его торможению.

Динамика массы тела у крыс с карциномой Уокера, получавших препарат I представлена в табл. 2.

При рассмотрении данных динамики массы тела, представленных в табл. 2, обращает внимание отсутствие различий в массе тела крыс контрольной группы и крыс, получавших препарат I в дозе 150 мг/кг, в процессе роста опухоли. Учитывая при этом, что препарат в указанной дозе тормозит рост опухоли, эти данные свидетельствуют об отсутствии токсического действия препарата в дозе 150 мг/кг.

Помимо применения ацетомепрегенола в виде субстанции проведены исследования по влиянию таблетированной формы ацетомепрегенола на рост опухоли у крыс с карциносаркомой Уокера (см. табл. 3). Опыты выполнены на 56 крысах самках массой 140-150 г. На следующий день после перевивки опухоли ежедневно вводили ацетомепрегенол (таблетированная форма, 1 таблетка содержит 25 мг ацетомепрегенола) через зонд в объеме 1 мл дистиллированной воды в дозах 15, 150, 300 мг/кг. Введение препарата продолжалось вплоть до гибели животных.

Фиксировали момент появления опухоли после перевивки и день гибели животного. Массу тела животных и объем опухоли в см³ определяли каждые 2-3 дня.

Результаты экспериментальных исследований (табл. 3) показали, что метомепрегенол в дозах 150-300 мг/кг вызывает достоверно значительное торможение роста карциносаркомы Уокера. При введении препарата в дозе 150 мг/кг рост опухоли тормозился на 43,5% (Р < 0,01), а при введении удвоенной дозы 300 мг/кг рост опухоли тормозился на 49,7% (Р < 0,01). Препарат в дозе 15 мг/кг вызвал умеренное торможение роста опухоли 19,9% (Р > >0,05).

Изучение влияния препарата на массу тела крыс (табл. 4) показало, что препарат в примененных дозах не вызывал заметного снижения массы тела животных. Ацетомепрегенол, уменьшая объем опухоли карциносаркомы Уокера, не оказывал токсического действия на организм животных.

Как видно из табл. 4, ацетомепрегенол не влияет на скорость возникновения опухоли карциносаркомы Уокера.

П р и м е р 2. Влияние ацетомепрегенола на опухоль РМК-1 к крыс.

Исследование проведено на 37 крысах-самках в массой тела 100-110 г. Опухоль РМК-1 перевита подкожно. Ацетомепрегенол (субстанция) вводился с первого дня после перевивки перорально в дозе 150 мг/кг ежедневно в течение всего времени наблюдения за животными.

Результаты эксперимента, представленные в табл. 5, показывают, что препарат в дозе 150 мг/кг оказывал тормозящее действие на рост данной опухоли.

При сравнении показателей объема опухоли у крыс контрольной группы и крыс, получавших препарат I в дозе 150 мг/кг, проведенном в более поздние сроки перевивки РМК-1 (30-41 дни), выявлены еще более существенные различия (табл. 6).

Ингибирующее действие препарата I на рост опухоли РМК-1 на 30-41 дни представлено в табл. 6.

Как видно из данных табл. 5 и 6 препарат I, примененный в дозе 150 мг/кг ежедневно, тормозит рост опухоли РМК-1 в 2-4 раза.

Представленные в табл. 7 данные о динамике массы тела у крыс с РМК-1, получавших препарат, свидетельствуют об отсутствии существенных различий с показателями контрольной группы.

Принимая во внимание имеющуюся тенденцию к торможению роста опухоли РМК-1 с 12-14 дня после прививки под влиянием препарата I в дозе 150 мг/кг, полученные данные можно рассматривать как отсутствие токсического действия препарата, примененного в указанной дозе.

Кроме того, проведены исследования по влиянию таблетированной формы ацетомепрегенола на рост опухоли у крыс с РМК-1. Опыты выполнены на 64 крысах-самках массой тела 140-150 г (табл. 8).

На следующий день после перевивки опухолей ежедневно вводили ацетомепрегенол (таблетированная форма, 1 таблетка содержит 25 мг ацетомепрегенола) через зонд в объеме 1 мл дистиллированной воды в дозах 15, 150, 300 мг/кг. Введение препарата продолжалось вплоть до гибели животных. Животные контрольной группы через один зонд получали дистиллированную воду в том же объеме.

Фиксировали момент появления опухоли после перевивки и день гибели животных. Массу тела животных и объем опухоли (в см³) определяли каждые 2-3 дня.

Влияние ацетомепрегенола (таблетированная форма) на скорость возникновения у крыс опухоли РМК-1 представлено в табл. 8.

Результаты исследований показали, что ацетомепрегенол не влиял существенно на скорость возникновения опухоли РМК-1 после перевивки.

Не обнаружено также существенных изменений в средней продолжительности жизни крыс с опухолью РМК-1, получавших ацетомепрегенол в различных дозах, по сравнению с контрольными животными (табл. 9).

Исследовано также влияние ацетомепрегенола (таблетки) на рост опухоли РМК-1 у крыс (см. табл. 10).

Как видно из табл. 10, ацетомепрегенол тормозит рост опухоли РМК-1 у крыс при введении препарата в дозе 15 мг/кг на 38,7% 150 мг/кг на 50,6% 300 мг/кг на 68,8% Исчезновение опухолей РМК-1 в контрольной группе животных составляло 15%
Таким образом, проведенные исследования показали, что препарат, уменьшая объем опухолей РМК-1, не оказывает токсического действия на организм животных, не вызывает заметного снижения массы тела животных.

Полученные экспериментальные данные позволяют заключить, что ацетомепрегенол обладает выраженными канцеролитическими свойствами, проявляющимися в значительном торможении роста штаммов опухолей карциносаркомы Уокера и РМК-1.

П р и м е р 3. Влияние ацетомепрегенола на аденокарциному 755 у мышей.

Исследование проведено на 27 мышах-самках линии С₅₇Вl. Аценокарционома 755 перевита подкожно. Ацетомепрегенол животные получали перорально в виде водной суспензии в дозах 150 и 300 мг/кг с 3-го дня перевивки по 7-й.

Измерение объемов опухолей, произведенных на 11-й день после перевивки, показало, что ацетомепрегенол в дозе 150 мг/кг тормозит рост аденокарциномы 755 на 50% при повышении дозы до 300 мг/кг усиления эффекта не наблюдалось (табл. 11).

Влияние ацетомепрегенола на рост аденокарциномы 755 у мышей С₅₇Вl представлено в табл. 11.

П р и м е р 4. Влияние ацетомепрегенола на спонтанные опухоли молочных желез у мышей SHR.

Исследование проведено на 10 мышах-самках SHR в возрасте свыше 1 года со спонтанными опухолями молочных желез. Мыши подопытных групп получали ежедневно ацетомепрегенол в дозе 150 мг/кг внутрь. Введение ацетомепрегенола продолжалось в течение всего периода наблюдения. По оценке результатов животных распределяли попарно таким образом, что каждая мышь, получавшая ацетомепрегенол, сравнивалась с контрольной мышью со сходной локализацией и с близкими исходными размерами опухоли.

Данные по измерению объема опухолевых узлов и выживаемости мышей представлены в табл. 12.

Данные табл. 12 показывают, что ацетомепрегенол обладает терапевтическим действием при спонтанных опухолях молочных желез у мышей SHR. Наряду с задержкой роста опухоли в двух из пяти наблюдений наблюдалась также и частичная регрессия опухолевых узлов (опыт 2 и 3), причем в обоих случаях объем опухолей уменьшился почти на 90% по сравнению с исходным объемом опухоли.

Наблюдение за выживаемостью мышей показало, что мыши со спонтанными опухолями, получавшие ацетомепрегенол, жили дольше, чем контрольные (опыт 1, 2 и 4).

Активность ацетомепрегенола в отношении спонтанных опухолей молочных желез у мышей выгодно отличает ацетомепрегенол от его аналога капроната оксипрогестерона (А), который не оказывал влияния на скорость роста первой генерации на одной из шести исследованных опухолей молочных желез у мышей С₃Н и ДД.

П р и м е р 5. Влияние ацетомепрегенола (I) на рост первых генерации перевиваемых опухолей молочных желез у мышей ДВА₂. Сравнение активности I и ацетата мегестрола (Б).

Изучение влияния производных ацилоксипрогестерона (заявляемый препарат и известный препарат (Б)) на рост первой генерации опухоли молочной железы у мышей ДВА₂ проводилось на мышах-самках этой линии. Источником опухоли послужила обнаруженная у нерожавшей самки ДВА₂ спонтанная опухоль молочной железы. В асептических условиях опухоль была удалена, измельчена и была приготовлена 10%-ная взвесь в физиологическом растворе. Перевивка производилась внутримышечно по 10⁶ клеток, содержащихся в 0,2 мл взвеси. Трансплантация оказалась положительной у 100% животных. Опухоли начали отчетливо определяться к 12 дню после перевивки. Препараты вводились внутрь с 3 дня после перевивки в дозе 150 мг/кг ежедневно пять раз в неделю в течение двух недель.

Исследование проведено на 33 мышах-самках линии ДВА₂.

Первая группа (10 мышей) служила контролем, мыши с 3 дня после перевивки получали внутрь с помощью зонда по 0,4 мл крахмального клейстера, служившего для приготовления взвеси нерастворимых препаратов, вводимых животным трех других групп. Мыши контрольной группы к 28 дню погибли. Масса опухоли к моменту гибели животных превышала 3000 мг.

Мыши второй группы получали мегестрол ацетат (Б), третьей группы заявляемый препарат (I) ацетомепрегенол.

Измерения объемов опухолей производились на 16, 18 и 20 дни после перевивки. Мегестрола ацетат (Б) тормозил рост опухолей на 28-30% Ацетомепрегенол (I) оказался наиболее эффективным препаратом, так как под его влиянием рост опухоли ингибировался на 45-67% Продолжительность жизни мышей, получавших ацетомепрегенол (I), оказалась выше, чем продолжительность жизни мышей других групп (табл. 13).

б) Влияние ацетомепрегенола (I) на рост спонтанной опухоли молочной железы у мышей линии С₃Н.

В исследовании на мышах С₃Н мышам-самкам была перевита внутримышечно опухоль молочной железы, спонтанно возникшая у мыши-самки линии С₃Н. Перевивка у всех мышей оказалась положительной, хотя скорость роста опухоли была меньше по сравнению с опухолями у мышей ДВА₂. Мыши первой группы служили контролем, мышам второй группы вводился препарат I в дозе 150 мг/кг в течение 2 недель, начиная с 3-его дня после перевивки.

Измерение объема опухолей, произведенное на 48 день после перевивки, показало, что под влиянием ацетомепрегенола рост опухолей затормозился на 81%
П р и м е р 6. Изучение противоопухолевой активности ацетомепрегенола (I) при парентеральном введении. Сравнение активности I и капроната оксипрогестерона (А). Противоопухолевая активность ацетомепрегенола изучена при введении внутримышечно 3%-ной и 1,5-ной суспензии в косточковом масле и внутрибрюшинно 1,5%-ной суспензии в 10%-ном растворе поливинилпирролидона.

Оценка противоопухолевой активности проведена в сравнении с активностью оксипрогестерона капроната (А).

Опыты приведены на 88 самках мышей БД 1 средней исходной массы 23-27 г с карциномой 755, а также первой и второй генерациями трансплантируемой опухоли молочной железы (ОМЖ), полученной от спонтанной ОМЖ у мышей ДВА₂. Препарат вводили ежедневно в течение 7-9 дней. Введение начинали через 24 ч (карцинома 755) или 9 (1-я генерация ОМЖ) и 5 (2-я генерация) суток после трансплантации опухоли. Животных забивали через 48 ч (карцинома 755) или 96 ч (ОМЖ) после последнего введения препарата, затем оценивали его переносимость (по общему состоянию и изменению массы тела в процессе лечения в сравнении с контролем, Кр) и процент торможения роста опухоли у подобных мышей по сравнению с контрольными (J_т,).

Ацетомепрегенол (I) и оксипрогестерона капронат (А) вводили в ранее определенных оптимальных дозах, указанных в табл. 14 ( α > 0,95).

Как видно из табл. 14, ацетомепрегенол при внутрибрюшинном и внутримышечном введениях оказывает отчетливое тормозящее влияние на опухолевый рост.

При внутримышечном введении препарата мышам с карциномой 755 (9 введений ацетомепрегенола в дозе 150 мг/дн в виде 3%-ной суспензии в косточковом масле) рост опухоли тормозился на 68% (оксипрогестерона капронат замедлял рост опухоли в том же опыте при оптимальной дозе 1500 мг/день лишь на 49%);
при уменьшении числа введения препарата 1 до 7 коэффициент торможения опухолевого роста составил 62%
После внутрибрюшинного введения (семь введений) ацетомепрегенола (I) в виде 1,5%-ной суспензии в поливинилпирролидоне торможение опухолевого роста достигает 58% Токсического действия ацетомепрегенола (I) на организм не выявлено.

У мышей с первой генерацией ОМЖ ацетомепрегенол вызвал торможение роста опухоли лишь на 38% При последующей перевивки, сопровождающейся снижением гормоночувствительности опухоли, противоопухолевый эффект препарата I снизился и оказался пограничным (25% α > 0,95).

Таким образом, при парентеральном введении ацетомепрегенол (I) проявляет отчетливую противоопухолевую активность в дозе в 10 раз меньшей, чем капронат оксипрогестерона (А).

Изучение токсичности заявляемого препарата.

Проведены токсикологические исследования на четырех видах животных, включая собак, выявлено, что заявляемый препарат формулы I не оказывает отрицательного воздействия на жизненно важные функции организма (морфологическая картина крови, ее свертывающая система; функция печени, почек; сердечно-сосудистая система; дыхательная система; центральная нервная система, эндокринная система и др.).

Исследование сферической токсичности заявляемого препарата показало отсутствие у него тератогенной, аллергизирующей, мутагенной и канцерогенной активностей.

При исследовании гормонального спектра физиологической активности соединения (I) установлено, что заявляемый препарат является чистым геогеном, не проявляющим экстрогенной, анаболической, противовоспалительной минералокортикоидной, тимолитической, антиэстрогенной, антиандрогенной активности, т. е. является многогормональным препаратом, лишенным побочного гормонального действия.

Заявляемый препарат I проявляет высокую противоопухолевую активность при любом способе введения: при парентеральном введении (в/м и в/б) активнее соединения А, а при пероральном активнее наиболее близкого химического и фармакологического аналога препарата Б.

Таким образом, из представленных экспериментальных данных видно, что предлагаемый препарат формулы I является новым эффективным противоопухолевым средством.

Ацетомепрегенол (I) представляет собой белый или белый с желтоватым оттенком кристаллический порошок без запаха, хорошо растворимый в хлороформе, ацетоне, растворимый в спирте, растительных маслах, практически не растворим в воде. Температура плавления 191 ± 6^оС, удельное вращение 77,5 ± 2,5^о (1% -ный раствор в хлороформе), оптическая плотность 1%/1 см 585 ± 15 при 242 нм (0,001% раствор в метаноле).

Схема получения соединения I
O
Пример получения 6-метилпрегна-4,6-диен-3 β17 α -диол-20-она (ацетомепрегенола).

К перемешиваемой суспензии 5 г ацетата 6-метилпрегна-4,6-диен-17 α -ол-3,20-диона в 100 мл метанола добавляют 0,5 г борогидрида натрия. После дополнительного перемешивания в течение 15 мин реакционную смесь разбавляют водой. Для окончания кристаллизации суспензию перемешивают 30 мин, осадок отфильтровывают, промывают водой и высушивают. Получают 4,72 г 17-ацетата-6-метилпрегна-4,6-диен-3 β17 α -диол-20-она с температурой плавления 203-205^оС, / α /_D²⁰ 56,3^о (2%-ный раствор в хлороформе).

Ацетилируют 5 г 17-ацетата-6-метилпрегна-4,6-диен-3 β17 α -диол-20-она смесью 10 мл уксусного ангидрида и 10 мл пиридина при перемешивании при комнатной температуре в течение 16 ч. Полученный раствор выливают в смесь соляной кислоты, воды и льда и перемешивают 1 час. Выделившийся осадок отфильтровывают, промывают раствором соляной кислоты, затем водой до нейтральной реакции, высушивают и после очистки получают 4,36 г ацетомепрегенола.

Формула изобретения

ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, отличающееся тем, что оно представляет собой 6-метил-прегна 4,6- диен- 3β, 17α диол-20-она диацетат формулы

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10