Способ определения концентрации фенилаланина

 

Использование: медицина, для определении концентрации фенилаланина в крови. Техническим результатом изобретения является снижение количества необходимого для анализа материала, расхода реактивов, механизация изъятия кровяных дисков после алюции из них фенилаланина, а также стабилизация качества длительно хранящихся калибраторов и контрольных материалов. Сущность изобретения: в лунки микропланшета помещают микроворонки, в которых размещают пробы крови на фильтровальной бумаге, затем проводят элюцию растворителем, после чего систему микропланшет с микроворонками и крышкой подвергают центрифугированию, с элюатом ставят качественную реакцию и флуореметрически определяют содержание в нем фенилаланина. Результаты использования апробированы в условиях московского центра по массовому обследованию новорожденных на врожденное нарушение обмена фенилаланина, раннее выявление которого и лечение ведут к сокращению детской инвалидности.

Изобретение относится к медицине и предназначено для проведения массовых исследований крови, преимущественно в неонаталогии, т.е. в период ранней новорожденности детей.

Известен способ проведения количественного определения концентрации фенилаланина в пробирках, например метод МсCаman MW.Robins E.Flurometric method for detemination of phenylalanine in serum J Lab Clin Med 1962; 59: 885-90. Hsia DYY, Berman JL, Slatis HM.Screening newborn infants for phenylketonuria. J Am Med Assoc 1964; 188:203-6. Hill JB, Summert GK, Pender MW, Roszel NO. An automated procedure for blood phenylalanine. Clin Chem 1987; 33:1152-4.

Однако эти способы обладают существенными недостатками: работа с сывороткой или с большим количеством исследуемой крови, высушенной на бумаге, трудоемкость, малая производительность, использование крупногабаритного и дорогостоящего оборудования.

Более совершенным способом, впервые использованным в практике неонатальных исследований, является способ, сущность которого состоит в определении концентрации фенилаланина в водных элюатах из сухих пятен крови, в условиях проведения реакции в многолуночном микропланшете и последующем измерении флюоресцентных сигналов на флюориметре в течение 1 мин.

Недостаток этого способа состоит в необходимости автоклавирования бланков с кровью перед элюцией (требует комплектации лаборатории автоклавом), в процедуре переноса элюата из лунок одного микропланшета в соответствующие лунки другого, для проведения реакции (дополнительная возможность возникновения ошибки), в использовании для анализа кровяного диска диаметром 5-6 мм и больших количеств реагентов.

Техническим результатом изобретения является снижение количества исследуемого материала, расхода реактивов, механизация изъятия дисков после элюции, а также стабилизация качества длительно хранящихся калибраторов и контрольных материалов.

Сущность предлагаемого способа состоит в том, что диски выполняют размером 3-4 мм в диаметре в микропланшет с системой микроворонок, в которой проводят элюцию, после чего систему центрифугируют и под действием центробежной силы элюат через капиллярные отверстия в микроворонках перемещается в лунки микропланшета и используется для исследования.

Из сухих пятен крови вырезают диски и помещают в систему микроворонок, установленную на микропланшет и предварительно смоченную обводненным этиловым спиртом. В микроворонки с дисками заливают еще этилового спирта и помещают в холодильник для ночной инкубации, после чего добавляют еще немного спирта и помещают на встряхиватель для кратковременной элюции. Затем систему микроворонки/микропланшет центрифугируют и отделенный от дисков элюат используют для исследования.

П р и м е р. Кровяные диски диаметром 3 мм помещают в предварительно смоченные обводненным этанолом микроворонки, помещенные на белый микропланшет, после чего в эти же микроворонки доливают по 30-35 мкл 80% этанола, закрывают плотной крышкой и помещают в холодильник на ночь при 4-8^оС, затем добавляют в каждую лунку по 30-35 мкл 80% этанола, помещают под крышкой на встряхиватель на 3-5 мин для элюции, затем центрифугируют 5 мин при 2,5-3 тысячах об/мин, потом микроворонки с дисками отбрасывают, а в лунки микропланшета с элюатом добавляют свежеприготовленную инкубационную смесь, состоящую из 0,6 М натрий сукцинатного буфера рН 5,9, водного раствора нингидрина (10 мг/мл) и водного раствора L-лейцил-L-аланина (2,5 мг/мл) в пропорции 5: 2: 1 (концентрации подобраны экспериментально). После 1-2 мин встряхивания планшет под крышкой помещают в термостат на 1 ч для инкубации (в более длительной инкубации необходимость не выявлена) при 60^оС. По окончании инкубации планшет без крышки охлаждают при -(12-18)^оС в течение 5 мин, затем останавливают реакцию медным реактивом и встряхивают при комнатной температуре 10-15 мин, после чего проводят измерение уровня флюоресценции во флюориметре и расчет концентраций фенилаланина исследуемых проб по отношению к калибраторам.

Полученные результаты имеют коэффициент корреляции 0,98 по отношению к результатам измерения альтернативными методами (измерение концентрации фенилаланина в сыворотке тех же пациентов, проводимые под контролем эталонного материала фенилаланина производства фирмы Sigma (США). Опытное внедрение способа флюориметрического определения концентрации фенилаланина в высушенных пятнах крови показало, что трудоемкость анализа снижается, количество исследуемого материала необходимое для исследований и расход дорогостоящих реактивов снижается в несколько раз. Калибраторы и контрольные материалы могут быть использованы для высокоточных измерений в 5 раз дольше.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕНИЛАЛАНИНА путем помещения пробы крови на фильтровальную бумагу с последующей элюцией растворителем в лунках микропланшета, постановки качественной реакции и флуориметрическим определением содержания фенилаланина, отличающийся тем, что в лунки микропланшета помещают микроворонки, где в последующем размещают пробы крови на фильтровальной бумаге, а перед постановкой качественной реакции после элюции растворителем систему микропланшет с микроворонками и крышкой подвергают центрифугированию.