Кристаллическая 2-о- -d-глюкопиранозил-l-аскорбиновая кислота и способ ее получения

 

Использование: в медицине, пищевой промышленности, косметике и т.п. как активное производное витамина С. Сущность продукт кристаллическая 2-0- a -D-глюкопиранозил- L -аскорбиновая кислота. Реагент 1: L -аскорбиновая кислота. Реагент 2: a -глюкозилсахарид, выбранный из группы, содержащей мальтоолигосахарид, продукт частичного гидролиза крахмала, крахмал, превращенный в жидкость, студнеобразный крахмал, растворимый крахмал и их смеси с концентрацией в 0,5-30 раз выше, чем у L -аскорбиновой кислоты. Реагент 3: сахарид, переносящий фермент, выбранный из группы, содержащей цикломальтдекстринглюконотрансферазу (ЕС 2,4,1.19) и a -глюкозидазу, возможно в присутствии глюкоамилазы (ЕС 3.21.3) при pH 3-9, при температуре 20-80°С. Условия реакции: кристаллизация из перенасыщенного раствора (1,05-1,5) в присутствии затравочного кристалла в количестве 0,1-10 мас. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил. 1 табл.

Изобретение относится к способам получения новой кристаллической 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты общей формулы I проявляющей повышенную устойчивость при хранении.

Цель изобретения получение устойчивого при хранении и негигроскопичного производного L-аскорбиновой кислоты.

В настоящее время использование L-аскорбиновой кислоты не ограничивается введением витамина С как важного элемента питания, но является более широким. В частности, в силу своей химической структуры и физиологической активности L-аскорбиновая кислота пригодна в качестве подкисливающего агента, восстановителя, антиоксиданта, отбеливателя и стабилизатора в различных химических реагентах, пищевых продуктах и напитках, в фармацевтике при предотвращении и лечении таких заболеваний, как вирусные и бактериальные заболевания, злокачественные опухоли. Кроме того, она пригодна как восстановитель, УФ-поглощающий агент и ингибитор образования меланина в косметических средствах, например для очистки и отбеливания кожи.

Основным недостатком L-аскорбиновой кислоты является то, что она легко теряет физиологическую активность, так как обладает прямой восстанавливающей активностью, плохой стабильностью и в высокой степени подвержена окислению.

Для стабилизации L-аскорбиновой кислоты были предложены некоторые ее сахаридные производные. Например описан биохимический синтез глюкозидов L-аскорбиновой кислоты (1, 2).

Описан (3) органический химический способ синтеза сахаридных производных L-аскорбиновой кислоты.

Однако в этих производных все D-глюкозы связаны в β-положении, вплоть до 21 β-D-глюкопиранозильных производных L-аскорбиновой кислоты, включая 2,3-ди-0-(β -D-глюкопиранозил-L-аскорбиновую кислоту.

Изобретение направлено на преодоление недостатков обычных сахаридных производных L-аскорбиновой кислоты. Точнее исследовано новое сахаридное производное L-аскорбиновой кислоты, полученное биохимическим способом с помощью реакции переноса сахарида.

Как описано в (4) новое соединение, α-гликозил-L-аскорбиновая кислота в частности 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновая кислота, не обладающая прямой восстанавливающей активностью, имеющая высокую стабильность, легко гидролизуемая in vivo, и имеет удовлетворительно высокую физиологическую активность.

Кроме того установлено, что если L-аскорбиновая кислота поглощается с α-глюкозильным сахаридом, то 2-0- <N>alpha<N>-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновая кислота синтезируется и затем подвергается метаболизму in vivo и это может быть идеальным новым сахаридным производным L-аскорбиновой кислоты с точки зрения безопасности.

Порошок, получаемый концентрированием и распылением водного раствора 2-0-α -D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты, является аморфным и сильно гигроскопичным и имеет тот недостаток, что легко поглощает влагу в нормальных условиях и это вызывает расплывание и комкование.

В соответствии с этим в данном изобретении преодолевается недостаток такой аморфной 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты, в частности получают удовлетворительно легкотекучий порошок, не обладающий значительной гигроскопичностью и слеживаемостью в нормальных условиях.

Выражение "L-аскорбиновая кислота" в данном изобретении относится и к L-аскорбатам, таким как соли щелочных металлов, щелочноземельных металлов и их смеси, и не ограничивается свободной L-аскорбиновой кислотой. Таким образом, при необходимости в реакции сахаридного переноса можно использовать L-аскорбат натрия и L-аскорбат кальция, а также свободную L-аскорбиновую кислоту.

Выражения: α-гликозил-L-аскорбиновая кислота" и "2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновая кислота" в данном изобретении означают дополнительно и свободнокислотную форму.

α-гликозильные сахариды, пригодные в данном изобретении, являются такими, которые позволяют сахаридпереносящему ферменту превращать L-аскорбиновую кислоту в α-гликозил-L-аскорбиновую кислоту, где эквимолярное или большее количество α-D-глюкозильных остатков связано с L-аскорбиновой кислотой.

Способ согласно изобретению осуществляют тем, что раствор содержащий по крайней мере 1 мас. L-аскорбиновой кислоты и α-гликозилсахарид, выбранный из группы, содержащей мальтоолигосахарид, продукт частичного гидролиза крахмала, крахмал, превращенный в жидкость, студнеобразный крахмал, растворимый крахмал и их смеси с концентрацией в 0,5-30 раз выше, чем у L-аскорбиновой кислоты, подвергают действию сахаридпереносящего фермента, выбранного из группы, содержащей цикломальтодекстринглюканотрансферазу (ЕС 2.4.1.19) и α-глюкозидазу, возможно в присутствии глюкоамилазы (ЕС3 3.21.3) при рН 3-9 при 20-80^оС, после чего выделяют и очищают полученную 2-0- α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновую кислоту, готовят ее перенасыщенный раствор со степенью перенасыщенности 1,05-1,5, и кристаллизуют предпочтительно в присутствии затравочного кристалла в количестве 0,1-10 мас.

В представленных примерах подробно разъясняются получение и свойства кристаллической 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты по данному изобретению.

П р и м е р 1. Получение кристаллической 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты.

9 мас.ч. декстрина (ДЭ около 6) растворяют в 15 мас.ч. воды при нагреве и к раствору прибавляют 3 мас.ч. L-аскорбиновой кислоты в восстанавливающих условиях, а затем 400 ед./г декстрина цикломальтодекстринглюканотрансферазы производства Hayashibara Biochemical Laboratories Inc. Okaijama (Окайяма) Япония и проводят реакцию 24 ч, поддерживая раствор при рН 5,5 и 60^оС. Реакционную смесь подают в ЖХВД-систему "AQ-303 ODS" производства Jamamura Chemical Laboratories Co, Ltd, Kuomo, Japan, Киото (Япония) с колонкой "LC-6" производства Shimad zu Seisakusho Ltd. Киото, (Япония) и элюируют буфером 0,1 м КН₂РО₄-Н₃РО₄ (рН -2,0) со скоростью 0,5 мл/мин, контролируя детекторной системой "МUZ T-340" производства Japan Spectroscopic Co. Ltd. Токио, (Япония). В результате L-аскорбиновая кислота выходит с временем удерживания 9,5 мин, а образованные α-D-глюкозил-L-аскорбиновая кислота, α-D-мальтозил-L-аскорбиновая кислота, α-D-малтотриохил-L-аскорбиновая кислота, α-D-мальтотетраозил-L-аскорбиновая кислота, α-D-мальтопентаозил-L-аскорбиновая кислота, α-D-мальтогексаозил-L-аскор- биновая кислота и α-D-мальтогексаозил-L-аскорбиновая кислота и α-D-мальтогептаозил-L-аскорбиновая кислота выходят с временами удерживания соответственно 11,2 мин 15,7 мин, 20,6 мин 24,9 мин. 28,1 мин, 32,1 мин и 38,6 мин. Около 60% L-аскорбиновой кислоты превращается в α-гликозил-L-аскорбиновую кислоту. Затем реакционную смесь фильтруют через ультрафильтрационную мембрану для удаления фермента, доводят до рН 5,0 и 55^оС, прибавляют глюкоамилазу (ЕС 3.2.1.3) в количестве 10 ед./г декстрина производства Seikagaku Kojyo Ltd, Токио (Япония) проводят рекцию 24 ч, ЖХВД-анализ показывает, что в реакционной смеси α-D-мальтозил-L-аскорбиновая кислота и высшие α-гликозил-L-аскорбиновые кислоты гидролизуются до 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты.

Затем реакционную смесь нагревают для инактивирования оставшегося фермента, обесцвечивают и фильтруют через активированный уголь и фильтрат концентрируют приблизительно до 50 мас.

Концентрат подвергают колоночному хроматографированию на "ХТ-1016 (Na+-форма)", сильнокислотной катионообменной смоле производства Tokyo Chemical Industries Токио (Япония) в соответствии с методикой, описанной в патенте Японии N 23799/83 c незначительными модификациями, элюируя и выделяя фракцию, обогащенную 2-0- α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислотой чистоты около 94% которую затем очищают деминерализацией с использованием катионообменной смолы (Н⁺-форма), концентрируют приблизительно до 80 мас. помещают в стеклянный сосуд и выдерживают около 1 мес при 20-35^оС. В результате происходит кристаллизация. Часть кристаллов прибавляют к свежему образцу такой же очищенной и концентрированной фракции, обогащенной 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислотой и кристаллизуют при слабом перемешивании. Результирующую кристаллическую массу разделяют на маточную жидкость и кристаллы, которые промывают, обрызгивая небольшим количеством охлаждаемой чистой воды, растворяют в воде, перекристаллизовывают. Таким образом, получают высокочистые кристаллы с чистотой около 99,9% и выше.

П р и м е р 2. Физико-химические свойства кристаллической 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты.

Анализ кристаллов, полученных в примере 1, показывает, что это новая безводная кристаллическая 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновая кислота.

Ниже приведены свойства кристаллов.

Найдено, C 42,6; H 5,36 C₁₂H₁₈O₁₁ Вычислено, C 42,4; H 5,37; N < 0,01.

Молекулярная масса.

ID масс-спектрометрический анализ на "М-80В", масс-спектрометре производства Hitachi Ltd, Токио, Япония, показывает (М+Н)⁺-пик при 339 (мол.м. для формулы С₁₂Н₁₈О₁₁ равна 338).

Температура плавления 158,5-159,5^оС.

Теплота растворения: эндотермическая (27,2 ккал/г).

Удельное оптическое вращение: [α] _D²⁰ +189,6^o (вода, рН 1,98; [α]_D²⁰ +246,3^o (вода, рН 7,10).

Спектр УФ-поглощения: записан в 50 мкМ растворе. Спектр при рН 2,0, показан на фиг.1, а при рН 7,0 на фиг.2.

λ(макс.) 238 нм, ε= 0,93 х 10⁴ (рН 2,0); λ(макс.) 260 нм, ε= 1,50 х 10⁴ (рН 7,0).

ИК-спектр поглощения: снят в таблетке KBr ИК-спектр кристаллов приведен на фиг.3, а аморфного соединения (контроля) на фиг.4.

Растворимость, 125 г кристаллов растворяются в 100 г воды при 25^оС.

Растворимость в растворителях. Легко растворима в воде, 0,1н. NaOH и 0,1н. уксусной кислоте; растворима в метаноле и этаноле; нерастворима в эфире, бензоле, хлороформе и этилацетане.

Константа диссоциации. рКа равна 3,0. Сравнение этого значения со значениями для различных производных L-аскорбиновой кислоты, приведенными в таблице в I.Lernow Tetrahedron vol. 35, pp. 1483-1486 (1979) и в табл. 2 в Pao-Wen. Zu Journal. of Agricultural Food Chemistry, vol 32, pp. 21-28 (1984) свидетельствует о том, что в соединении по данному изобретению спиртовая группа при втором атоме углерода в остатке аскорбиновой кислоты ответственна за α-D-глюкозильную связь, а спиртовая группа при третьем атоме углерода находится в свободной форме.

Анализ метилированием. Кристаллы метилируют по методике, описанной в Pao-Wen. Zu и др. Journal of Agricultural Food and Chemistry vol 32, pp. 21-28 (1984), где L аскорбиновую кислоту метилируют диазометаном с образованием в основном 3-0-метил-L-аскорбиновой кислоты. Последующий гидролиз приводит к образованию 3-0-метил-L-аскорбиновой кислоты и D-глюкозы как основных продуктов.

П р и м е р 3. Стабильность кристаллической 2-0-α-D-глюкопиранозил-аскорбиновой кислоты в растворе.

2-0-α-D-глюкозил-L-аскорбиновую кислоту сравнивают с 6-0-α-D-глюкозил-L-аскорбиновой кислотой и с L-аскорбиновой кислотой по стабильности в водном растворе. А именно каждый образец доводят до концентрации 70 мкМ и до рН 7,0 или 2,0, помещают в кювету и измеряют поглощение при 260 нм (рН 7,0) или при 245 нм (рН 2,0), поддерживая температуру 45^оС. Коэффициент сохранности (%) рассчитывают из поглощения. Результаты приведены в таблице.

Как видно из данных таблицы в отличие от 6-0-α-D-глюкозил-L-аскорбиновой кислоты и L-аскорбиновой кислоты, кристаллическая 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскор- биновая кислота проявляет предельно высокую стабильность в водном растворе.

П р и м е р 4. Острая токсичность.

Образец кристаллической 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты, полученной по примеру 1, орально вводят мышам возраста 7 недель для испытания на острую токсичность. В результате мыши не погибают при введении до 5 г образца, более высокие дозы трудно испытать.

Это подтверждает, что образец имеет предельно низкую токсичность.

Представленные ниже примеры А и В иллюстрируют кристаллическую 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновую кислоту и ее использование.

П р и м е р А-1. Кристаллическая 2-0- α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновая кислота.

9 мас. ч. α-циклодекстрина растворяют в 20 мас.ч. воды при нагреве и к раствору прибавляют 3 мас. ч. L-аскорбиновой кислоты в восстанавливающих условиях и выдерживая раствор при рН 5,5 и 65^оС прибавляют 100 ед./г α-циклодекстрина цикломальтодекстринглюканотрансферазы производства Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc. Окайяма (Япония) и проводят реакцию 40 ч. ЖХВД-Анал из реакционной смеси показывает, что около 50% L-аскорбиновой кислоты превращается в -гликозил-L-аскорбиновую кислоту аналогично примеру 1.

Затем реакционную смесь нагревают для инактивации оставшегося фермента, доводят до рН 4,5 и 55^оС, добавляют 50 ед./г α-циклодекстрина глюкоамилазы и проводят реакцию 24 ч ЖХВД-анализ полученной реакционной смеси показывает, что α-мальтозил-L-аскорбиновая кислота и высшие α-гликозил-L-аскорбиновые кислоты гидролизуются до 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты.

Затем реакционную смесь нагревают для инактивации оставшегося фермента, обесцвечивают и фильтруют с активизированным углем и фильтрат наносят на колонку с катионообменной смолой (Н⁺-форма) для деминерализации, затем наносят на колонку с анионообменной смолой (ОН^--форма) для адсорбции анионов. Затем колонку промывают водой и наносят 0,5Н СHl для элюирования и элюат гель-хроматографируют на "HW-40 производства Tosoh Corp. Токио (Япония) с выделением фракции, обогащенной 2-0-α-L-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислотой, которую затем концентрируют под вакуумом приблизительно до 73 мас. помещают в кристаллизатор, добавляют 1 мас. затравочных кристаллов 2-0-α-D-глюкопиранозил- α-аскорбиновой кислоты, доводят до 40^оС, постепенно охлаждают до 25^оС в течение 12 дней, ускоряя кристаллизацию осторожным перемешиванием и помещают в корзиночную центрифугу для отделения мелассы. Оставшиеся кристаллы промывают обрызгиванием небольшим количеством водного этанола для получения кристаллической 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты с чистотой около 99% и выходом около 35 мас. в расчете на исходную L-асорбиновую кислоту.

Хотя продукт немного отличается по т.пл. и удельному оптическому вращению от кристаллов, полученных в примере 1, однако другие свойства практически такие же.

Продукт практически негигроскопичен, удобен в работе, не имеет прямой восстанавливающей активности и имеет удовлетворительно высокую стабильность и физиологическую активность. Поэтому продукт можно с успехом применять как агент улучшения вкуса, подкисливающий агент, стабилизатор, агент повышения качества, антиоксидант, физиологически-активный агент, УФ-поглощающий агент, фармацевтический агент и химикат для пищи, напитков, лекарств для соответствующих заболеваний, косметики и химический реагент, а также агент для обогащения витамином С.

П р и м е р А-2. Кристаллическая 2-0- α-D-глюкопаранозил-L-аскорбиновая кислота.

30 мас.ч. декстрина (ДЭ около 6) растворяют в 40 мас.ч. воды при нагреве и к раствору добавляют 7 мас.ч. L-аскорбиновой кислоты в восстановительных условиях и выдерживая раствор при рН 5,6 и 60^оС прибавляют 250 ед./г декстрина циклодекстринглюканотрансферазы и проводят реакцию 40 ч. По данным ЖХВД анализа реакционной смеси, аналогичного примеру А-1, около 65% L-аскорбиновой кислоты превращается в α-гликозил-L-аскорбиновую кислоту, как в примере 1.

Затем реакционную смесь фильтруют через ультрафильтр для удавления фермента, доводят до рН 5,0 и 50^оС, добавляют 100 ед./г декстрина глюкоамилазы и проводят реакцию 6 ч. ЖХВД- Анализ реакционной смеси показывает, что α-D-мальтозил-L-аскорбиновая кислота и высшие α-гликозил-L-аскорбиновые кислоты превращаются в 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновую кислоту.

Затем реакционную смесь нагревают для инактивации оставшегося фермента и фильтруют, после чего фильтрат концентрируют и хроматографируют на колонке "Dowex 50WX4 (Са⁺⁺-форма)" с сильнокислотной катионообменной смолой производства Dow Chemical Co. Мидланд, Мичиган, США, по методике примера 1 с небольшими модификациями. Элюированную обогащенную 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислотой фракцию очищают деминерализацией на катионообменной смоле (Н⁺-форма), концентрируют под вакуумом приблизительно до 77 мас. помещают в кристаллизатор, добавляют 2 мас. затравочных кристаллов, доводят до 45^оС и постепенно охлаждают до 28^оС в течение 2 дней, ускоряя кристаллизацию слабым перемешиванием. Результирующую массу разделяют аналогично примеру 1 и получают кристаллическую 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновую кислоту чистоты около 98% с выходом около 45 мас. от исходной L-аскорбиновой кислоты.

Аналогично продукту по примеру А-1 продукт практически негигроскопичен, удобен в обработке, не имеет прямой восстанавливающей активности и обладает удовлетворительно высокой стабильностью и физиологической активностью. Поэтому продукт можно с успехом использовать как улучшающий вкус агент, подкисливающий агент, влагоудерживающий агент, стабилизатор, улучшающий качество агент, УФ-поглощающий агент, фармацевтический агент и химикат для пищи, напитков, лекарств для соответствующих заболеваний и косметики, а также как агент для обогащения витамином С.

П р и м е р А-3. Кристаллическая 2-0- α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновая кислота.

Аналогично примеру А-2 цикломальтодекстринглюкано-трансферазу и глюкоамилазу вводят в реакцию с получением реакционной смеси, содержащей 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновую кислоту, которую затем нагревают для инактивации ферментов, обеспечивают и фильтруют с активированным углем. Результирующий фильтрат деминерализуют катионообменной смолой (Н⁺-форма) и хроматографируют на колонке с сильнокислотной катионообменной смолой (Н⁺-форма) по методике примера 1 с небольшой модификацией и элюируют. Выделяют фракцию, обогащенную 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислотой, концентрируют прибли- зительно до 90 мас. помещают в кристаллизатор, добавляют около 2 мас. затравочных кристаллов слабо перемешивают 30 мин, переносят в поддон и кристаллизуют и отверждают 3 дня при 25^оС. Затем содержимое вынимают из поддона подают в диспергирующий пульверизатор, сушат и получают кристаллическую 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновую кислот-чистоты около 95% с выходом около 70 мас. от исходной α-аскорбиновой кислоты.

Аналогично продукту по примеру А-1 продукт практически негигроскопичен, легко обрабатывается, не имеет прямой восстанавливающей активности и обладает удовлетворительно высокой стабильностью и физиологической активностью. Поэтому продукт можно с успехом использовать как улучшающий вкус агент, подкисливающий агент, стабилизатор, агент повышения качества, антиоксидант, физиологически-активный агент, УФ-поглощающий агент, фармацевтический агент и химикат для пищи, напитков, лекарств для соответствующих заболеваний, косметики и как химический реагент, а также как агент для обогащения витамином С.

П р и м е р А-4. Кристаллическая 2-0- α-L-глюкопиранозил-L-аскорбиновая кислота.

Обогащенную 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислотой фракцию, полученную по примеру А-3, концентрируют приблизительно до 80 мас. помещают в кристаллизатор, добавляют около 2 мас. затравочных кристаллов и постепенно охлаждают с 50^оС, ускоря кристаллизацию слабым перемешиванием. Результирующую массу с кристалличностью около 35% распыляют через сопло диаметром 1,5 мм, снабженное в верхней части колонны распыления насосом высокого давления 150 кг/см².

Одновременно воздух с температурой 85^оС пропускают сверху колонны по направлению к сетчатому конвейеру для сбора распыленного продукта, расположенному внизу колонны; конвейер постепенно выводит результирующий кристаллический порошок из колонны в течение около 30 мин при прохождении воздуха с температурой 40^оС сверху через сетку.

Затем кристаллический порошок помещают в колонну старения и выдерживают 10 ч для кристаллизации и дегидратации. Таким образом получают кристаллическую 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновую кислоту чистоты около 95% с выходом около 70 мас. от исходной L-аскорбиновой кислоты.

Аналогично продукту по примеру А-1, продукты практически негигроскопичны, легко обрабатывается, свободны от прямой восстанавливающей активности и имеют удовлетворительно высокую стабильность и физиологическую активность. Поэтому продукт можно успешно использовать как улучшающий вкус агент, подкисляющий агент, стабилизатор, агент повышения качества, антиоксидант, физиологически-активный агент, УФ-поглощающий агент, фармацевтический агент и химикат для пищи, напитков, лекарств для соответствующих заболеваний и косметики, а также как агент для обогащения витамином С.

П р и м е р А-5. Кристаллическая 2-0- α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновая кислота.

П р и м е р А-5 (1). Получение α-глюкозидазы.

Mucor Javanicus IFO 4570 засевают и культивируют 44 ч при 30^оС при аэрировании и перемешивании в 500 мас.ч. культуральной среды, содержащей воду и 4,0 мас./об. мальтозы, 0,1 мас./об. одноосновного фосфата калия, 0,1 мас. /об. нитрата аммония, 0,05 мас./об. сульфата магния, 0,05 мас./об. хлорида калия, 0,2 мас./об. полипептона и 1 мас./об. карбоната кальция, стерилизованного нагревом и стерильно добавленного к воде перед засевом. После завершения культивирования мицелий выделяют и иммобилизуют обычным способом.

П р и м е р А-5 (2). Получение кристаллической 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты.

40 мас.ч. "SunmalT ® " кристаллической мальтозы производства Hayashibara Co, Ltd, Окайяма (Япония), растворяют в 70 мас.ч. воды при нагреве и к раствору добавляют 10 мас. ч. L-аскорбиновой кислоты в восстановительных условиях, а затем 10 ед/г мальтозы иммобилизованной α-глюкозидазы, полученной по примеру А-5 (1) и проводят реакцию 3 ч при рН 5,5 и 50оС без света.

Одна единица α-глюкозидазы определена как количество фермента, освобождающее 1 микромоль глюкозы при 37^оС за 1 мин при анализе в следующих условиях. После соответствующего разбавления 100 мкл раствора фермента прибавляют к смешанному раствору 250 мкл 4 мас./об. мальтозы и 750 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН 6,0) содержащего 1,35 мМ ЭДТУК и проводят реакцию в смеси 30 мин при 37^оС, инкубируют в кипящей воде 3 мин для суспендирования и центрифугируют. Затем отбирают 20 мкл супернатанта, к нему добавляют 1 мл Glucos B TEST", окрашивающего реагента для глюкозоксидазного способа, производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd Осака, Япония, инкубируют 20 мин при 37^оС для развития окраски и анализируют по поглощению при 505 нм.

Затем реакционную смесь фильтруют для выделения иммобилизованной α-глюкозидазы, которую повторно используют в другом опыте. Фильтрат обесцвечивают активированным углем и хроматографируют на колонке с сильнокислотной катионообменной смолой аналогично примеру А-2 с выделением фракции, обогащенной 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислотой, которую затем очищают катионообменной смолой аналогично примеру А-3, концентрируют под вакуумом приблизительно до 90 мас. помещают в кристаллизатор, добавляют затравочные кристаллы, кристаллизируют и отверждают в поддоне, подают в диспергирующий пуливеризатор, сушат и получают кристаллическую 2-0-α-D-глюкопиранозил-L-аскорбиновую кислоту чистоты около 88% с выходом около 20 мас. от исходной L-аскорбиновой кислоты.

По сравнению с продуктом по примеру А-1 продукт несколько хуже, но практически негигроскопичен, легко обрабатывается, не обладает прямой восстанавливающей активностью и имеет удовлетворительно высокую стабильность и физиологическую активность. Таким образом продукт можно с успехом использовать как агент, улучшающий вкус, подкисливающий агент, стабилизатор, агент повышения качества, антиоксидант, физиологически-активный агент, УФ-поглощающий агент, фармацевтический агент и химикат для пищи, напитков, лекарств для соответствующих заболеваний и косметики, а также как агент обогащения витамином С.

Формула изобретения

1. Кристаллическая 2-О- a -D-глюкопиранозил-L-аскорбиновая кислота общей формулы где n 0 6 целое число.

2. Кислота по п. 1, обнаруживающая при рентгеноструктурном анализе ее порошка следующие основные дифракционные углы (2Θ):10,3°; 14,8^o; 16,2^o; 18,4^o и 24,5^o.

3. Способ получения кристаллической 2-О- α -D-глюкопиранозил-L-аскорбиновой кислоты общей формулы
где n целое число,
отличающийся тем, что раствор, содержащий по крайней мере 1 мас. L-аскорбиновой кислоты и α -глюкозилсахарид, выбранный из группы, содержащей мальтоолигосахарид, продукт частичного гидролиза крахмала, превращенный в жидкость, студнеобразный крахмал, растворимый крахмал и их смеси с концентрацией в 0,5 30,0 раз выше, чем у L-аскорбиновой кислоты, подвергают действию сахаридпереносящего фермента, выбранного из группы, содержащей цикломальтодекстрингглюканотрансферазу (ЕС 2.4.1.19) и a -глюкозидазу, возможно в присутствии глюкоамилазы (ЕС 3.21 3) pH 3 9 при 20 80^oС, после чего выделяют и очищают полученную 2-О- a -D-глюкопиранозил-L-аскорбиновую кислоту, готовят ее перенасыщенный раствор со степенью перенасыщенности 1,05 1,5 и кристаллизуют, причем реакция заканчивается в течение 3 80 ч.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что кристаллизацию проводят в присутствии затравочного кристалла в количестве 0,1 10,0 мас.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5