Система для разделения фракций при определении содержания вещества в пробе

 

Изобретение относится к медицине и предназначено для проведения разнообразных исследований, преимущественно в неонаталогии и иммунологии. Целью изобретения является механизация разделения фракций, снижение количества необходимого для анализа материала, расхода реактивов. Сущность изобретения заключается в том, что в случае необходимости исследования различных веществ, находящихся вместе, например твердой фазы, из которой проводилось вымывание необходимого для анализа вещества, или двух различных антител, предлагаемая система позволяет разделить эти вещества для их последующего дифференцированного анализа. Эта система позволяет проводить анализ небольших количеств концентрируемых за счет ее применения веществ, экономить дорогостоящие реактивы и использовать небольшое количество исследуемого материала. Система для разделения фракций при определении содержания веществ в пробе содержит многолуночное основание, прокладку с капиллярными отверстиями и крышку, размещенные в центрифуге. 1 ил.

Изобретение относится к медицине и предназначено для проведения разнообразных исследований, преимущественно в неонаталогии или в иммунологии.

Известен способ проведения количественного определения концентрации фенилаланина в пробирках, например метод MoCaman.

Более совершенным способом, впервые использованным в практике неонатальных исследований, является способ, сущность которого состоит в определении концентрации фенилаланина в водных элюатах из сухих пятен крови, в условиях проведения реакции в многолуночном микропланшете и последующем измерении флюоресцентных сигналов на флюориметре в течение одной минуты.

Известно также применение центрифугирования микропланшетов (например с помощью центрифуги GS-15 ротор S-20-96, Beckman USA), однако в этих случаях происходит обыкновенное осаждение раствора внутри каждой лунки, не разделяя фракции в разные емкости.

Известно также устройство для фильтрования растворов из одного микропланшета с фильтром вместо дна в другой, находящийся под ним, с применением вакуумного устройства, но в этом случае фракционирование ведется не полностью и просачивающаяся жидкость размазывается по всем стенкам, что не позволяет проводить реакцию на дне лунки. Это устройство позволяет собрать материал на фильтр-дно для последующего его вырезания и исследования (MultiSoreen Assay System, Millipore). Кроме того, велик коэффициент вариации проходящего через фильтр количества раствора, так как в задачу этого устройства не входит полноценный сбор отфильтрованной жидкости.

В количестве прототипа выбрано устройство (96 Well Filter Strip Spacer Catalоg No 8585 фирмы Costar nuclepore), включающее 96-луночную прокладку c отверстиями, расположенную между микропланшетами, где дно верхнего выполнено в виде фильтров, располагаемых в центрифуге, что позволяет фильтрат из верхнего микропланшета собирать в лунки нижнего.

Однако все эти способы обладают существенными недостатками: при исследовании определения в нем содержания вещества от кровяного диска, из которого проводилась элюация, происходит либо переносом элюата в другой микропланшет, что вносит дополнительные ошибки дозирования, либо изъятие кровяных дисков после элюации вручную из каждой лунки микропланшета, при этом часть элюата теряется вместе с отбрасываемым диском. При этом возникает необходимость проводить элюацию в большом количестве раствора, что существенно разбавляет исследуемую пробу и снижает качество исследования. Прокладки фирмы Castar nuclepore имеют некапиллярные отверстия и малое углубление, что не позволяет препятствовать произвольному вытеканию жидкости из верхнего микропланшета в лунки нижнего до прохождения необходимой реакции.

Суть предлагаемого устройства состоит в том, что диски выполняют диаметром 3-4 мм в емкости прокладки, каждая из которых имеет капиллярное отверстие, помещают прокладку на многолуночное основание так, чтобы каждая емкость располагалась над соответствующей лункой основания, проводят элюацию в емкостях прокладки, после чего многолуночное основание, крышку и прокладку между ними размещают в центрифуге, где под действием центробежной силы элюат через капиллярные отверстия в емкостях прокладки перемещается в соответствующие лунки микропланшета и используется для исследования.

Целью изобретения является преодоление невозможности проведения реакции в описанных выше устройствах и полноценного отделения фракции, содержащей максимальное количество концентрированного элюата для исследования, от кровяных дисков, не подлежащих исследованию.

На чертеже представлена схема системы для разделения фракций при определении содержания вещества в пробе.

Система состоит из многолуночного основания 1, прокладки 2 и крышки 3.

Устройство используется следующим образом. Кровяные диски диаметром 3 мм помещают в предварительно смоченные обводненные этанолом емкости прокладки 2, помещенные на белое многолуночное основание 1, после чего в эти же емкости доливают по 35 мл 80%-ного этанола, закрывают плотной крышкой 3 и помещают на ночь при 4-8^оС, затем добавляют в каждую емкость прокладки 2 по 30 мкл 80% -ного этанола; помещают под крышкой 3 на встряхиватель на 5 мин для элюации, затем центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, после чего прокладку 2 с дисками отбрасывают, а в лунки многолуночного основания 1 с отделенным элюатом добавляют инкубационную смесь, состоящую из 0,6М натрий сукцинатного буфера рН 5,9, водного раствора нингидрина (10 мг/мл) и водного раствора L-лейцил-L-аланина (2,5 мг/мл) в пропорции 5:2:1. После 1-минутного встряхивания многолуночное основание 1 с крышкой 3 помещают в термостат на 80 мин для инкубации при 60^оС. По окончании инкубации многолуночное основание 1 без крышки 3 охлаждают при температуре -12-18^оС в течение 5 мин, затем останавливают реакцию медным реактивом и встряхивают при комнатной температуре 10-15 мин, после чего проводят измерение уровня флюоресценции во флюориметре и расчет концентраций фенилаланина исследуемых проб по отношению к калибраторам.

Полученные результаты имеют коэффициент корреляции 0,98 по отношению к результатам измерения альтернативными методами (измерения концентрации фенилаланина в сыворотке тех же пациентов, проводимые под контролем контрольного материала фенилаланина производства фирмы Sigma США).

Формула изобретения

СИСТЕМА ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИЙ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ СОДЕРЖАНИЯ ВЕЩЕСТВА В ПРОБЕ, содержащая крышку, многолуночное основание, прокладку с отверстиями, расположенными над соответствующими лунками основания, при этом крышка, многолуночное основание и прокладка между ними размещены в центрифуге, отличающаяся тем, что, в прокладке выполнены емкости с капиллярными отверстиями.

РИСУНКИ

Рисунок 1