Состав для стабилизации плазмы крови в ходе пастеризации и способ пастеризации плазмы крови

 

Изобретение относится к составу, предназначенному для стабилизации плазмы крови, полной или лишенной криопротеинов, в ходе пастеризации. Состав по изобретению позволяет пастеризировать очень большие объемы плазмы (до нескольких сотен литров). Изобретение относится также к способу пастеризации плазмы, использующему стабилизирующий состав. Полученная пастеризованная плазма предназначена для терапевтического применения.

Изобретение относится к составу, позволяющему стабилизировать плазму крови в ходе пастеризации, к способу, использующему названный состав, и к полученным таким путем плазматическим растворам, предназначенным особенно для терапии, использующей заменители плазмы и факторы V, XI и XIII свертывания крови.

Вся плазма человека или лишенная криопротеинов используется в терапии при больших ожогах, для пациентов с обширными травмами или подвергнутых значительным хирургическим вмешательствам, т.е. во всех случаях, где пациенты переносят значительные потери жидкостей.

Обычно для этого типа терапии используют плазму от единых доноров, здоровых и предварительно проверенных пациентов, чтобы избежать опасностей переноса вирусных заболеваний. Однако эта процедура не позволяет устранить все опасности заражения вирусами в предсерологическом периоде, особенно различными вирусами гепатита и вирусом СПИДа.

Цель изобретения разработать метод вирусной инактивации, который не ухудшает различные биологические функции плазмы.

Было доказано, что вирус гепатита В является совершенно неактивным в результате нагревания при 60^оС в течение 10 ч, в присутствии 0,5-молярного цитрата натрия (Tabor et al. Thrombosis Res. 22, 1981, 233-238). Однако эта обработка вызывает потерю биологической активности некоторых протеинов плазмы (Tabor et al et Barrowceiffe et al. Fr. I.Haematology, 55, 1983, 37-46).

Различные протеины, представляющие интерес для терапии, выделенные и очищенные из плазмы крови, можно было подвергать классической пастеризации при 60^оС в течение 10 ч в присутствии различных стабилизаторов. Однако установили, что молекулы, которые стабилизируют биологическую активность, могут быть полностью неэффективны в другом аспекте активности.

Альбумин может быть стабилизирован ацетил-триптофаном и каприлатом (Gellis et al. I.Clin. Invest 27, 1948, 239-244), в то время как эти же стабилизаторы не оказывают действия на плазминоген. Тромбин можно стабилизировать высокими концентрациями глюкозидов (Seegers. Arch. Biochem. 3, 1944, 363-367), тогда как эти последние не защищают протромбин. Добавление аминокислоты и глюцида дает хорошие результаты с фактором VIII и антитромбином III.

Известна стабилизация альфа-антитрипсина, антитромбина III, прекалликреина, фибронектина и фактора VIII в присутствии многоатомного спирта, в качестве последнего приведена сахароза; однако при тех же условиях фактор IX и прекалликреин теряют всю свою терапевтическую активность.

Эти различные экспериментальные данные подтверждают мнение о том, что вирусная инактивация всей плазмы (свежей плазмы, замороженной свежей плазмы или всплывающего криоосадка) не может быть осуществлена пастеризацией.

Так как в медицине существует дефицит общей плазмы, заявитель ставил своей целью разработать состав, обеспечивающий одновременную защиту биологической активности всех факторов, представляющих интере для терапии, против денатурации в ходе пастеризации.

С учетом того, что сорбит дает определенную защиту против термической денатурации, но с изменяющимися результатами в зависимости от образцов плазмы и с небольшими выходами, заявитель разработал различные добавки, смесь которых с сорбитом повышает его стабилизирующую способность.

Предлагаемый стабилизирующий состав образован из смеси сорбита, хлористого кальция, гепарина и лизина. Концентрации различных компонентов регулируют так, чтобы получить следующую конечную концентрацию в плазме для пастеризации: 50-80% сорбита, предпочтительно 60% 0,1-1 ед./мл гепарина, преимущественно 0,5 ед./л; 1-10 г/л лизина, предпочтительно 4 г/л, 3-5 ммоль CaCl₂, предпочтительно 4 ммоль.

Состав по изобретению добавляют к свежей плазме или к замороженной оттаявшей свежей плазме, или к плазме, лишенной протеинов криоосадка, перед тем как подвергать последнюю пастеризации нагреванием при 60^оС ± 1^оС в течение 10 ч.

После пастеризации температуру постепенно снижают до 20^оС, и раствор подвергают диализу, чтобы удалить сорбит и гепарин. Буферный раствор диализа имеет рН 7, содержит цитрат натрия концентрацией между 4 и 10 ммоль, хлористый кальций 4 ммоль, хлористый натрий 0,13 моль и лизин концентрацией 4 г/л. В зависимости от потребностей можно использовать также буферные растворы диализа различного состава. Затем раствор концентрируют, чтобы восстановить физиологическую дозировку плазматических протеинов. Получающийся раствор подвергают стерилизационному фильтрованию, кондиционированию, затем замораживают или подвергают лиофилизации.

Предложенный способ пастеризации плазмы заключается в добавлении состава по изобретению в плазму перед ее нагреванием и затем в диализе пастеризованной плазмы относительно определенного выше буферного раствора.

Этот способ особенно ценен тем, что он может быть применен к большим партиям плазмы, поступающей от нескольких независимых сборов. В частности, пастеризация партий от 100 до 200 л или больше позволяет после осуществления соответствующих проверок, гарантировать постоянное качество партий.

С другой стороны, партии плазмы, пастеризованные способом по изобретению, могут служить также продуктами заменителями, для больных, имеющих дефицит факторов коагуляции, в том числе когда нет таких очищенных концентратов, как фактор V, фактор XI и фактор XIII.

Следовательно, изобретение относится также к пастеризованным плазматическим растворам, полученным предложенным способом и особенно предназначенным, с одной стороны, для лечения дефицита факторов V, XI, и XIII коагуляции и, с другой стороны, для терапии, использующей заменители и требующей общей плазмы или всплывающего криоосадка.

П р и м е р. К двум литрам оттаившей плазмы добавляют гепарин (1000 ед. ), лизин (8 г) и хлористый кальций 220 мг. Эти два продукта добавляют в форме порошкообразных солей, плазму подвергают осторожному перемешиванию. Затем постепенно вводят 1200 г нерастворенного сорбита.

Пастеризацию осуществляют в сосуде объемом 5 л нагреванием при 60^оС в течение 10 ч при помощи или водяной бани, или в термостатированном резервуаре. После пастеризации сорбит и гепарин удаляют диализом с искусственной почкой или с системой ультрафильтрации, как система Пелликон М на кассетах, используя цитрат-буферный раствор, содержащий лизин при концентрации 4 г/л, CaCl₂ концентрацией 4 ммоль и NaCl концентрацией 0,13 моль. Диализ может сопровождаться концентрированием на таком же материале, чтобы довести количества факторов коагуляции приблизительно до 1 единицы/мл, что является хорошим качеством терапевтической плазмы. Материал подвергают диализу до осмолярности 370 мосмол/л и рН=7. Затем продукт стерильно фильтруют, например, на фильтре Миллипак М 40 (миллипор) с порами 0,22 мкм. Продукт распределяют в пластиковые мешочки для замораживания или в медицинские флаконы для лиофилизации.

Стабилизация плазмы при пастеризации и ультрафильтровании добавлением кальция, гепарина и лизина позволяет получать следующие выходы по сравнению с контрольным образцом, содержащим только лизин и сорбит. FVIIIc 87% против 66% FVc 77% против 35% FVIIC 55% против 52% FIXc 60% против 49% свертываемый фибриноген 81% против 57% FXIII 77% против 71% Не наблюдалось признаков активации факторов коагуляции в присутствии этого количества кальция. Таким образом, отношение FVII быка /FVII коагулянта составляет 0,95 против 1,09 для одного контрольного образца. Стабильность, испытанная в зависимости от активности FVIII после 24 ч консервации продукта в жидком состоянии и при комнатной температуре, не ухудшилась по сравнению с контрольным образцом (восстановление 100% активности).

Это подтверждает процентное содержание РКА<2% для пастеризуемых продуктов и контрольных образцов.

Кроме того, опыты на крысах, которым вводили внутривенно пастеризованную таким методом плазму показывают отсутствие гипотензивного эффекта и не обнаруживают никакого изменения сердечного ритма.

Формула изобретения

1. Состав для стабилизации плазмы крови в ходе пастеризации, содержащий герапин, отличающийся тем, что он дополнительно содержит сорбит, хлористый кальций и лизин при следующем соотношении компонентов в литре плазмы: Сорбит 500 800 г Гепарин 100 1000 Е
Хлористый кальций 3 5 ММоль
Лизин 1 10 г
2. Способ пастеризации плазмы крови путем ее термообработки с добавлением гепарина, отличающийся тем, что перед обработкой к ней добавляют сорбит из расчета 500 800 г/л, гепарин 100 1000 Е/л, кальций хлористый 3 5 ММоль, лизин 1 10 г/л, затем проводят диализ при рН 7, против буферного раствора, содержащего цитрат натрия 4 или 10 ММоль, хлористый кальций 4 ММоль, хлористый натрий 0,13 ММоль и лизин 4 г/л.

PC4A Государственная регистрация перехода исключительного права без заключения договора

Лицо(а), исключительное право от которого(ых) переходит без заключения договора:
Ассосьасьон Пур Л'Ессор де ля Трансфьюзон Сангин Дан ля Режьон дю Нор (FR)

(73) Патентообладатель:
Этаблиссман Франсе дю Сан (FR)

Дата и номер государственной регистрации перехода исключительного права: 02.11.2010 № РП0001096

Извещение опубликовано: 20.12.2010        БИ: 35/2010

---