Антиген нематоды trichinella spiralis

 

Использование: в диагностических препаратах при диагностике нематодозов. Сущность изобретения: для получения вещества, обладающего высокой гемагглютинирующей активностью, из гомогената мышечных личинок или половозрелых особей трихинелл методом препаративного электрофореза в 10 %-ном полиакриламидном геле в трисглициновой буферной системе (pH - 8,6) выделяют антиген нематоды Trichinella Spiralis с молекулярной массой от 16 до 20 кД. Элюирование белковой фракции проводят 5 мМ раствором NaHCO₃. Полученное вещество обладает высокой гемагглютинирующей активностью и может быть использовано в гельминтологии в диагностических целях. 1 ил., 1 табл.

Изобретение относится к новому диагностическому препарату и может быть использовано в лабораторной практике для диагностики нематодозов.

Известные гемагглютинины различных вирусов, например гриппа, полиомы, пневмовирусов и т. д.(Вирусология./Под ред.Б. Мейхи, М. 1988) используются для диагностики вирусных заболеваний и не могут применяться в гельминтологии.

Известно вещество, обладающее геммагглютинирующей активностью. Это лектин, выделенный из стенки кишечника Ascaria lumbricoides.

Однако применение его в диагностических целях еще не известно.

Для получения вещества, обладающего высокой гемагглютинирующей активностью, из гомогената мышечных личинок или половозрелых особей трихинелл методом препаративного электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле в трисглициновой буферной системе (рН 8,6) выделяют антиген нематоды T.spiralis с молекулярной массой от 16 до 20 кД. Элюирование белковой фракции проводят 5 мМ раствором NaHCO₃.

П р и м е р 1. Получение вещества. Белковые экстракты из мышечных личинок или половозрелых особей трихинелл получают гомогенизацией в электрическом гомогенизаторе типа Поттера-Эльвегейма в 0,25 М растворе сахарозы с последующей ультразвуковой обработкой. Неразрушенные фрагменты трихинелл отделяют центрифугированием при 6-8 тыс. об/мин. В полученном супернатанте определяют концентрацию белка по методу Лоури. Супернатант в количестве 10 мг (по белку) фракционируют методом электрофореза в вертикальном 10%-ном полиакриламидном геле с толщиной 2 мм в трис-глициновой буферной системе (рН 8,6). Белковую зону с Rf 0,8-0,9 вырезают из гелевого блока и помещают в 5 мМ раствор NaHCO₃ на 18 ч при 37^оС. Экстрагируемый белок освобождают от геля, отжимая последний на фильтре "Владипор"-5 с помощью стеклянного шприца. В полученном белковом экстракте определяют концентрацию белка по методу Лоури. Жидкий белковый экстракт помещают для хранения в жидкий азот или подвергают лиофильной сушке.

П р и м е р 2. Изучение химической природы гемагглютинина нематоды. Trichinella spiralis.

Гемагглютинин нематоды T.spiralis является гликопротеидом с молекулярной массой 16-20 кД. Углеводная часть представлена N-ацетилгалактозамином и N-ацетилнейраминовой кислотой.

Изоэлектрическая точка рI 5,9±0,1. Максимум поглощения в УФ-спектре при 280 нм ( фосфатном буфере рН 7,2-7,4).

Выявленный гемагглютинин обладает гликозидазной (сиалидазной) активностью.

Выход гемагглютинина составляет 20-25% по отношению к белку гомогената трихинелл.

Гемагглютинин нематоды T.spiralis является группоспецифичным антигеном (торможение трихинеллезной и токсокарозной антисыворотками в реакции РТГА).

П р и м е р 3. Оценка гемагглютинирующей активности белковой фракции с молекулярной массой 16-20 кД, выделенной из гомогената нематоды.

Гемагглютинирующую активность определяют при помощи реакции гемагглютинации в стандартных 96-луночных планшетах с V-образными лунками (Ленинград) методом двухкратных серийных разведений выделенной белковой фракции. Для реакции используют 0,33% и 1,0% формалинизированные эритроциты барана в 0,3% -ном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) на фосфатно-солевом буфере (3ФР) рН 7,2-7,4. Условия проведения реакции: комнатная температура (20-22^оС); время выдерживания реакции 60 мин, дополнительное подтверждение учета результатов через 24 ч.

Типичный результат титрования гемагглютинина трихинелл приведен в таблице.

На чертеже показано титрование гемагглютинина нематоды Т.spiralis, 1-й ряд контроль 1% формалинизованных эритроцитов барана; 2-й ряд ГА из гомогената кишечных трихинелл; 3-й ряд ГА из гомогената мышечных трихинелл.

Гемагглютинин нематоды Т.spiralis агглютинирует 0,33% или 1% формалинизированные эритроциты барана при концентрации белка 100-200 мкг/мл (для кишечной формы трихинелл) и 200-400 мкг/мл (для мышечных личинок трихинелл) или при титрах 16-32 гемагглютинирующие единицы (ГАЕ).

П р и м е р 4. Использование гемагглютинина нематоды Trichinella spiralis в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Выделенный из гомогената нематоды T.spiralis гемагглютинин может быть использован в диагностических исследованиях на нематодозы в реакции торможения гемагглютинации.

Постановка реакции.

1. Титрование гемагглютинина. С выделением гемагглютинином предварительно ставят реакцию гемагглютинации, как описано в примере N 3 для определения ГА (гемагглютинирующего)-титра антигена. ГА-титром считают обратную величину наибольшего разведения ГА-антигена, при котором еще происходит полная агглютинация. Такое разведение содержит 1 гемагглютинирующую единицу.

Для титрования сывороток в РТГА используют 4 ГА-единицы гемагглютинина нематоды Т.spiralis. Таким образом, если ГА-титр гемагглютинина нематоды Т. spiralis равняется 32, то для обнаружения антител к нему необходимо развести антиген в восемь раз. Разведенный антиген стабилен в течение 24-48 ч при 4^оС.

2. Предварительная обработка сыворотки.

Все сыворотки содержат неспецифические ингибиторы гемагглютинации и естественные агглютинины. Поэтому сыворотки перед постановкой реакции должны быть обработаны адсорбцией на каолине, а затем адсорбцией на эритроцитах того вида, который используют в реакции.

3. Проведение реакции торможения гемагглютинации.

С помощью микротитратора готовят последовательные двукратные разведения сыворотки с равным объемом 0,3% БСА в фосфатно-солевом буфере (рН 7,2). В каждую лунку с разведенной сывороткой вносят по одному объему ГА-антигена из гомогената нематоды T.spiralis, содержащего 4 ГА. Параллельно ставят контроль сыворотки и контроль ГА-антигена с 0,3 БСА. Планшет закрывают и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Спустя это время во все заполненные лунки вносят по 2 объема 0,33 суспензии формалинизированных эритроцитов барана в 0,3 БСА на 3ФР. Планшеты ставят на 1-2 ч (или на ночь) при комнатной температуре. Просматривая планшеты, определяют титр специфических антител в исследуемой сыворотке, который представляет собой обратную величину разведения, при котором полностью подавляется гемагглютинация. Наличие специфических антител (антигемагглютининов) в исследуемой сыворотке считают доказанным при титре 1:16 и выше.

Таким образом, предлагаемое вещество обладает высокой гемагглютинирующей активностью и может быть использовано в гельминтологии в диагностических целях.

Формула изобретения

АНТИГЕН НЕМАТОДЫ TRICHINELLA SPIRALIS, обладающий гемагглютинирующей активностью, проявляющейся в области рН 7,2 - 8,0 и сопровождающийся гликозидазной (сиалидазной) активностью, выделенной из смеси белков, полученной при гомогенизации нематоды Trichinella spiralis, имеющий следующие свойства: -мол. м. 16 - 20 кД (при определении методом аналитического электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и использовании в качестве маркеров тиреоглобулина (330 кД), феритина (220 кД), каталазы (60 кД), альбумина (67 кД), овальбумина (43 кД), лактатдегидрогеназы (36 кД), лактальбумина (14,4 кД); - изоэлектрическая точка pI 5,9 ± 0,3 (при определении турбидиметрическим методом); -наличие углеводного остатка, дающего окрашивания с антронсерной кислотой; -спектры: максимум поглощения в УФ при 280 нм (в фосфорном буфере с рН 7,2 - 7,4).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2