Штамм актиномицета streptomyces avermitilis - продуцент авермектинов
Использование: микробиологическая промышленность, касается производства антипаразитарных препаратов, действующим веществом которых являются авермектины. Сущность изобретения: штамм Streptomyces avermitilis-ВНИИСХМ-54 получен путем естественного отбора из популяции штамма Streptomyces avermitilis-51. Штамм N 54 продуцирует в два раза больше авермектинов по сравнению с известным штаммом. Процентное содержание наиболее активного вещества авермектина В1а достигает более 35%. Штамм Streptomyces avermitilis-ВНИИСХМ-54 депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (Санкт-Петербург) под номером Streptomyces avermitilis-ВНИИСХМ-54. 2 табл., 1 ил.
Изобретение относится к получению биологически-активных веществ путем микробиологического синтеза, а именно к производству антипаразитарных препаратов на основе авермектинов.
Известен штамм продуцент авермектинов Streptomyces avermitilis ATCC 31372, продуцирующий в среднем 500 мкг/мл авермектинов. Цель изобретения создание штамма, продуцирующего повышенные количества авермектинов с преобладающим содержанием в авермектиновом комплексе авермектинов серии В1 (В1а и В1б) наиболее активных в биологическом отношении. Цель достигается получением штамма Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54, продуцирующего в среднем 1500 мкг/мл авермектинов при размахе изменчивости 1200-1800 мкг/мл. Предлагаемый штамм был получен путем направленной селекции из популяции штамма Streptomyces avermitilis-51. Отбор активных вариантов проводили по двум признакам: по способности к авермектинообразованию (оценивалась способность вариантов продуцировать весь авермектиновый комплекс); и по способности к биосинтезу авермектинов серии В1 (оценивалась способность вариантов продуцировать только авермектин В1а и авермектин В1б). Схема получения штамма представлена на чертеже. На чертеже приведено общее содержание авермектинов (мкг/мл) процентное содержание авермектинов серии В1 в авермектиновом комплексе (%). Предлагаемый штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками. Микроморфологические признаки штамма. Культура имеет спороносцы в виде правильных спиралей. Макроморфологические и культуральные признаки. На 2% -ном глюкозокартофельном агаре на 14-21 день роста при 28оС, рН 6,8-7,2 образуются колонии диаметром 10 мм со светло-серым воздушным мицелием и темно-каштановой обратной стороной колонии. В популяции всегда имеется до 5% светло-серых колоний с бежевой обратной стороной. Край колоний неровный с белым ободком. Поверхность колонии складчатая. В центре колонии имеется возвышение, иногда с кратером. К десятому дню роста на поверхности колонии образуются белые бархатистые включения. В табл. 1 представлены данные о цвете воздушного и субстратного мицелия, интенсивности спороношения, а также о наличии или отсутствии растворимых пигментов на различных органических и синтетических агаризованных средах. Сведения о физиолого-биохимических признаках суммированы в табл. 2. Максимальное накопление авермектинов наблюдается на 5-7-е сутки при 28оС и скорости растворения кислорода 1,0-1,2 мМоль О2/л/мин. Антагонистические свойства. Мицелиальные экстракты вызывают гибель нематод, относящихся к родам: Haemonehus, Trichostronglus, Ostrertagis, Nematodimes, Coopema, Ascams, Bunostomum, Oesophagostonum, Chabertia, Triehuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocanlus, Capillaria, Meterakis, Toxocara, Oxyuris, Ancylostama, Uncinaria, Toxascaris, Parascaris, Ascoridia. Также их действие губительно для клещей, афидов, вшей, блох, мух, тараканов, двукрылых и прямокрылых вредителей, платяной моли, ковровых и обойных жучков. Предлагаемый штамм иллюстрируется следующим примером. Споры штамма S. avermitilis-ВНИИСХМ-54 выращивают на овсяном агаре в течение 10 суток при 28 1оС. Кусочек агаровой среды со спорами вносили в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие 75 мл среды следующего состава, глюкоза 4,0; соевая мука 0,6; белково-витаминный концентрат 1,0; кукурузный экстракт 0,3; СаСО3 0,1; К2НРО4 0,06; вода водопроводная. Глюкозу стерилизуют отдельно при 0,5 атм 30 мин, она вносится в колбы в момент засева. Остальные компоненты стерилизуют при 0,8 атм 40 мин. Значение рН до стерилизации 6,2. Колбы устанавливают на качалку с числом оборотов 220 в минуту и выращивают инокулят при температуре 28 1оС в течение 24 ч. Затем инокулят в количестве 5% передают в колбы с ферментационной средой следующего состава, глюкоза 7,0; соевая мука 0,6; белково-витаминный концентрат 1,0; кукурузный экстракт 0,3; СаСО3 0,1; К2НРО4 0,06; вода водопроводная. Значение рН до стерилизации 6,2. Глюкозу стерилизуют при 0,5 атм 30 мин, а остальные компоненты при 0,8 атм 40 мин. Глюкозу вносят в колбы в момент засева среды инокулятом. Ферментацию проводили в течение 168 ч при 28оС. Авермектины выделяли из мицелия следующим образом. Вначале отделяли мицелий на центрифуге при 3000 об/мин в течение 10 мин. К влажному осадку, полученному из 10 мл культуральной жидкости, добавляли 10 мл охлажденной водопроводной воды, тщательно перемешивали при 3000 об/мин 5 мин. К влажному промытому осадку добавляли 10 мл этанола и проводили экстракцию авермектинов при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 20 мин. После отделения мицелия при 3000 об/мин в течение 5 мин в центрифугах определяли общее содержание и компонентный состав авермектинов методом тонкослойной хроматографии с количественной оценкой метаболитов в пятнах на хроматограмме с помощью сканирующего спектрофотометра КМ-3 фирмы "Opton" (Австрия) при длине волны 244 нм (максимуме поглощения авермектинов). Хроматографическое разделение осуществляли на пластинах силикагеля G-60 фирмы "Merk" без люминофора в системе растворителей гексан: ацетон:метанол (14,0:6,0:0,5). Концентрацию авермектинов определяли по уравнениям калибровочных кривых для авермектинов А2 и В1. Среднее содержание авермектинов в мицелии S. avermitilis-ВНИИСХМ-54 составляет 1500 мкг/мл при размахе изменчивости 1200-1800 мкг/мл. Компонентный состав авермектинов следующий, группа А1 (А1а + А1в) 18,0 1,85; А2(А2а+А2в) 26,32 1,62; В1(В1а+В1в) 36,75 1,35 и В2(В2а+ В2в) 18,88 1,64. Известный штамм S. avermitilis-51 продуцирует в среднем 700 мкг/мл авермектинов. Таким образом, предлагаемый штамм продуцент авермектинов S. avermitilis-ВНИИСХМ-54 позволяет получать авермектинов в два раза больше, чем известный штамм S. avermitilis-51.Формула изобретения
Штамм актиномицета Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54 - продуцент авермектинов.РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 29.12.2004
Извещение опубликовано: 27.11.2005 БИ: 33/2005