Способ получения пурпурина-18

 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения пурпурина-18, используемого в медицине для лечения онкологических заболеваний. Способ заключается в том, что пурпурин-18 получают путем извлечения производных хлорофилла из растительного сырья, их окисления в среде спиртовой щелочи с использованием кислорода воздуха с образованием неустойчивого хлорина, с последующим его превращением в целевой продукт, его очистку на силикагеле и кристаллизацию. Новым в способе является использование в качестве сырья отхода производства лекарственных препаратов после их извлечения из растительного сырья, извлечение производных хлорофилла проводят с помощью C₂ - C₅ спиртов, а превращение неустойчивого хлорина осуществляют его обработкой кислотой до pH 1,5 и перед очисткой на силикагеле целевой продукт обезжиривают неполярным растворителем и извлекают хлороформом. Технический результат заключается в увеличении выхода и упрощении способа получения за счет исключения некоторых трудоемких операций и исключения взрывоопасного и вредного растворителя. Способ позволяет получать чистый продукт (чистота 92 - 95%) с высоким выходом и рационально использовать неутилизируемые отходы, загрязняющие окружающую среду. 3 ил.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, конкретно к способу получения пурпурина-18, используемого при создании препаратов для лечения онкологических заболеваний.

Известны способы получения пурпурина-18 в лабораторном исполнении из растительного сырья путем экстракции свежего или специально высушенного сырья полярными раствоpителями (спирт, ацетон) и получения экстракта суммы хлорофиллов а и b. Из хлорофильного экстракта осаждают сумму феофитинов а и b, из которых путем хроматографической очистки выделяют чистый феофитин а. Из феофетина а получают пурпурин-18 путем окисления в спиртах (метиловом, этиловом, пропиловом), содержащих щелочь с образованием промежуточного "неустойчивого хлорина" и обработкой его при нагревании и кипячении в органических растворителях или декарбоксилирующими агентами. Выход целевого продукта составляет 10-15% от хлорофильных пигментов (Fisher H. Orth H. Die Chemie des Pyrrols. Leipzig, 1937, В 1/2; Moyer W.W. Studies in The chlorophyll serries III. Products of the Phase test. J.Am.Chem. Soc. 1980, v. 52, p. 3013-3023).

Однако все эти способы имеют низкий выход целевого продукта от исходного сырья, сложны, многостадийны, требуют заготовки сырья в больших объемах, расхода большого количества растворителей, нетехнологичны.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению (прототипом) по достигаемому результату является способ получения пурпурина-18, модифицированный на стадии очистки целевого продукта (Kenner G.W. M.c Combies W. Smith K.M. Separation and oxidative degradation оf chlorophyll derivatives. J.Chem.Soc. Perkin 1, 1973, p. 2517-2523). Способ заключается в том, что из растительного сырья (шпината, крапивы, люцерны) выделяют путем его обработки органическим растворителем производные хлорофилла. Это осуществляется поэтапно. Сначала выделяют путем экстракции сырья полярным растворителем (этанолом или ацетоном) смесь хлорофиллов а и b, из которой при помощи реактива Жирара осаждают феофитины а и b. Далее из этой смеси получают чистый феофитин а путем хроматографической очистки на силикагеле, феофитин а затем подвергают окислительному расщеплению. Для этого полученный чистый феофитин а растворяют в диэтиловом эфире и добавляют к нему 20-30%-ный пропанольный раствор едкого кали. Реакционную смесь подвергают окислительному расщеплению путем барботирования воздухом при комнатной температуре в течение 2 ч до образования "неустойчивого хлорина". Промежуточный продукт неустойчивый хлорин затем обрабатывают, как описано. Для этого полученную смесь разбавляют водой, нейтрализуют при охлаждении концентрированной серной кислотой рН 4-5, многократно экстрагируют диэтиловым эфиром и упаривают на роторном испарителе с получением пурпурина-сырца, который затем подвергают очистке при помощи колоночной хроматографии на силикагеле и кристаллизации чистого продукта. Выход пурпурина-18 составляет 16-18% от исходного хлорофилла а (феофитина а).

Методика получения пурпурина-18 показана на фиг. 1.

Однако этот способ также многостадиен, трудоемок и не пригоден для промышленного получения пурпурина-18. Выход продукта низкий из-за потерь хлорофильных производных на стадиях обработки смеси хлорофиллов реактивом Жирара и хроматографической очистки на силикагеле с получением чистого феофитина а, а также при экстрагировании пурпурина-сырца диэтиловым эфиром из слабокислой среды, в которой часть неустойчивого хлорина при обработке не переходит в кислое соединение, а остается в водной фазе, что приводит к неполному образованию пурпурина. Кроме того, известный способ осуществим лишь в лабораторном исполнении, так как требует большого расхода растворителей, особенно диэтилового эфира, использование которого нетехнологично в производстве, создания сырьевой базы, заготовки и хранения больших объемов сырья, что ограничивает использование известного способа в промышленности.

Задачей изобретения является упрощение способа получения пурпурина-18, повышение выхода целевого продукта по упрощенной технологии за счет исключения некоторых трудоемких операций, а также исключения взрывоопасного и вредного растворителя (диэтилового эфира) при использовании доступного сырья.

Это достигается тем, что в способе получения пурпурина-18 путем обработки сырья растительного происхождения С₂-С₅ спиртами с извлечением производных хлорофилла, их окислительного расщепления в спиртовой щелочи с образованием промежуточного неустойчивого хлорина, его превращение осуществляют обработкой избытком концентрированной кислоты до рН < 1,5 и перед очисткой на силикагеле целевой продукт обезжиpивают неполярным растворителем и извлекают хлороформом.

Новым, согласно изобретению, является то, что в качестве сырья используют отход переработки растительного сырья после извлечения лекарственных препаратов (липидный концентрат или "смоляной отход"), извлечение производных хлорофилла проводят С₂-С₅ спиртами, а превращение неустойчивого хлорина осуществляют обработкой его избытком кислоты до рН < 1,5 и перед очисткой на силикагеле целевой продукт обезжиривают неполярным растворителем и извлекают хлороформом.

Использование в качестве исходного сырья для получения пурпурина-18 липидного концентрата (смоляного отхода) от переработки растительного сырья как травянистого, лекарственного, так и водорослей, позволяет извлечь производные хлорофилла без потерь и тем самым увеличить выход пурпурина из хлорофильных пигментов за счет того, что в нем производные хлорофилла присутствуют в основном в виде феофитина и сконцентрированы в отходе вместе с другими хлорофильными пигментами и примесями и при растворении полностью переходят в раствор. При этом исключаются потери производных хлорофилла в отличие от процесса экстрагирования из сырья, сам процесс значительно упрощается и нет стадии перевода смеси хлорофиллов в феофитины, как в прототипе. В качестве растворителя используются различные низкомолекулярные спирты С₂-С₅. Растворение липидного концентрата проводят при нагревании до 50-60^оС для обеспечения полноты перехода в раствор производных хлорофилла. После добавления в полученный раствор спиртовой щелочи проводят окислительное расщепление производных хлорофилла в 5-8%-ном растворе едкого натра или едкого кали при комнатной температуре в течение 1,0-1,5 ч и барботировании воздухом. Образующийся продукт "неустойчивый хлорин" обрабатывают на холоду избытком концентрированной кислоты (соляной, бромистоводородной, трифторуксусной), что приводит к образованию пурпурина-18. Реакцию ведут 2-3-кратным избытком концентрированной кислоты при рН < 1,5 в течение 30-60 мин на холоду. После этого из кислого раствора удаляют сумму высших жирных кислот, терпеновых соединений и каротиноидов (обезжиривают) с помощью неполяpных растворителей (петролейный эфир, бензин, бензол), что обеспечивает упрощение дальнейшей очистки целевого продукта. После нейтрализации водного раствора до рН 2,0-3,0 проводят экстракцию пурпурина хлороформом. Использование хлороформа имеет преимущество по сравнению диэтиловым эфиром в прототипе, так как предложенный растворитель более технологичен и не взрыво- и пожароопасен. Хлороформный экстракт промывают водой, сушат и упаривают досуха. Остаток подвергают флэш-хроматографии на силикагеле. Чистый пурпурин-18 элюируют смесью хлороформ/ацетон (5:1), упаривают и перекристаллизовывают из хлороформа с петролейным эфиром. Выход кристаллического пурпурина-18 составляет 25-30% в пересчете на исходный феофитин а, что почти в два раза превышает выход в прототипе. Подлинность продукта подтверждена данными физико-химических характеристик пурпурина-18, полученного предлагаемым способом (фиг. 3).

Технический результат заключается в увеличении выхода и упрощении способа получения за счет исключения некоторых трудоемких операций и исключения взрывоопасного и вредного растворителя.

Технологическая схема получения пурпурина-18 представлена на фиг. 2.

Характеристика целевого продукта Пурпурин-18. Структурная формула Брутто-формула С₃₃Н₃₂N₄O₅ Физико-химические показатели пурпурина-18 следующие: Внешний вид Фиолетовый криcталличеcкий порошок без запаха Раcтворимоcть Раcтворим в хлороформе, ацетоне, нераcтворим в воде Подлинноcть Выдерживает
Температура плавления
Хроматографичеcкая чиcтота Выдерживает
Маccовая доля пурпурина-18 в
переcчете на cухое вещеcтво 95% ± 3
Спектр поглощения а ацетоне λ, нм 696 (46200); 646,5; 544; 506,5; 479; 407 (11600); 359
¹H-ЯМР cпектр в дейтерохлороформе, 9,66 (β-H), c); 9,47 (α-H, c);
8,69 (δ-H, c);
м.д. 7,87 (2a-CH, к); 6,33 (2в-CH₂, м); 4,48
(7-H, м); 4,19 (8-H, м); 3,73 (5-CH₃,
c); 3,70
(4a-CH₂, к); 3,35 (1-CH₃,c); 3,17
(3-CH₃, c);
2,50
П р и м е р 1. 10 г липидного концентрата из аконита после извлечения аллопенина растворяют в 230 мл изопропанола при 50-60^оС и перемешивании. К полученному раствору приливают щелочной раствор, приготовленный следующим образом: 30 г NaOH растворяют в 20-30 мл воды, а затем в 220 мл изопропанола. Реакционную массу барботируют воздухом при комнатной температуре в течение 1-1,2 ч, затем прекращают барботаж и прибавляют к полученной массе 250-500 мл воды. Разбавленную водой массу подкисляют при охлаждении на водяной бане концентрированной соляной кислотой при перемешивании до сильнокислой реакции рН < 1 (130 мл).

Из кислого раствора экстрагируют сумму неполярных соединений (обезжиривают) петролейным эфиром 3 раза по 400 мл. Раствор каротиноидов в смеси с другими нейтральными компонентами промывают водой, отгоняют растворитель. Полученный продукт используется для извлечения из него суммы каротиноидов путем отмывки слабым раствором щелочи и хроматографической очистки на силикагеле.

Кислый водный раствор также частично нейтрализуют 10%-ным водным раствором NaOH до рН 2-3, для чего требуется прилить при перемешивании 100-140 мл щелочного раствора. Из полученного раствора экстрагируют пурпурин-17 хлороформом (3 раза по 400 мл). Полученный хлороформный экстракт промывают водой (3 раза по 300 мл) до рН 5-6, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают досуха. Полученный остаток растворяют в 50 мл хлороформа и используют для хроматографической очистки.

Технология предлагаемого способа подтверждается следующими примерами.

Очистку пурпурина проводят на силикагеле марки L 5х40 (12-15 г). Сорбент смешивают со 100 мл хлороформа и готовят из смеси суспензию, тщательно перемешивая компоненты, так как не допускается наличие комочков сорбента во взвеси. Суспензию сорбента в хлороформе наносят на фильтр, сверху помещают кружок фильтровальной бумаги, затем на фильтр наносят пурпурин, растворенный в хлороформе (30-50 мл). Хроматографирование ведут в следующей последовательности.

Сначала с сорбента смывают хлороформом фракцию 1 до исчезновения желтой окраски элюата. Элюат направляют на отгонку для получения каротиноидов и регенерации хлороформа (фракция 1). Во фракции 1 возможно наличие примеси феофитина при неполном прохождении реакции окисления.

Далее с сорбента смывают пурпурин смесью растворителей хлороформ/ацетон (5: 1) до исчезновения коричневого цвета в элюате. Из элюата при вакуумной отгонке получают пурпурин в 30 мл хлороформа и регенерируют растворители, в процессе элюирования проводят контроль методом ТСХ. При наличии примеси других, кроме пурпурина, компонентов на пластине (хлорины, феофитин) необходимо повторить хроматографию выделенного продукта на силикагеле в тех же условиях. Полученный пурпурин в остатке хлороформа (около 30 мл) переносится в фарфоровую чашку, где окончательно испаряется растворитель. В чашку приливают петролейный эфир (30 мл) и шпателем перемешивают (растирают) пурпурин. Эфирный раствор аккуратно сливают из чашки. Выход пурпурина-18 составляет 220 мг из 10 г исходной смолы, что составляет 28% от исходного феофитина а.

П р и м е р 2. 10 г липидного концентрата ламинарии после извлечения маннита растворяют в 200 мл пропанола при 50-60^оС и перемешивании. К полученному раствору приливают щелочной раствор, приготовленный из 30 г КОН в 30 мл воды и 200 мл пропанола. Реакционную массу барботируют воздухом при комнатной температуре в течение 1-1,2 ч, затем прекращают барботаж и прибавляют к полученной массе 500 мл воды. Разбавленную водой массу подкисляют при охлаждении на водяной бане концентрированной соляной кислотой при перемешивании до сильнокислой реакции рН < 1 (120 мл).

Из кислого раствора экстрагируют сумму неполярных соединений (обезжиривают) петролейным эфиром 3 раза по 400 мл. Кислый водный раствор нейтрализуют 10%-ным водным раствором NaOH до рН 2-3. Из полученного раствора экстрагируют пурпурин-18 хлороформом (3 раза по 400 мл). Полученный хлороформный экстракт промывают водой (3 раза по 300 мл) до рН 5-6, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают досуха. Полученный остаток растворяют в 50 мл хлороформа и используют для хроматографической очистки. Выход пурпурина-18 составляет 120 мг, что соответствует 24% от исходного феофитина а.

П р и м е р 3. 10 г липидного концентрата из наперстянки после извлечения целамида растворяют в 200 мл этанола при 50-60^оС и перемешивании. К полученному раствору приливают щелочной раствор 30 г NaOH в 30 мл воды и 200 мл этанола. Реакционную массу барботируют воздухом при комнатной температуре в течение 1,2 ч, затем прибавляют к 250 мл воды. Разбавленную водой массу обрабатывают при охлаждении на водяной бане концентрированной бромистоводородной кислотой при перемешивании до сильнокислой реакции рН < 1 (100 мл). Кислый раствор обезжиривают бензолом (3 раза по 400 мл).

Кислый водный раствор нейтрализуют 10%-ным водным раствором NaOH до рН 2-3. Из полученного раствора экстрагируют пурпурин-18 хлороформом. Полученный хлороформный экстракт промывают водой до рН 5-6, сушат и упаривают досуха. Полученный остаток растворяют в 50 мл хлороформа и используют для хроматографической очистки.

Выход пурпурина-18 280 мг, что составляет 32% от исходного феофитина а.

П р и м е р 4. 10 г липидного концентрата из паслена дольчатого после извлечения соласодина растворяют в 200 мл бутанола при 50-60^оС и перемешивании. К полученному раствору приливают щелочной раствор 30 г NaOH в 30 мл воды и 200 мл бутанола. Реакционную массу барботируют воздухом при комнатной температуре в течение 1,2 ч, прибавляют к 250 мл воды. Разбавленную водой массу обрабатывают при охлаждении на водяной бане концентрированной фтористоводородной кислотой при перемешивании до сильнокислой реакции рН < 1,5. Кислый раствор обезжиривают гексаном (3 раза по 400 мл), нейтрализуют 10%-ным водным раствором NaOH до рН 3. Из полученного раствора экстрагируют пурпурин-18 хлороформом. Полученный хлороформный экстракт промывают водой до рН 5, сушат и упаривают досуха. Полученный остаток используют для хроматографической очистки.

Выход пурпурина-18 200 мг, что составляет 26% от исходного феофитина а.

П р и м е р 5. 10 г липидного концентрата из подорожника после извлечения плантаглюцида растворяют в 200 мл амилового спирта при 50-60^оС и перемешивании. К полученному раствору приливают щелочной раствор 30 г NaOH в 50 мл воды и 100 мл амилового спирта. Реакционную массу барботируют воздухом при комнатной температуре в течение 1,2 часа и прибавляют к 250 мл воды. Разбавленную водой массу обрабатывают при охлаждении на водяной бане концентрированной соляной кислотой при перемешивании до сильнокислой реакции рН < 1 (100 мл). Кислый раствор обезжиривают бензином (3 раза по 400 мл).

Кислый водный раствор нейтрализуют 10%-ным водным раствором NaOH до рН 2. Из полученного раствора экстрагируют пурпурин-18 хлороформом. Полученный хлороформный экстракт промывают водой до рН 5-6, сушат и упаривают досуха. Полученный остаток растворяют в 50 мл хлороформа и используют для хроматографической очистки.

Выход пурпурина-18 240 мг, что составляет 30% от исходного феофитина а.

П р и м е р 6. 10 г липидного концентрата из сенны после извлечения антрасеннина растворяют в 200 мл этанола при 50-60^оС и перемешивании. К полученному раствору приливают щелочной раствор 30 г NaOH в 30 мл воды и 200 мл этанола. Реакционную массу барботируют воздухом при комнатной температуре в течение 1,2 ч и прибавляют к 250 мл воды. Разбавленную водой массу обрабатывают при охлаждении на водяной бане концентрированной бромистоводородной кислотой при перемешивании до сильнокислой реакции рН < 1,5 (100 мл). Кислый раствор обезжиривают бензолом (3 раза по 400 мл).

Кислый водный раствор нейтрализуют 10%-ным водным раствором NaOH до рН 2-3. Из полученного раствора экстрагируют пурпурин-18 хлороформом. Полученный хлороформный экстракт промывают водой до рН 5-6, сушат и упаривают досуха. Полученный остаток растворяют в 50 мл хлороформа и используют для хроматогра- фической очистки.

Выход пурпурина-18 180 мг, что составляет 22% от исходного феофитина а.

Полученный чистый пурпурин-18 является субстанцией для получения водорастворимого препарата хлорина р6. Пурпурин-18 и хлорин р6 являются эффективными фотосенсибилизаторами при лечении онкологических заболеваний при использовании метода фотодинамической терапии. Данные соединения превосходят по своим характеристикам применяемые в настоящее время препараты на основе гематопорфирина. В настоящее время ведутся активные поиски новых фотосенсибилизаторов на основе производных хлорофилла. Однако в нашей стране и за рубежом не имеется промышленных способов получения пурпурина-18 для создания препаратов на его основе. Предлагаемый способ позволяет решить эту проблему.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ получения пурпурина-18 из отходов переработки растительного сырья менее трудоемкий, более простой и технологичный, выход целевого продукта выше в 1,5-2 раза. При этом уменьшается использование вредных и взрыво- и пожароопасных растворителей. Кристаллический продукт получается с чистотой 92-95% что подтверждается спектральными характеристиками и высокоэффективной жидкостной хроматографией. Это позволяет использовать пурпурин-18 для медицинских целей.

Использование отходов переработки растительного сырья по предлагаемому способу позволяет не только расширить сырьевую базу для получения пурпурина-18, но и утилизировать отходы производства, накапливающиеся в больших количествах на химико-фармацевтических заводах (до 10 т смоляных отходов в год от лекарственных трав на одном заводе в Чимкенте) и выбрасываемые в отвал, которые загрязняют окружающую среду.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУРПУРИНА-18, включающий извлечение из растительного сырья производных хлорофилла, их окисление в среде спиртовой щелочи с использованием кислорода воздуха с образованием неустойчивого хлорина и последующее его превращение в пурпурин, очистку его на силикагеле и кристаллизацию, отличающийся тем, что используют отход производства при переработке растительного сырья, а именно липидный остаток, измельчение производных хлорофилла производят С₂ - С₅-спиртами, а превращение неустойчивого хлорина осуществляют обработкой его кислотой при pH не более 1,0 и перед очисткой целевой продукт обезжиривают неполярным растворителем и извлекают хлороформом.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 30.06.2003

Извещение опубликовано: 20.10.2004        БИ: 29/2004

---