Способ получения проинсулина

 

Использование: изобретение относится к генной инженерии, в частности к получению слитых белков и трансформации клеток стерптомицетов. Сущность изобретения: гены, кодирующие сигнальную последовательность и первые девять аминокислот тендамистата, экспрессируются в стрептомицетных клетках с высоким выходом и слитые белки секретируются в среду. 3 з. п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению слитых белков в клетках стрептомицетов.

Известен способ получения слитых белков путем присоединения структурного гена белка к 3'-концу кодирующей нити модифицированного тендамистат-гена, полученный ген встраивают в клетки для экспрессии выделения и секретирования слитного белка из недостаточной жидкости. При этом тендамистат-ген на 3'-конце может быть укорочен. Для укорачивания используют сайты рестрикции для ферментов BstEII в области триплета 31 и 32, StuI в области триплета 43 и 44, а также Sau 3А в области триплета 52 и 53.

Было предложено получать слитый белок, в котором на тендамистатную часть приходится укороченный проинсулин, С-цепь которого состоит только из одного или двух остатков лизина ("мини-проинсулин"). В дальнейшем было предложено укорачивать в подобных слитых белках также тендамистатную часть.

Выяснено, что слитые белки с очень короткой тендамистатной частью в стрептомицентной клетке стабильны и выделяются в среду. Полученные таким образом слитые белки ведут себя из-за очень короткой тендамистатной цепи, как "зрелые" белки.

Известна синтетическая сигнальная последовательность для транспортировки белков в системах экспрессии, эта ДНК по существу соответствует природной сигнальной последовательности, но имеет одно или несколько мест расщепления для эндонуклеаз, которые не содержатся в природной ДНК. Ген транспортируемого белка присоединяют к такой ДНК-последовательности, этот слитый ген встраивают в вектор, которым трансформируют клетку-хозяин, при этом белок транспортируется из цитоплазмы. Можно получать эукариотные, прокариотные или вирусные белки в прокариотных и эукариотных клетках. На примере периплазматического белка щелочной фосфатазы было показано, что при экспрессии с E.coli предпочтительно встраивать за форпоследовательностью кодонов, кодирующих первые 40 аминокислот щелочной фосфатазы, структурный ген желательного белка. Однако во многих случаях достаточно также меньших количеств дополнительных аминокислот, например, около 10, предпочтительнее около 5. Соответствующий слитый белок с проинсулином обезьян транспортируется примерно до 90% в периплазматическое пространство.

Известен способ получения слитых белков путем конструирования смешанного олигонуклеотида, который кодирует балластную часть слитого белка, этот олигонуклеотид вводят в вектор таким образом, чтобы он функционально был связан с областью регуляции и структурным геном желательного белка; трансформируют полученной конструкцией клетки-реципиенты и отбирают те клоны, которые обладают высоким выходом кодированного слитого белка. Олигонуклеотид при этом состоит преимущественно из 4-12, в особенности 4-8 триплетов.

Пытались получать слитые белки с короткой балластной частью. Так, например, получено слияние генов, которое кодирует слитый белок из первых 10 аминокислот β-галактозидазы и соматостатина. Однако, оказалось, что этот короткий фрагмент β-галактозидазы недостаточен, чтобы защитить слитый белок от расщепления присущими хозяину протеамин. Соответственно этому описаны слитые белки, балластная часть которых состоит из фрагмента β-галактозидазы с более чем 250 аминокислотами.

Однако слитые белки, состоящие примерно из первых 10 аминоконцевых аминокислот тендамистата и желательного белка, например, проинсулина, неожиданно оказались стабильными в стрептомицетных клетках-хозяевах и способными выделяться в среду, из которой они могут быть получены с высокими выходами. Это также оказалось характерным для небольших белков, как "мини-проинсулины".

"Примерно 10 аминокислот" при этом должно означать, что также принимают во внимание меньшее число аминокислот, например, первые 7N-концевых аминокислот тендамистата, но преимущественно не более чем 10. Слитые белки, в которых тендамистатная часть находится в положении 7 и/или 9 пролина (как в природной последовательности) предпочтительны.

Можно выбирать большую тендамистную балластную часть, причем, естественно, все более и более теряется преимущество незначительного "балласта".

Возможно и даже предпочтительно варьировать природную аминокислотную последовательность тендамистатной части, следовательно, заменять, исключать аминокислоты или включать не имеющиеся в природной аминокислотной последовательности аминокислоты. Далее можно варьировать аминокислотную последовательность в сигнальном пептиде.

В особенности благоприятные слитые конструкции могут быть легко установлены, согласно изложению сущности изобретения, благодаря простым предварительным опытам.

Далее возможно использование в качестве реципиентов других грамположительных бактериальных клеток, например, бацилл или стафилококков, при использовании сигнальных последовательностей, которые "распознаются" этими хозяевами.

Слитые белки, полученные согласно изобретению, находятся в среде в растворенной форме, что дает многие преимущества при дальнейшей обработке и очистке. Так, например, можно проводить дальнейшую ферментативную обработку при расщеплении балластной части непосредственно с помощью секреторного продукта, без стадий обработки, которые требуются в случае нерастворимых слитых белков. Перед дальнейшей обработкой также можно проводить только концентрирование или очистку, например, путем аффинной хроматографии, однако также ультрафильтрации, осаждения, ионнообменной хроматографии, абсорбционной хроматографии, гель-фильтрации или жидкостной хроматографии высокого давления.

Исходным материалом для построения плазмиды является плазмида рКК500. Эта плазмида отличается от плазмиды рКК 400, заменой гена проинсулина на аналогичный ген, который вместо С цепи кодирует только аминокислоту лизин, а также введением терминатора вслед за этим геном "мини-проинсулина". В табл. 1 и 2 воспроизведены ген "мини-проинсулина".

Плазмиды РКК400 и рКК500 содержат в сигнальной последовательности ингибирующего α-амилазу гена сайт расщепления ХmaIII в области триплета 5-7.

П р и м е р 1. Плазмиду рКК 500 обрабатывают рестрикционными ферментами EcoR1 и XmaIII и выделяют большой фрагмент на 0,8%-ном геле агарозы путем гель-электрофореза, затем отделяют электроэлюцией. Этот фрагмент лигируют с ДНК-фрагментом (1), синтезированным по фосфаорамидатному способу (SEO, IDN 0:1).

Ala y Pro Ala Ser a 5' G GCС GGG CCG GCC TCC GCC 3' CCC GGC CGG AGG CGG (XmaIII) Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC 3' CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC TTA A 5' (EcoRI) и лигированную смесь трансформируют в E.coli. Получают плазмиду рКК510. Она кодирует пред-проинсулин, в котором за сигнальной последовательностью тендамистата следует первые 7 аминокислот тендамистата и затем цепь минипроинсулина.

П р и м е р 2. Изолированную плазмиду ДНК рКК510 расщепляют с помощью рестрикционных ферментов SphI и Sst 1 и выделяют небольшой фрагмент со слитым геном. Плазмиду экспрессии рIJ702 (выпускается фирмой John Jnnes Foundation Norwich, Англия) расщепляют с помощью тех же ферментов и отделяют большой фрагмент. Оба изолированных фрагмента лигируют, лигированную смесь трансформируют в Slividans ТК24 и из тиострептонрезистентных, белых трансформаторов (т. е. неспособных к образованию меланина), выделяют плазмиду. Клоны, которые несут введенную вставку, исследуют на образование ими слитых белков в культуре, выращиваемой при постоянном встряхивании.

Трансформированный штамм инкубируют в течение 4 дней при температуре выше 25^оС в колбах, помещенных на качалку, и отделяют мицелий от культурального раствора центрифугированием. Образовавшийся слитый белок обнаруживают в надосадочной культуральной жидкости после электрофореза 20μ м культурального фильтрата в 15% -ном полиакриламидной геле благодаря окрашиванию с помощью СООМАSSIE® синего в виде дополнительной белковой полосы, которая не появляется в контрольном эксперименте, в котором штамм трансформируют только с помощью pIJ 702.

Если обрабатывают культуральный фильтрат лизи эндопротеиназой, то можно гель-электрофоретически обнаружить Des-(BЗО)-Thr-инсулин, который подтверждается благодаря аутентичному контролю.

Далее в культурном фильтрате можно обнаружить слитый белок с помощью инсулиновых антител, либо путем иммуноблотирования, либо с помощью радиоиммунного анализа инсулина.

П р и м е р 3.

Если поступают согласно примерам 1 и 2, однако используют синтетический фрагмент (2) с SEO IDN0:2, Ala y Pro Ala Ser a 5' G GCС GGG CCG GCC TCC GCC 3' CCC GGC CGG AGG CGG (XmaIII) Asp Thr Thr Val er Glu Pro Asp Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG 3' CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC CTG GGC TTA A 5' (EcoRI) то получают плазмиды рКК320 соответственно рКF2.

Эти плазмиды кодируют слитый белок, который отличается от того, который представлен в примерах 1 и 2, тем, что за первыми 7-ю аминокислотами тендамистата следуют аспарагин (вместо природной аминокислоты аланина) и затем девятая аминокислота в тендамистате пролин. Благодаря замене аланина на аспарагин вводят дополнительный положительный заряд в балластную часть слитого белка. При этом получают целевой продукт с выходом на 20-30% выше, чем в примере 2.

П р и м е р 4. Если поступают согласно примерам 1 и 2, однако используют синтетический фрагмент (3) с SEO IDN0:3: Ala y Pro Ala Ser a 5' G GCС GGG CCG GCC TCC GCC 3' CCC GGC CGG AGG CGG (XmaIII) Asp Thr Thr Val er Glu Pro Ala Pro GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GAC CCG 3' CTG TGC TGG CAG AGG CTC GGC CTG GGC TTA A 5' (EcoRI) то получают плазмиды PКК330 соответственно pKF3. Эти плазмиды отличаются от полученных согласно примерам 1 и 2 тем, что они кодируют первые 9 природных аминокислот тендамистата. По сравнению с примером 2 выход почти на 10% больше.

П р и м е р 5.

Слитый белок, кодированный рКК 500, содержит между тендамистатной частью и В-цепью проинсулина линкерную последовательность, которая кодирует аминокислоты Asn-Ser-Asn-Cly-Iys.

Осуществляют замену этого концевого Lys и образующего С-цепь Lys на Arg как описано ниже. При этом используют единичное место расщепления StyI в области кодона В30 А1 в проинсулиновой последовательности.

Выделенную ДНК-плазмиду рКК500 расщепляют с помощью Sty1, переваривают с помощью S1 нуклеазы для удаления выступающих концов и избыточную нуклеазу экстрагируют смесью фенола с хлороформом.

Ставшую линейной плазмиду затем дополнительно расщепляют с помощью Е.соRI, электрофоретически отделяют большой фрагмент и выделяют путем электроэлюции. Этот фрагмент лигируют с синтетическим фрагментом (4) (SEO IDN0:4): Asn Ser Asn Gly Arg e Val Asn Gln s Leu Cys Gly Ser His AAT TCG AAC GGC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC
GC TTG CCG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG (EcoRI) Leu Val Glu Ala u Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe e CTC GTG GAG GCC CTC TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGC GGC TTC TTC GAG CAC CTC CGG GAG ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCG CCG AAG AAG Tyr Thr Pro Lys TAC ACC CCC AAG ACC CGC ATG TGG GGG TTC TGG GCG и смесь после легирования трансформируют в E.coli. Трансформированные колонны проверяют путем рестрикционного анализа плазмид.

Далее секвенируют весь SphI-SstI фрагмент.

Для экспрессии кодированного слитого белка, фрагмент, исследованный путем расшифровки последовательности лигируют в вектор PIJ 702, расщепленный с помощью тех же ферментов, причем образуется вектор экспрессии PGF4.

Обнаружение кодированного PGF4 и секретированного слитого белка, с одной стороны, можно осуществлять через тест на пластинках сd-амилаза-ингибитором (европейский патент А 0161629), пример 3, и, с другой стороны из надосадочной жидкости, выращиваемой при постоянном встряхивании культуры, аналогично примеру 2.

П р и м е р 6. Если вводят аналогичную примеру 5, фрагмент 4 в векторы рКК510, 520 и 530, то получают векторы рКК610, 620 и 630. Встраивание, соответствующих SphI-SstI-фрагментов с помощью кодирующей последовательности для слитых белков в вектор pIJ702 дает векторы экспрессии pKF11, 12 и 13. Экспрессия секретированных слитых белков проверяется согласно примеру 2.

П р и м е р 7. Для повышения экспрессии производных плазмиды pIJ702 из нее удаляют меланиновый промотор путем переваривания с помощью PstI и SphI и заменяют синтетическим фрагментом (5) (SEO IDNO:5):
ACACCCGAAGGAGGCCCGC
TGCGTGGGCTTCTCCTCCGGGGTCGTACG
Благодаря этому получают тандем-конструкцию из синтетического и тендамистатного промоторов. Плазмида получила название pGR 110.

Если в PGR 110 после расщепления с помощью Sph и SstI вводят синтетические фрагменты (1), (2) и (3), то получают в результате векторы экспрессии pGR 200, 210 и 220. Аналогичным образом получают с помощью фрагмента (4) векторы экспрессии pGR 250, 260 и 270.

П р и м е р 8. Из предшественников инсулина нужно получить человеческий инсулин путем обработки трипсином или ферментом типа карбоксипепсидазы В. Следовательно, необходимо в ходе реакции расщепления отделять балластную часть с аминоконцами, чтобы способствовать получению В31 (Arg)-инсулина. Для этого предлагается модификация аминокислот перед аминокислотой В1 (Phe).

Поступают согласно примеру 1 и обрабатывают плазмиду pKK500 с помощью рестрикционных ферментов EcoRI и DraIII. Первоначальный фрагмент затем заменяют на синтезированный с помощью фосфорамидитного способа ДНК-фрагмент (6) (SEOIDNO:6):
Asn Ser Ala Arg e Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu 5' AAT TCG GCC CGC TTC GTC AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCG CAC CTC 3' 3' GC CGG GCG AAG CAG TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGC GTG
5'
(EcoRI) (DraIII) Клонирование в E.coli и экспрессию в Streptomyces lividans осуществляют согласно примеру 1, соответственно, примеру 2. Получают плазмиду pKK640 или плазмиду экспрессии pKF14.

Так же можно поступать с плазмидой, которую получают согласно примеру 5 (после встроения фрагмента (4).

Таким образом получают плазмиды рКК 650 соответственно pKF15.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИНСУЛИНА, включающий связывание нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнальную последовательность тендамистата, и нуклеотидной последовательности, кодирующей тендамистат, со структурным геном проинсулина, введение полученной последовательности в стрептомицетный вектор, трансформацию полученной последовательностью клеток стрептомицетов, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая тендамистат, имеет длину, соответствующую первым 7 - 10 аминокислотам тендамистата.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая тендамистат, имеет длину, соответствующим первым 7 аминокислотам тендамистата.

3. Способ. по п. 1, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая тендамистат, имеет длину, соответствующую первым 9 аминокислотам тендамистата.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая тендамистат, имеет длину, соответствующую первым 9 аминокислотам тендамистата, при этом восьмая аминокислота является аспарагином, а девятая аминокислота - пролином.