Композиция для иммунизации растений и способ ее получения

 

Использование: изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к защите растений от болезней путем обработки их продуктами жизнедеятельности микроорганизмов. Сущность изобретения: предложена композиция для иммунизации растений, содержащая смесь жирных кислот либо метиловых или этиловых эфиров этих кислот при следующем соотношении компонентов, мас.%: миристиновая 0,1 - 1,6; пентадекановая 0,1 - 0,5; пальмитиновая 10 - 25; стеариновая 5 - 15; олеиновая 20 - 30; миолевая 5 - 10; гамма-линоленовая 5 - 10; эйкозамоноеновая 0,1 - 1,6; эйкозатриеновая 1 - 5; арахидоновая 10 - 45. Способ получения композиции заключается в культивировании грибов рода Mortierella и выделении целевого продукта путем обработки мицелия смесью или эталона и ацетилхлорида или соляной кислоты и последующей экстракции гексаном. Композиция характеризуется высокой эффективностью, не содержит гликопротеиновых аллергенных компонентов, стабильна, не фитотоксична, не оказывает отрицательного влияния на рост и развитие растений, повышает урожай. Способ получения композиции пригоден для крупномаштабного производства. 2 с. п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к защите растений от болезней путем обработки их продуктами жизнедеятельности микроорганизмов.

Известны композиции, получаемые из дрожжей, содержащие липиды, их фракции и жирные кислоты с длиной цепи от 18 до 34 атомов углерода для защиты картофеля, томатов и других культур от вирусных инфекций.

Известны композиции, получаемые из мицелия фитопатогенных грибов Phytophthora infestans, защищающие растения от фитопатогенных грибов и бактерий. К этой группе относятся глюкансодержащие препараты клеточных стенок, вызывающие образование антибиотических веществ фитоалексинов в клубнях картофеля, тканях томатов, корнях сои, или липидные фракции, индуцирующие образование фитоалексинов в тканях картофеля.

Недостаток перечисленных композиций заключается в том, что индуцирование синтеза большого количества фитоалексинов отрицательно сказывается на качестве продукции растениеводства и делает ее непригодной для употребления в пищу. По этой причине препараты индукторы синтеза фитоалексинов не нашли применения в сельском хозяйстве.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по назначению и совокупности существенных признаков является композиция, выделяемая из грибов-микромицетов Phytophthora infestans, представляющая собой липогликопротеиновый комплекс (ЛГП-комплекс), состоящий из липидов (58%), углеводов (35%) и белка (6% ), и индуцирующая устойчивость картофеля к паразитарным грибам. Липидный компонент комплекса состоит из глицеролов, стеролов, свободных жирных кислот и фосфолипидов. Жирнокислотный состав комплекса приведен в табл. 1.

ЛГП-комплекс обладает иммуноиндуцирующей способностью, обусловленной присутствующими в нем липидами, и при использовании его в низких концентрациях (5-10 мкг/мл) вызывает сенсибилизацию растений, т.е. делает их способными синтезировать фитоалексины только в ответ на контакт фитопатогена с тканями растения. Так, при применении его в концентрации 0,0005% развитие фитофтороза наблюдается только у 53,6% а ризоктониоза у 72% растений относительно контроля, где препарат не использовался [1] Недостатком данной композиции является наличие в нем не только активной липидной части, но и белкового и углеводного компонентов, которые, как известно, особенно в сочетании друг с другом, обладают мощным аллергенным эффектом, от которого желательно избавляться, а также недостаточно высокая биологическая активность комплекса.

Известен способ получения композиции для иммунизации растений, а именно вышеописанного ЛГП-комплекса, предусматривающий культивирование гриба-микромицета Phytophthora infestans в течение двух недель на жидкой картофельной среде в стационарных условиях (без перемешивания), отделение выросшего мицелия фильтрацией, двухкратное экстрагирование мицелия 70%-ным этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 20 мин, центрифугирование полученных спиртовых экстрактов при 1000 g, отделение супернатанта, удаление из него спирта в вакуумном испарителе, диализ оставшегося водного экстракта в течение суток против проточной воды и затем в течение суток против дистиллированной воды, разделение водного экстракта на колонках с сефадексом G-50 и получение конечного продукта (ЛГП-комплекса), состоящего из липидов (58%), углеводов (35%) и белка (6%). Выход продукта от веса сухого мицелия составляет 0,97% [2] Существенным недостатком данного способа является необходимость использования метода культивирования продуцента в стационарных условиях, в матрацах, без перемешивания, что не позволяет организовать промышленное производство продукта.

Другим недостатком способа является низкий выход продукта.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является создание высокоэффективной композиции для иммунизации растений против фитопатогенных микроорганизмов и способа ее получения.

Сущность изобретения заключается в том, что предлагается композиция для иммунизации растений, включающая липиды, где в качестве липидов она содержит смесь метиловых или этиловых эфиров жирных кислот, таких как миристиновой в количестве 0,1-1,6, пентадекановой 0,1-0,5, пальмитиновой 10,0-25,0, стеариновой 5,0-15,0, олеиновой 20,0-30,0, линолевой 5,0-10,0, гамма-линоленовой 5,0-10,0, эйкозамоноеновой 0,1-1,6, эйкозатриеновой 1,0-5,0 и арахидоновой 10,0-45,0 от суммы эфиров в пересчете на содержание жирных кислот.

Композиция не содержит аллергенных гликопротеиновых компонентов и обладает повышенной биологической активностью.

При применении композиции в концентрации 0,00003% развитие фитофтороза наблюдается только у 29% ризоктониоза у 25,9% а в концентрации 0,00006% развитие фитофтороза наблюдается только у 18% растений относительно контроля, где препарат не использовался.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что согласно способу получения композиции для иммунизации растений, предусматривающему культивирование микромицета на питательной среде, отделение мицелия микромицета и выделение из него целевого продукта, из микромицетов используют штамм микромицета Mortierella hygrophila BKM F-1854, а из мицелия выделяют смесь метиловых или этиловых эфиров жирных кислот, таких как миристиновой, пентадекановой, пальмитиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой, гамма-линоленовой, эйкозамоноеновой, эйкозатриеновой и арахидоновой.

Выход целевого продукта составляет 11,3% от веса сухого мицелия, что значительно превышает выход продукта, получаемого по способу-прототипу.

Штамм Mortierella hygrophila BKM F-1854 находится во Всероссийской (ранее Всесоюзной) коллекции микроорганизмов и был опубликован в Каталоге культур Всесоюзной коллекции микроорганизмов, М. Наука, 1976, с. 125.

Композиция может быть выделена любым известным способом, предусматривающим перевод жирных кислот в эфиры, в том числе путем обработки мицелия перед экстракцией гексаном смесью метанола или этанола и ацетилхлорида или соляной кислоты, что позволяет получить целевой продукт, не содержащий аллергенных гликопротеиновых компонентов.

Предлагаемый способ получения композиции пригоден для крупномасштабного производства, т.к. грибы рода Mortierella культивируют глубинным способом в ферментере при перемешивании среды.

Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается примерами.

П р и м е р 1. Штамм микромицетов Mortierella hygrophila BKM-F-1854 выращивают в ферментере объемом 100 л, с рабочим объемом 60 л на глюкопептонной среде следующего состава, г/л: глюкоза 60; пептон 30; дрожжевой экстракт 7; калий фосфорнокислый однозамещенный 2,04; вода водопроводная.

Условия ферментации: рН 5,8; концентрацию растворенного в среде кислорода поддерживают системой автоматического оксистатирования на уровне 20-70% от насыщения воздухом; скорость перемешивания 200-450 об/мин. Температурный режим изменяют в процессе ферментации по специальной программе.

Продолжительность ферментации 162 ч. Количество полученной биомассы составляет 30,4 г/л в расчете на сухую массу.

Мицелий гриба отделяют фильтрованием и лиофилизируют.

Для выделения композиции к высушенному мицелию гриба (25 г) добавляют последовательно ацетилхлорид (75 мл) и метанол (250 мл) и кипятят до удаления растворителей (15). Смесь, содержащую метиловые эфиры жирных кислот, экстрагируют гексаном. Гексан выпаривают на вакуумном испарителе и получают концентрат композиции.

Выход концентрата составляет 11,3% от сухого мицелия или 3,4 г в расчете на 1 л культуральной суспензии.

Состав полученного концентрата композиции, содержащей метиловые эфиры жирных кислот, в от суммы эфиров в пересчете на содержание жирных кислот приводится в табл. 2.

Композиция также содержит минорные (менее 0,1%) липидные компоненты неустановленной природы, которые препятствуют окислению полиненасыщенных жирных кислот.

К концентрату добавляют изопропиловый спирт в качестве растворителя, получая раствор композиции.

П р и м е р 2. Культуру штамма Mortierella hygrophila BKM-F-1854 выращивают в ферментере объемом 100 л с рабочим объемом 60 л на среде, содержащей в качестве углеродного субстрата гидролизат картофеля. Состав среды, г/л: кислотный гидролизат картофеля с суммарным содержанием редуцирующих веществ 40; калий фосфорнокислый однозамещенный 2,04; пептон 5; дрожжевой экстракт 5; магний сернокислый 0,1; кальций хлористый 0,14; железо сернокислое 0,035; цинк сернокислый 0,0154; медь сернокислая 0,0055; марганец сернокислый 0,0075; кобальт хлористый 0,0005; вода водопроводная.

Условия ферментации: рН 5,8; рО50% от насыщения воздухом; скорость перемешивания 200-450 об/мин. Температурный режим изменяют в процессе ферментации по специальной программе.

Продолжительность ферментации 106 ч.

Количество полученной биомассы 29,4 г/л по сухому весу.

Условия выделения композиции те же, что в примере 1.

Выход концентрата композиции составляет 12% от сухого мицелия или 3,5 г в расчете на 1 л культуральной суспензии.

Состав полученного концентрата композиции, содержащей метиловые эфиры жирных кислот, в от суммы эфиров в пересчете на содержание жирных кислот приводится в табл. 3.

Композиция также содержит минорные (менее 0,1%) липидные компоненты неустановленной природы, которые препятствуют окислению полиненасыщенных жирных кислот.

Концентрат композиции используют для получения раствора композиции в изопропаноле, как указано в примере 1.

П р и м е р 3. Культуру штамма Mortierella hygrophila BKM-F-1854 выращивают в ферментере объемом 100 л с рабочим объемом 60 л. Состав среды и условия ферментации такие же, как в примере 1.

Для выделения композиции к высушенному мицелию гриба (25 г) добавляют последовательно ацетилхлорид (75 мл) и этанол (250 мл) и кипятят до удаления растворителей. Смесь, содержащую этиловые эфиры жирных кислот, экстрагируют гексаном. Гексан выпаривают на вакуумном испарителе и получают концентрат композиции.

Выход концентрата составляет 11,8% от сухого мицелия или 3,6 г в расчете на 1 л культуральной суспензии. Состав композиции, содержащей этиловые эфиры жирных кислот (в пересчете на жирные кислоты), такой же, как в табл. 2.

П р и м е р 4. Культуру штамма Mortierella hygrophila BKM-F-1854 выращивают в ферментере объемом 100 л с рабочим объемом 60 л. Состав среды и условия ферментации такие же, как в примере 2.

Условия выделения композиции те же, что в примере 3.

Выход концентрата композиции составляет 12,3% от сухого мицелия или 3,6 г в расчете на 1 л культуральной суспензии. Состав композиции, содержащей этиловые эфиры жирных кислот (в пересчете на жирные кислоты), такой же, как в табл. 3.

Определение биологической активности композиции.

Испытание биологической активности композиции, полученной по примерам 1-4, проводилось в Всероссийском научно-исследовательском институте химических средств защиты растений, в вегетационных опытах, по общепринятой методике. При проведении испытаний раствор композиции в изопропаноле разводили водой в 50 и в 100 раз, получая рабочие растворы композиции. Концентрация композиции в рабочем растворе составляла соответственно 0,00003 и 0,00006% Данные, характеризующие биологическую активность против возбудителей фитофтороза и резиктониоза ЛГП-комплекса и предлагаемой композиции (по данным Всероссийского научно-исследовательского института химических средств защиты растений, 1992) представлены в табл. 4.

Как видно из таблицы, предлагаемая композиция обладает в два раза более высокой биологической активностью, чем ЛГП-комплекс.

Полевые испытания композиции.

В сезон лета 1992 г. в сельхозпредприятии Балково Серпуховского района Московской области был проведен хозяйственный опыт по обработке 20 га посевов картофеля предлагаемой композицией. Данные этого опыта показали прибавку урожая картофеля на 21% по сравнению с необработанным композицией полем. Было установлено, что предлагаемая композиция оказывает положительное биологическое действие на ботву картофеля в период вегетации от различных грибковых заболеваний, сохраняется зеленый массив ботвы в течение длительного времени, клубни картофеля, полученные с поля, обработанного композицией, имели выраженную гладкую и чистую кожуру.

Определение фитотоксичности композиции.

Исследования влияния предлагаемой композиции на рост и развитие сельскохозяйственных культур на моделях томатов и картофеля, проведенные во ВНИИ химических средств защиты растений (1992 г.), показали, что композиция является нефитотоксичной и не оказывает отрицательного влияния на рост и развитие растений.

Таким образом, предлагаемая композиция характеризуется высокой эффективностью, не содержит гликопротеиновых аллергенных компонентов, нефитотоксична, не оказывает отрицательного влияния на рост и развитие растений, повышает урожай. Композиция стабильна из-за присутствия минорных стабилизирующих липидных компонентов, ее состав не изменяется при хранении при комнатной температуре в течение нескольких месяцев, тогда как индивидуальные полиненасыщенные жирные кислоты, например арахидоновая кислота, подвержены окислению на 5-10% за 3 дня хранения при температуре 37^оС (по данным каталога фирмы "Serva", 1991).

Предложенный способ получения композиции с использованием в качестве продуцента штамма микромицетов рода Mortierella позволяет получить композицию с высокой биологической активностью, обеспечивает высокий выход продукта и пригоден для крупномасштабного производства.

Формула изобретения

1. Композиция для иммунизации растений, включающая липиды, отличающаяся тем, что в качестве липидов она содержит смесь метиловых или этиловых эфиров жирных кислот, таких как миристиновой в количестве 0,1 1,6, пентадекановой 0,1 0,5, пальмитиновой 10,0 25,0, стеариновой 5,0 15,0, олеиновой 20,0 - 30,0, линолевой 5,0 10,0, гамма-линоленовой 5,0 10,0, эйкозамоноеновой 0,1 1,6, эйкозатриеновой 1,0 5,0 и арахидоновой 10,0 45,0% от суммы эфиров в пересчете на содержание жирных кислот.

2. Способ получения композиции для иммунизации растений, предусматривающий культивирование микромицета на питательной среде, отделение мицелия и выделение из него целевого продукта, отличающийся тем, что из микромицетов используют штамм микромицета Mortierella hugrophila ВКМ F-1854, а из мицелия выделяют смесь метиловых или этиловых эфиров жирных кислот, таких как миристиновая, пентадекановая, пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, гамма-линоленовая, эйкозамоноеновая, эйкозатриеновая и арахидоновая.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2