Биологически активный препарат для свиней, способ его получения и способ профилактики и лечения вирусных заболеваний свиней

 

Использование: в ветеринарии, в частности в биологически активных препаратах для профилактики и лечения вирусных заболеваний у свиней. Сущность: препарат содержит, мас. %: белки 11,6 - 67,5; аминокислоты 1,9 - 5; жирные кислоты 19,9 - 50; сахара 4,9 - 35; аскорбиновая кислота 0,9 - 10; вода 1 - 5 и соли минеральных кислот - остальное. Препарат получают культивированием вырус- и/или невирус -индуцированных лимфоидных клеток свиней с последущей фильтрацией. Далее одну часть фильтрата лиофилизируют, растворяют в буферном растворе и вносят (1:10) в раствор аэрозоля ОТ, добавляют жирные кислоты (10 - 1000 мкг), сахара (5 - 20 мг) и смешивают с 1 - 5-кратным раствором ацетона. Полученный осадок растворяют в физиологическом растворе, смешивают со второй частью фильтрата и леофилизируют. Препарат с активностью 10 тыс. единиц для профилактики болезней вводят 2 - 3-кратно парентерально в дозе 0,5 - 2 мл, а для лечения с активностью 1 млн. ед. вводят 3 - 4-кратно в дозе 1 - 2 мл. 3 с. и 2 з. п. ф-лы.

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к биологически активным препаратам, обладающим противовирусной активностью, способам их получения и применения, предназначенным для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней, повышения продуктивности свиней.

Известны биопрепараты, способы их получения и применения, обладающие противовирусной активностью и обеспечивающие повышение сохранности и продуктивности свиней. Это вакцины, гипериммунные сыворотки, препараты иммуноглобулинов, интерферонов (Иммунопрофилактика болезней животных. Пер. с нем. Под ред. Х.Г.Гиззатуллина и Н.З.Хазипова. М. "Колос", 1981).

В качестве аналогов наиболее предпочтительными по сути предлагаемого изобретения являются препараты интерферона, способы его получения и применения (В. Соловьев, Т.Бактемиров. "Интерфероны в теории и практике медицины". 2-е изд. М. "Медицина", 1981; Д.Лазарева, Е.Алехин. "Стимуляторы иммунитета". М. "Медицина", 1985).

Прототипом изобретения является препарат "Интерферон спленоцитарный свиней" (спленоферон) (ТУ 10.07.118-89), утвержденный Главным управлением ветеринарии Госагропромa СССР от 28 июня 1989 г.

Недостатком этого препарата, способа его получения и применения является низкая его активность (титр 1:256-1:512), что требует существенного повышения производства при широком применении в свиноводстве. Технологию получения этого препарата, как и другие известные способы получения препаратов интерферонов (лейкоцитарных) не позволяет получить препараты с активностью 1: 10³.

Целью предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, т.е. обеспечение повышения противовирусной активности препарата и увеличение эффективности его производства и применения.

Поставленная цель достигается определением эффективной композиции препарата, высокоэкономичной и производительной технологией изготовления и оптимальной схемой применения.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем. Биологически активный препарат для свиней состоит из продуктов культивирования индуцированных лимфоидных клеток свиней и наполнителей при следующем соотношении компонентов (в сухом препарате, мас.): белки 11,6 67,5% аминокислоты 1,9 5,0% жирные кислоты 0,11 17,5% сахара 4,9 35% аскорбиновая кислота 0,9 10% воды 1 5% соли до 100% Противовирусная активность препарата (титр) составляет 1: 500-1:10⁹.

Препарат получают при культивировании в течение 14-80 ч лимфоидных клеток свиней в присутствии вирусных (ВБН, ВС) и невирусных (лектины, энтеротоксины и др. ) индукторов с последующим концентрированием белков и внесением жирных кислот и сахаров и объединением фракций неконцентрированных и концентрированных продуктов в соотношении 1:1-10000:1 с добавлением наполнителей. Получаемый таким образом препарат с охарактеризованными свойствами (по противовирусной активности) эффективен по применению в лечебных и профилактических дозах (соответственно 10⁶ и 10⁴ ед.) при парентеральном, интраназальном или пероральном введении свиньям.

П р и м е р 1 (оптимальный вариант).

Биологически активный препарат получают следующим образом.

1 стадия. Культивируют лимфоидные клетки свиней (20-80 млн. клеток/см³) при добавлении последовательно лейкоцитарного интерферона свиней (100-300 ед/см³), инсулина (0,0020 ед/см³), невирусных индукторов (например, конканавалин А (Кон А 0,5-1 мг/л); фитогемагглютинин (ФГА 20-30 мг/л); энтеротоксины (липополисахариды) 0,05-0,1 мг/л; левамизол, другие производные тиазола 0,1 мг/см³ или другие) и/или вирусных индукторов (вирус болезни Ньюкастла (ВБН 10-40 ТЦД₅₀/см³ на клетку; вирус Сендай 10-30 ТЦД₅₀/см³ на клетку). Продукты культивирования индуцированных клеток (режим биосинтеза 14-80 ч при 36,5-37,5^оС, концентрация клеток 4-10 млн. клеток/см³ в перемешивающейся суспензии, питательные среды типа 199, РПМИ-1640) центрифугируют. В случае применения вирусных индукторов центрифугат подкисляют до рН 2,5 и выдерживают не менее 72 ч, затем рН выравнивают до 6,0-6,5 добавлением растворов КОН или NaOH. Далее фильтруют через стерилизующие фильтры и часть фильтрата (1-3%) лиофилизуют.

2 стадия. Лиофилизованный полупродукт растворяют в 0,05 М буферном растворе (10 мг/см³) и вносят в соотношении 1:10 в раствор поверхностно-активных веществ, например 0,2-0,4 М раствор аэрозоля ОТ (натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты), а затем добавляют раствор жирной кислоты (например, пальмитиновая, стеариновая) (10-1000 мг) и насыщенный раствор сахаров (например, глюкоза, сорбит и др.) в количестве 5-20 мг. Далее к системе добавляют избыточное количество (2-5 кратное) ацетона и выпавший осадок промывают 3-5 раз ацетоном. Последний удаляют испарением.

3 стадия. Объединяют часть препарата, полученного на 1 стадии и растворенную в физиологическом растворе (буфер) часть препарата, полученную на 2 стадии в соотношении 2:1-1:1 (соотношение белковой фракции в частях 1:1-10000: 1), добавляют желатину или белки плазмы крови до конечной ее концентрации 0,1-1% аскорбиновую кислоту (до конечной концентрации 0,03-0,3% и используют либо в жидком виде, либо в лиофилизованном виде.

Состав композиции следующий: белки 11,6-67,5% аминокислоты 1,9-5,0% жирные кислоты 0,11-17,5% сахара 4,9-35,0% аскорбиновая кислота 0,9-10% вода 1-5% соли до 100% Противовирусная активность (титр) 1:500-1:1000000000
(500-1 млрд.ед.).

П р и м е р 2 (отрицательный вариант, пример 2 по таблице).

Препарат получают так как описано в примере 1, но используют только процедуры, изложенные в 1 стадии.

Противовирусная активность препарата в этом случае не превышает (титр) 1:500-1:1000 (500-1000 ед.). В составе препарата нет жирных кислот, сахаров, аскорбиновой кислоты.

П р и м е р 3 (недостаточно эффективный вариант, пример 3 по табл.).

Препарат получают так как описано в примере 1, но используют только процедуры, изложенные в стадии 1 и 2 (без третьей стадии).

Противовирусная активность препарата составляет 10⁵-10⁶ ед./мг. В составе препарата отсутствует 50-70% белка, 100% аскорбиновой кислоты. Получаемый препарат в 10-100 раз менее активен, чем при изготовлении по технологии, изложенной в примере 1. Еще один недостаток препарат можно расфасовывать только в сухом виде, что технологически крайне сложно.

П р и м е р 4 (см. таблицу).

П р и м е р 5. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание белка менее 11,6% В этом случае не достигается необходимой активности препарата (10⁴-10⁷ ед.), из-за потери противовирусной активности в процессе приготовления препарата потеря активности в 100-10000 раз. При повышении концентрации белка свыше 67,5% в препарате технологический процесс получения препарата является экономически нецелесообразным в этом случае время лиофилизации превышает 72 часа, что приводит к большим энергетическим затратам.

П р и м е р 6. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание жирных кислот менее 0,11% В этом случае не достигается получения активности препарата выше 1000 ед. что не обеспечивает необходимой активности препарата (10⁴-10⁸ ед.). При повышении концентрации жирных кислот выше 17,5% в препарате наблюдается снижение активности препарата в 100 раз и более.

П р и м е р 7. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание сахаров (например, глюкоза, манноза, сорбит и др.) менее 4,9% При этом получаемый на 2 стадии полупродукт является малорастворимым, что не обеспечивает получение препарата с активностью выше 1000 ед. При повышении концентрации сахаров свыше 35% наблюдается снижение активности препарата в 10 раз и более (очевидно за счет блокирования мембрано-активных центров противовирусных компонентов препарата).

П р и м е р 8. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание аскорбиновой кислоты менее 0,9% В этом случае при хранении продукта свыше 1 месяца наблюдается постепенное снижение активности препарата в 10 раз и более. При повышении концентрации аскорбиновой кислоты свыше 10% наблюдается снижение активности препарата в 15-20 раз и более.

П р и м е р 9. Препарат под названием поркавирэкс с активностью (противовирусной, титр) 1000-100000 ед. применяют для повышения иммунобиологической реактивности организма, увеличения скорости роста и развития, профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней свиней путем интраназального, парентерального (например, внутримышечного) введения в дозе 0,5-1 мл 2 раза в сутки в течение 2-3 дней или двукратно через 48 ч или внутримышечно в дозе 1 мл через 48 ч после вакцинаций.

При снижении активности препарата менее 1000 ед. применение его по указанной схеме является менее эффективным. В этом случае сохранность новорожденных поросят повышается не более, чем на 2% а прирост массы тела поросят не повышается более чем на 3% (экономическая целесообразность).

При повышении активности препарата (поркавирэкса) свыше 105 ед. применение его с профилактической целью является экономически не целесообразным (из-за повышенного расхода препарата).

П р и м е р 10. Препарат под названием поркавирэкс-вак с активностью (противовирусной, титр) 10⁵-10⁸ ед. применяют для лечения инфекционных болезней органов дыхания, желудочно-кишечного тракта, болезни Ауески в комплексе с антибиотиками, витаминами, другими препаратами путем внутримышечного введения 2 раза в сутки по 1 мл в течение 3-4 дней.

При снижении активности препарата менее 100000 ед. применение его по указанной схеме является менее эффективным. В этом случае не обеспечивается 75% -ная сохранность свиней, интрацеребрально заряженных вирулентным штаммом "Арский" вируса болезни Ауески, при внутримышечном введении 2 раза в сутки по 1 мл в течение 3 дней поркавирэкса-вак (с активностью менее 100000 ед.). Тогда как применение по этой схеме поркавирэкс-вака с активностью 100000-10000000 ед. обеспечивает 75%-ную защиту свиней при их интрацеребральном или интраназальном заражении вирулентным штаммом вируса болезни Ауески.

Применение препарата с активностью свыше 10⁸ ЕД для лечебных целей является экономически нецелесообразным (из-за повышенного расхода препарата).

Формула изобретения

1. Биологически активный препарат для свиней, включающий видоспецифический белок, отличающийся тем, что в качестве видоспецифического белка он содержит продукты культивирования индуцированных лимфоидных клеток свиней белки, аминокислоты, соли минеральных кислот и дополнительно жирные кислоты, сахара, аскорбиновую кислоту, воду при следующем соотношении компонентов, мас.

Белки 11,6 67,5
Аминокислоты 1,9 5,0
Жирные кислоты 19,9 50,0
Сахара 4,9 35,0
Аскорбиновая кислота 0,9 10,0
Вода 1,0 5,0
Соли минеральных кислот Остальное
2. Способ получения биологически активного препарата для свиней из сырья животного происхождения, включающий инкубирование его в питательной среде с индуктором с последующим выделением, отличающийся тем, что в качестве сырья животного происхождения используют лимфоидные клетки свиней, которые культивируют в присутствии индукторов как вирусных, так и невирусных в течение 14 80 ч, полученную суспензию центрифугируют, фильтруют через стерилизующие фильтры, фильтрат разделяют на две части: одну часть в количестве 1 10% лиофилизуют, растворяют в боратном буферном растворе из расчета 10 мг/см³ и вносят в соотношении 1 10 в 0,2 0,4 М раствор аэрозоля натриевой соли ди-2-этилгексилового эфира, сульфоянтарной кислоты, добавляют 10 1000 мкм жирной кислоты, 5 20 мг сахара и осаждают 2 5-кратным количеством ацетона, полученный осадок, растворенный в физиологическом растворе, смешивают с другой частью фильтрата в соотношении 1 1 2, добавляют белки плазмы крови и/или желатину до конечной концентрации 0,1 - 1,0% аскорбиновую кислоту до конечной концентрации 0,03 0,3% и лимфилизуют.

3. Способ профилактики и лечения вирусных заболеваний свиней, включающий введение в организм биологически активного вещества, отличающийся тем, что в качестве биологически активного вещества используют препарат, включающий продукты культивирования индуцированных лимфоидных клеток свиней белки, аминокислоты, соли минеральных кислот, жирной кислоты, сахара, аскорбиновую кислоту, воду при следующем соотношении компонентов, мас.

Белки 11,6 67,5
Аминокислоты 1,9 5,0
Жирные кислоты 19,9 50,0
Сахара 4,9 35,0
Аскорбиновая кислота 0,9 10,0
Вода 1 5
Соли минеральных кислот Остальное
причем препарат с активностью 10³ 10⁸ вводят животным в дозе 0,5 1,0 мл два раза в сутки.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что при профилактике вирусных заболеваний свиней используют препарат с активностью 10³ 10⁵, а вводят его интраназально, перорально и парентерально в течение 2 3 дней или двукратно через 48 ч или внутримышечно в дозе 1 мл через 48 ч после вакцинации.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что при лечении вирусных заболеваний свиней используют препарат с активностью 10⁵ 10⁸, а вводят его внутримышечно в течение 3 4 дней.

РИСУНКИ

Рисунок 1