Способ разделения, элиминации и контроля популяций микрообъектов и установка для его осуществления

 

Использование: биотехнология и медицина, разделение, элиминация и контроль популяций микрообъектов. Сущность изобретения: способ предусматривает воздействие на гетерогенную смесь культур микрообъектов, размещенную в кювете, выполненной в виде плоского прозрачного каппилляра лазерного излучения мощностью, достаточной для разрушения клеточной мембраны маркированной клетки. Воздействие излучением проводится на маркированную флуоресцентной меткой клетку благодаря обратной оптической связи в ответ на люминестенцию этой же клетки. В установке для осуществления способа имеются блоки - оптической, регистрирующий и лазерный. Замкнутый объем для размещения микрообъектов представляет собой плоский капилляр с прозрачными стенками, а система для воздействия на монокультуру состоит из ультрафиолетового облучателя, размещенного с одной стороны капилляра. 2 с. и. 2 з. п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к биологии и медицине; оно может быть использовано для сортировки клеток, элюминации популяции культуры из смеси и контроля за состоянием популяций, в том числе за качеством элюминации.

Известны способы и установки для разделения клеток, однако, существенным недостатком известных способов и устройств является их низкая производительность и отсутствие адекватного контроля за результатом в цикле самой сортировки или элюминации.

Целью изобретения является повышение производительности разделения или элюминации и осуществление контроля в цикле самой операции.

Способ осуществляют следующим образом. Для анализа гетерогенности клеток по фенотипу готовятся моноклональные антитела, коньюгированные с флуорохромом. Для этой цели обычно используют указанные антитела к специфическим балкам, гликопротеидам или гликолипидам клеточной поверхности. В качестве флуорохрома можно использовать флуоресцеин изотиоцианат, образующий с белками прочную ковалентную связь, родамин изоцианат, фиксэритрин и др. Суспензию активированных антител и гетерогенной популяции, подлежащей разделению или элиминации меченой указанной культурой популяции вводят в плоскую кювету, обеспечивающую монослойное размещение клеток, после чего облучают с одной стороны указанный слой коротковолновым (УФ или фиолетовый спектр) светом и со стороны, обратной этой подсветки электрооптическими средствами фиксируют координаты свечения возбужденных клеток, после чего по указанным координатам воздействуют сфокусированным лазерным излучением с мощностью достаточной для разрушения клеточной мембраны маркированных клеток. После лазерного облучения кювета не очищается, культура в ней выдерживается в течение времени, необходимого для релаксации продуктов распада маркированных в убитых клеток. Затем проводится с помощью системы оптического отображения контроля за оставшимися неубитыми маркированными клетками, для чего одновременно производится подсветка УФ светом и при необходимости производится снова лазерное облучение с целью полного уничтожения выбранной культуры. После этих операций проводится смывка обработанной культуры, промывка кюветы и ее новое наполнение для повторения описанных операций по обработке гетерогенной культуры.

Изобретение иллюстрируется фиг. 1, 2, 3.

На фиг. 1 показана структурная схема установки для разделения (элиминация) и контроля популяций микрообъектов, реализующая описанный способ.

Цифрами на фиг. 1 обозначены: 1 видикон, 2 система адресной регистрации и управления сканатором, 3 силовое зеркало, 4 сканатор, 5 лазер, 6 приемник культуры, 7 оптическая система промежуточной регистрации изобретения люминесцирующих клеток, 8 отсекающий светофильтр, 9 резервуар гетерогенной культуры, 10 сборник очищенной культуры, 11 монослой культуры, 12 кювета, 13 УФ фильтр, 14 расширитель, 15 зеркало, 16 резервуар смывки, 17 УФ источник.

На фиг. 2 показана модификация конструкции оптической системы промежуточной регистрации изображения люминесцирующих клеток трапопаратной оптической системы. Цифрами обозначены: 11 монослой культуры, 12 кювета, 18 поляризатор, 19 объектив, 20 управляемый транспарант.

На фиг. 3 показана другая модификация реализации оптической системы промежуточной регистрации изображения люминесцирующих клеток-световолоконной оптической системы. Цифрами обозначены: 11 монослой культуры, 12 кювета, 8 отсекающий светофильтр, 21 волоконная шайба.

Устройство для разделения (элиминации) и контроля популяций микрообъектов, выполненное по первой модификации работает следующим образом. Из резервуара гетерогенной культуры 9, где находятся маркированные клетки в смеси с другими (по фенотипу) культура вводится в объем плоского капилляра, образованный в кювете 12, где равномерно освещается УФ светом с длиной волны в максимуме 490 нм с помощью оптической системы 14,15,17. Люминесцирующие клетки отображают свое свечение на управляемом транспаранте 20, для чего используется оптическая система, состоящая из фильтра 8, пропускающего излучение вторичной люминесценции с максимумом в 520 нм, поляризатора типа Глана 18 и объектива 19. Координаты, в которые на транспаранте попадает свечение клеток, становятся координатами, где указанный транспарант становится прозрачным и через указанные прозрачные окна в силу использования эффекта обратного волнового фронта пропускаемое лазерное излучение попадает на кювету в области, оптически сопряженные с указанными местами на транспаранте. Учитывая малую подвижность клеток, находящихся в монослойной упаковке, облучение проводится в сканирующем режиме, для чего используется сканирование луча лазера 5 с помощью сканатора 4 на кювету через зеркало 3. С помощью видикона 1 и системы адресной регистрации и управления сканатором 2 фиксируются адреса светящихся клеток в пространстве кюветы. Адреса клеток, свечение которых повторяется после вторичной подсветки УФ-облучением выделяются и по ним проводится повторное облучение с повышенной мощностью.

Установка, выполненная по второму варианту, отличается тем, что оптическая система промежуточной регистрации изображения люминесцирующих клеток, состоит из отсекающего светофильтра 8, описанного выше и стекловолоконной шайбы 21, отображающей на своей внешней грани клетки с вторичной люминесценцией. Остальные элементы установки функционируют, как описано выше.

Формула изобретения

1. Способ разделения, элиминации и контроля популяций микрообъектов, включающий маркирование монокультуры микрообъектов функциональной меткой, внешнее воздействие на упомянутую метку и воздействие на маркированный микрообъект с целью его сортировки или элиминации, отличающийся тем, что гетерогенную смесь микрообъектов, содержащую в том числе маркированные микрообъекты, располагают в горизонтальной плоскости в виде монослоя, монослой доводят до рабочей температуры, затем монослой подвергают внешнему воздействию в виде облучения ультрафиолетовым светом, фиксируют информацию о реакции функциональной метки координатах свечения этой метки, выполненной в виде молекулы флуоресцеина, после чего на каждый светящийся микрообъект по полученным ранее координатам направляют сфокусированное лазерное излучение с мощностью, достаточной для требуемого действия изменения функционального состояния микрообъекта или элиминации, затем при проведении элиминации маркированных микрообъектов выдерживают время, достаточное для релаксации продуктов распада клетки после разрушения клеточной мембраны, затем монослой снова освещают ультрафиолетовым светом, по свечению неэлиминировавших маркированных микрообъектов с помощью оптико-электронной системы проводят сравнение вновь полученных координат и имевшихся ранее для этих микрообъектов, по результату сравнения на полученные координаты направляют лазерное излучение с увеличенной мощностью, после чего снова выдерживают время, необходимое для релаксации продуктов распада, а затем при отсутствии светящихся центров процедуру элиминации прекращают, после чего цикл проводят для новой порции гетерогенной смеси, а процедуру повтора облучением ультрафиолетовым светом и последующим лазерным воздействием при задаче сортировки, но без элиминации.

2. Установка для разделения, элиминации и контроля популяций микрообъектов, содержащая замкнутый объем для их размещения при воздействии на них внешними факторами, системы для воздействия на маркированную монокультуру и ее сортировки, отличающаяся тем, что замкнутый объем представляет собой плоский капилляр с прозрачными стенками, а системы для воздействия на маркированную монокультуру состоят из ультрафиолетового облучателя, размещенного с одной стороны плоского капилляра, оптической системы, оптико-электронной системы и лазерного излучателя, расположенного с другой стороны, при этом оптико-электронная система включена в цепь обратной связи с лазерным излучателем для ввода информации о результате воздействия ультрафиолетового облучения на монослой и ввода в оптико-электронную систему через оптическую систему, при этом последняя расположена между оптико-электронной системой, выполненной на основе видикона, и плоским капилляром.

3. Установка по п. 2, отличающаяся тем, что оптическая система включает объектив, проецирующий изображение светящихся маркированных микрообъектов на экран, служащий модулятором лазерного излучения, и выполненный в виде управляемого транспаранта.

4. Установка по п. 2, отличающаяся тем, что оптическая система выполнена в виде стекловолоконной шайбы с диаметром волокон, обеспечивающим пространственное разрешение на уровне единиц диаметра маркированных микрообъектов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3