Способ экстракции и разделения клеточных липидов

 

Использование: в области биохимии, в частности в способе разделения сложных смесей липидов с целью их дальнейшей идентификации. Сущность изобретения: исходный материал /клетки, в которых необходимо провести анализ липидов/ наносят целиком на покрытую силикагелем пластину для тонкослойной хроматографии, высушивают и, погружая пластину в камеру с растворителем, проводят одновременно экстракцию липидов из клеток и их разделение в восходящем токе растворителя. В отличие от известных способов анализа липидов, основанных на последовательном проведении экстракции липидов из клеток, очистки экстрактов и тонкослойной хроматографии, в заявляемом способе применена предварительная иммобилизация целых клеток на силикагеле, что позволяет проводить одновременно экстракцию и разделение липидов из клеток в восходящем токе растворителя. Способ позволяет повысить эффективность и точность метода экстракции и разделения клеточных липидов за счет проведения экстракции липидов из клеток, предварительно иммобилизованных на силикагеле. 3 ил.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу разделения сложных смесей липидов с целью их дальнейшей идентификации. В аналитической биохимии известны различные способы выделения и очистки липидов из животных тканей, большинство из которых основано на экстракции липидов смесью неполярного растворителя и полярного спирта и дальнейшем разделении методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) [1] Известны способы, когда для улучшения очистки липидов применялись дополнительные промывки липидных экстрактов смесью растворителей, обычно смесью хлороформ/метанол/H₂O [2] Но применение таких способов оказалось малоэффективным при получении липидов из незначительного количества исходного материала.

Наиболее близким решением является способ экстракции и разделения клеточных липидов по методу Блайя и Дайера [3] с последующим проведением тонкослойной хроматографии. Способ заключается в обработке ткани смесью хлороформ/метанол (1: 2), получении липидного экстракта, промывке его смесью хлороформ/метанол/H₂O, упаривании и тонкослойной хроматографии. В тех случаях, когда необходим анализ сравнительного содержания отдельных липидов в различных образцах, перед ТСХ проводят определение общего количества липидов в экстрактах.

Однако общепринятый способ имеет серьезные недостатки. Так, его применение для сравнительного анализа содержания липидов в отдельных образцах связано с необходимостью определения общего количества экстрагированных липидов, что не только требует большого количества исходного материала, но и увеличивает вероятность ошибки при получении конечного результата. Кроме того, метод чрезвычайно трудоемкий, что затрудняет его применение для одновременного анализа большого количества образцов, в частности при клинических исследованиях.

В современной экспериментальной и клинической биохимии все большее место занимают методики определения скорости обмена липидов, основанные на анализе включения в различные фракции липидов меченого предшественника. Применение для этих целей известного способа экстракции липидов в силу указанных причин оказывается малоэффективным и не позволяет с высокой достоверностью провести сравнительный анализ удельного включения изотопа в липиды из различных образцов.

Целью предлагаемого способа является повышение эффективности и точности метода экстракции и разделения клеточных липидов за счет проведения экстракции липидов из клеток, предварительно иммобилизованных на силикагеле.

Поставленная цель достигается тем, что исходный материал (клетки, в которых необходимо провести анализ липидов) наносят целиком на покрытую силикагелем пластину для тонкослойной хроматографии, высушивают и, погружая пластину в камеру с растворителем, проводят одновременно экстракцию липидов из клеток и их разделение в восходящем токе растворителя. Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что с целью повышения эффективности и точности определения внутриклеточных липидов интактные клетки (полученные в процессе культивирования in vitro или выделенные из тканей коллагеназным методом) наносят на покрытую силикагелем пластину и проводят одновременно экстракцию и разделение липидов на силикагеле в восходящем токе растворителя определенного состава. Известны способы анализа липидов, основанные на последовательном проведении экстракции липидов из тканей или клеток в присутствии растворителей, очистки экстрактов и разделении методом ТСХ. Однако ни в одном из известных способов не применяется экстракция липидов из клеток, иммобилизованных на силикагеле, восходящим током растворителя. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого способа критерию "существенные отличия".

Примеры конкретного выполнения.

Предлагаемый способ экстракции и разделения липидов был подвергнут экспериментальной проверке следующим образом.

I. Тест на эффективность экстракции и разделения липидов из клеток предлагаемым способом.

Клетки гепатомы 22 культивировали в среде L -15+10% сыворотки до образования монослоя в пластиковых матрасах объемом 50 см³. К клеткам добавляли ¹⁴C-олеиновую кислоту (3 мкКи/мл) и культивировали 1 час при 37^oC, что позволяло прометить основную часть клеточных липидов. Клетки снимали с матрасов, отмывали от несвязавшейся части метки в растворе Хэнкса и суспендировали в минимальном объеме раствора Хэнкса. Из части клеток липиды экстрагировали традиционным методом Блайя и Дайера [3] с дальнейшим разделением липидов методом ТСХ. Другую часть клеток наносили на покрытые силикагелем ТСХ пластины, высушивали и проводили хроматографию в восходящем токе растворителя. Система: хлороформ-метанол-NH₄OH-H₂O (65: 25: 1:3). После окончания хроматографии пластины высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой PM-B в течение 24 час. Анализ полученных автографов показал, что эффективность разделения липидов и значения Rf при использовании заявляемого способа остаются теми же, что и при использовании традиционного многоступенчатого метода очистки по Блайю и Дайеру (фиг.1).

Рехроматография пластин не приводила к дополнительной экстракции липидов из клеточной массы, что свидетельствует о высокой эффективности экстракции липидов при использовании предлагаемого способа. Об этом же свидетельствует и практически полное отсутствие метки в стартовой зоне при анализе заявляемым способом клеток, меченных ¹⁴C-олеиновой кислотой.

II. Использование заявляемого способа для анализа скорости обращения фосфолипидов клеток гепатомы 22 на разных стадиях роста.

К клеткам гепатомы 22 на 2-й и 6-й день после пересева добавляли на 20 мин ³²P-ортофосфат (20 мкКи/мл). Затем клетки снимали с матрасов, отмывали в растворе Хэнкса и меченные ³²P фосфолипиды анализировали предлагаемым способом как описано выше. Параллельно из клеток выделяли фосфолипиды традиционным методом (прототип) и разделяли ТСХ. Оказалось, что по мере роста и перехода клеток из экспоненциальной в стационарную фазу скорость включения ³²P в фосфолипиды снижается, что обнаруживается как при анализе фосфолипидов традиционным методом Блайя и Дайера, так и при использовании заявляемого способа (фиг. 2). При этом предлагаемый способ оказался не только менее трудоемким, но и более эффективным, поскольку: а) позволяет работать с существенно меньшим количеством материала (10₄ клеток), тогда как прототипный способ требует не менее 10₆ клеток; б) нормировка количества материала из разных образцов перед ТСХ проводится по количеству клеток и не связана с применением трудоемких и требующих значительного количества материала методов количественного определения липидов.

Таким образом, предлагаемый способ выделения и экстракции клеточных липидов позволяет по сравнению с прототипом: 1) существенно сократить время, необходимое для проведения всех экспериментальных процедур, связанных с выделением и очисткой липидов; 2) использовать в 100 раз меньшее количество исходного материала; 3) добиться большей точности при проведении сравнительного анализа содержания и скорости обмена липидов в различных образцах, поскольку этот метод не связан с необходимостью количественной оценки и нормирования липидов в процессе их очистки и перед разделением на ТСХ.

Благодаря перечисленным преимуществам, предлагаемый способ может быть использован не только в экспериментальных, но и в клинических исследованиях для определения чувствительности клеток к действию соединений, влияющих на скорость обмена липидов. В частности, известно, что действие на клеточную пролиферацию стероидных гормонов связано с изменением скорости обращения фосфолипидов [4] Результаты проведенных экспериментов (фиг.3) свидетельствуют, что добавление 17β эстрадиола к клеткам, выделенным из гормонозависимой опухоли молочной железы уже через 30 мин приводит к существенному увеличению включения ³²P в основные клеточные фосфолипиды: фосфоинозитиды, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин. Таким образом, применение заявляемого способа позволяет быстро и эффективно оценить чувствительность опухолевых клеток к гормону, используя в качестве критерия гормональной чувствительности изменение скорости включения ³²P в клеточные фосфолипиды.

Источники информации: 1. Э.Мэдди. Биохимическое исследование мембран. М. Мир, 1979.

2. Folch J. Lees M. Stenley G. J.Biol. Chem. 1957, 226, 497.

3. Bligh E.C. Dyer W. J. Can.J.Biochem.Physiol. 1959, 37, 911.

4. Freter C. F. Lippman M.E. Cheville A. e.a. Endocrinology, 1988, 2, 159.

Формула изобретения

Способ экстракции и разделения клеточных липидов путем обработки клеток смесью неполярного растворителя и полярного спирта с последующим проведением тонкослойной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности и точности определения внутриклеточных липидов, целые клетки предварительно наносят на покрытые силикагелем пластины и затем проводят экстракцию и разделение липидов в восходящем токе растворителя следующего состава: хлороформ: метанол: 7М аммиак: вода в соотношении 65:25:1:3 соответственно.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3