Способ непрерывного получения экзополисахаридов
Использование: относится к микробиологической промышленности и касается получения экзополисахаридов микробиологическим синтезом. Сущность изобретения: способ включает выращивание продуцирующего его штамма в условиях аэрации в питательной среде с использованием каскада ферментаторов. В первом ферментаторе штамм выращивают в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток в данном ферментаторе и 2-4 часов после достижения этого показателя, после чего полученная биомасса поступает во второй ферментатор, предварительно заполненный питательной средой, в котором находится в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток во втором ферментаторе и 2-4 часов после достижения того показателя. Содержимое второго ферментатора поступает поровну в третий и четвертый ферментаторы, предварительно заполненные питательной средой, при этом в третьем ферментаторе штамм выращивают в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток в данном ферментаторе и 2-4 часов после достижения этого показателя. После чего из третьего ферментатора биомасса поступает во второй и пятый ферментоторы в количестве, необходимом для получения готового продукта в рабочем объеме засеваемых ферментаторов, а из оставшейся биомассы в третьем ферментаторе и поступившей в четвертый ферментатор получают конечный продукт, после чего процесс повторяют с первого ферментатора. 1 ил, 2 табл.
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения биополимеров, например, экзополисахаридов.
Известны способы получения экзополисахаридов с использованием различных штаммов: Acinetobacter sp. ВКПМ В-3243 (авт. св. N 1579059), Bacillus polymyxa ВКПМ В-3015 (авт. св. N 1698293), консорциум дрожжей Candida tropicalis ЦМПМ У-507 и штамм бактерий Acinetobacter species ЦМПМ В-3243 (авт.св. N 1311256). Штаммы при росте на богатой органической среде в условиях аэрации при 28-30oС в течение 72-96 часов продуцируют полисахарид, превращая культуральную жидкость в гель. Можно осуществлять культивирование штамма Acinetobacter sp. на жидкой минеральной среде следующего состава: мас. KH2PO4 0,55; NaHPO4 1,0; NH4Cl 0,06; MgSO4 0,019; CaCl2 0,00075; FeSO4 0,0006, вода остальное. В качестве источника углеродного питания используют сахарозу в концентрации 4% или глюкозу в концентрации 2% или этанол в количестве 1 об. Посевную культуру B. polymyxa (10 об.) вносят в питательную среду, содержащую, об. гидролизованный кукурузный крахмал 3; БВК 0,5; KH2PO4 0,05; K2HPO4 3 H2O 0,05; MgO47 H2O 0,04; CaCl 2 0,02. Периодическое культивирование штаммов экзополисахаридов осуществляют в аппаратах типа АНКум объемом 10л, рабочий объем 4л. Общим недостатком известных способов получения экзополисахаридов является низкий выход целевого продукта, периодичность проведения процесса, длительность проведения процесса. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является непрерывный способ культивирования микроорганизмов, например, штаммов для получения экзополисахаридов, включающий выращивание продуцирующего его штамма в условиях аэрации в питательной среде с использованием каскада реакторов (авт. св. N 206491). Использование в процессе культивирования штаммов каскада реакторов позволяет интенсифицировать процесс выращивания штаммов. Недостатком прототипа является получение экзополисахаридов с изменяющимися свойствами, невозможность получения оптимальной совокупности полезных свойств, длительность процесса. Для получения экзополисахаридов с устойчивыми свойствами предлагается в первом ферментаторе штамм выращивать в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток в данном ферментаторе и 2-4 часов после достижения этого показателя, после чего полученная биомасса поступает во второй ферментатор, предварительно заполненный питательной средой, в котором находится в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток во втором ферментаторе и 2-4 часов после достижения этого показателя. Затем содержимое второго ферментатора поступает поровну в третий и четвертый ферментаторы, предварительно заполненные питательной средой, при этом в третьем ферментаторе штамм выращивают в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток в данном ферментаторе и 2-4 часов после достижения этого показателя, после чего из третьего ферментотора биомасса поступает во второй и пятый ферментаторы в количестве, необходимом для получения готового продукта в рабочем объеме засеваемых ферментаторов, а из оставшейся биомассы в третьем ферментаторе и поступившей в четвертый ферментатор получают конечный продукт, после чего процесс повторяют с первого ферментатора. Способ осуществляют следующим образом. 1. Подготовка посевного материала. Экзополисахарид получали с использованием двух видов штаммов. Жидкая питательная среда для выращивания культуры в колбах на качалках имеет следующий состав: Для штамма Acinetobacter sp KH2PO4 0,55 NaHPO4 1,0 NH4Cl 0,06 MgSO4 0,019 CaCl2 0,00075 FeSO4 0,0006 вода остальное. Для штамма Bacillus polymyxa гидролизованный кукурузный крахмал 3БВК 0,5
KH2PO4 0,05
K2HPO43 H2O 0,05
MgO47 H2O 0,04
CaCl2 0,02
вода остальное. Режим стерилизации питательной среды для колб 118oC в течение 30 мин. Для получения посевного материала в колбах-накопителях жидкую питательную среду засевают суспензией культуры с одного косяка. Суспензию готовят, приливая на каждый косяк 10 мл стерильного физ. раствора. Выращивание культуры в колбахнакопителях осуществляют на качалке при 28oC в течение 19-22 час. Число оборотов мешалки 220 об/мин. 2. Выращивание посевного материала осуществляют в инокуляторе вместимостью 0,1 м3. В аппарат загружают 35 л воды при работающей мешалке, затем остальные компоненты питательной среды. Заложенный посевной материал в количестве 1,2-1,5 л в асептических условиях внесен в аппарат через дозатор. 3. Ведение технологического процесса выращивания посевного материала в пяти ферментаторах. 1-ый ферментатор (объем 16 л) загружается питательной средой как описано выше. Затем готовый посевной материал передается из инокулятора в 1-ый ферментатор. Процесс ведется при 28oC с работающей мешалкой, расход воздуха 1-0,8 V воздуха/ 1 V среды. Для контроля за стерильностью и развитием продуцента отбираются пробы на стерильность, микроскопию и pH не реже 1 раза в 4 часа. Кроме того, снимается кривая роста культуры в различных фазах. Концентрацию клеток (г/л) определяют по оптической плотности раствора (см. график). А начало экспоненциальной, конец логарифмической фазы. Равномерные мелкие клетки округлой формы, расположенные неправильными группами, реже поодиночке или короткими цепочками. В экспоненциальная фаза роста, в группах молодые клетки, признак активного деления, максимальная скорость роста (точка перегиба кривой). С начало стационарной фазы роста, мелкие однородные вегетативные клетки. Д устойчивая стационарная фаза роста, популяция разнородная. ВВ' момент пересева культуры из одного ферментатора в другой. 2-ой ферментатор (объем 100 л) загружается питательной средой. После чего из первого ферментатора поступает посевной материал, находящийся в фазе роста ВВ'. В аппарате (условия процесса см. в 1-м ферментаторе) происходит процесс выращивания посевного материала. Одновременно снимается кривая роста клеток. Дойдя до точки перегиба В (максимальная скорость роста клеток), процесс выращивания продолжают еще 2-4 часа, после чего содержимое подают в равных долях в 3-й и 4-й ферментаторы объемом по 250 л, предварительно заполненные питательной средой. В 3-м ферментаторе процесс выращивания осуществляют аналогично 1-му и 2-му ферментатору. Также снимается кривая роста культуры. Доведя процесс до точки перегиба (В) для данного аппарата (максимальная скорость роста культуры), еще 2-4 часа продолжают вести процесс выращивания культуры. Затем из 3-го ферментатора дозатором часть биомассы переводится во 2-ой и 5-й ферментаторы, предварительно заполненные питательной средой. Объем 5-го ферментатора 250 л. В каждый из этих ферментаторов (2-ой и 5-ый) передали биомассу в количестве 5-20% от объема засеваемых аппаратов. Из оставшейся биомассы в 3-ем ферментаторе готовят конечный продукт. В 4-ом ферментаторе процесс также ведут до полного получения конечного продукта. После этого процесс повторяют с 1-ого ферментатора. Кривую роста культуры снимают только в пусковой период для определения времени максимальной скорости роста культуры для данного аппарата. Готовый продукт должен иметь следующие показатели (см. табл.1). Результаты опытов получения экзополисахаридов предложенным способом сведены в табл. 2. Передача биомассы из 1-ого, 2-ого и 3-ого ферментаторов в фазе роста ВВ' (см. кривую) позволяет получить экзополисахарид с требуемыми реологическими характеристиками (кинематическая вязкость), необходимыми в условиях нефтяного промысла. Содержание углеводов до 0,8% можно получить предлагаемым способом, в то время как по прототипу этот показатель получается не выше 0,2% В этой фазе отсутствуют признаки специфической бактериофагии культуры. Время процесса по заявляемому варианту составляет 40-44 часа. При работе установки в режиме по прототипу, когда каскад реакторов используется только для увеличения рабочего объема процесса, составило 72-74 часа.
Формула изобретения
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3PC4A - Регистрация договора об уступке патента Российской Федерации на изобретение
Номер и год публикации бюллетеня: 22-2001
(73) Патентообладатель:
Автономная некоммерческая организация "Научно-техническое объединение "ИТИН" (RU)
Договор № 12631 зарегистрирован 15.06.2001
Извещение опубликовано: 10.08.2001