Способ идентификации гриба candida albicans и гриба candida tropicalis

 

Использование: ветеринария, микология, диагностика кандидамикоза. Сущность изобретения: для идентификации грибов культуры выращивают в течение 20 - 24 ч в сыворотке крови с лактозой и дополнительно культивируют в течение 4 - 6 ч на среде с сахарозой и отдельно с двумя окислительно-восстановительными индикаторами, в качестве которых используют резазурин и 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорид, а в качестве показателя индикации используют изменение цвета среды дополнительного культивирования с резазурином и 2,3,5-трифенилтетразолиумом хлоридом. 1 табл.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной микологии и может быть использовано при микологической диагностике кандидамикоза.

Известен способ дифференциации грибов C.albicans и С.tropicalis от других дрожжеподобных грибов /а. с. N 1104153, МКИ С 12 N 1/16, 1984, Бюл. N 27/.

Однако указанный способ не обеспечивает высокую точность при проведении дифференциации между грибом C.albicans и грибом С.tropicalis, так как в зависимости от вида животного, их возраста и локализации патологического процесса, роль грибов C.albicans и С.tropicalis в возникновении и развитии кандидамикозного процесса неодинаковая /Себряков Е.В. Рекомендации по диагностике и мерам борьбы при кандидамикозе крупного рогатого скота, свиней, птицы, Персиановка, 1989г. /. Поэтому точная и надежная идентификация этих грибов является необходимым условием для правильной интерпретации результатов микологического исследования при диагностике кандидамикоза сельскохозяйственных животных.

Цель изобретения повышение точности способа.

Цель достигается тем, что согласно способу идентификации грибов культуры выращивают в течение 20 24 ч в сыворотке крови с лактозой и дополнительно культивируют в течение 4 6 ч на среде с сахарозой и отдельно с двумя окислительно-восстановительными индикаторами, в качестве которых используют резазурин и 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорид, а в качестве показателя идентификации используют изменение цвета среды дополнительного культивирования с резазурином и с 2,3,5-трифенилтетразолиумом хлоридом.

Способ осуществляют следующим образом.

В сыворотку крови крупного рогатого скота добавляют антибиотики /стрептомицин и пенициллин по 200 300 ед. на 1 мл/, стерилизуют фильтрованием через асбестовую пластинку в фильтре Зейтца, подкисляют 1 н. раствором соляной кислоты до pH 6,1 6,3 и добавляют 200 об. стерильного 15%-ного раствора лактозы на дистиллированной воде. Проверяют pH среды, который должен быть равен 6,2-6,4. Если после добавления раствора лактозы pH среды не соответствует этим показателям, ее подкисляют или подщелачивают/1 н. раствором соляной кислоты или 1 н. раствором едкого натрия/. Затем асептически разливают в стерильные пробирки по 3,0 мл, закрывают марле-ватными пробками и хранят в рефрижераторе при 2 4^oС.

Посев гриба производят 24-часовой культурой гриба, выращенной на агаре Сабуро с таким расчетом, чтобы в 1 мл среды находилось примерно 5 7 млн. клеток гриба /определяют по оптическому стандарту/. Пробирку с посевом гриба культивируют при 37^oС, поместив ее в штатив ШСА в наклонном положении под углом 10 15^o.

Через 20 24 ч инкубации определяют морфологические особенности гриба.

При микроскопическом исследовании в культуре грибов C.albicans и С.tropicalis обнаруживаются длинные прямые или извитые нити развитого псевдомицелия с овальными или слегка удлиненными бластоспорами, расположенными в местах сочленения сильно удлиненных клеток псевдомицелия. В культуре других дрожжеподобных грибов рода Candida преобладают овальные или овально-удлиненные почкующиеся дрожжевидные клетки. Иногда обнаруживаются короткие нити псевдомицелия, состоящие преимущественно из 3 6 удлиненных клеток.

Окончательную идентификацию гриба C.albicans и С.tropicalis проводят после определения дегидрогеназной активности с двумя окислительно-восстановительными индикаторами. С этой целью применяют среду, приготовленную на фосфатном буфере с pH 6,35 6,45, содержащую 20% сахарозы и 1,5% агар-агара. После двухкратной стерилизации текучим паром pH среды равен 6,10 6,25.

Растворы окислительно-восстановительных индикаторов готовят на стерильной дистиллированной воде. При приготовлении раствора резазурина растворяют одну таблетку индикатора /59 мг/ в 25 мл воды и кипятят на водяной бане 20 мин. Концентрация резазурина 0,02% При приготовлении раствора 2,3,5-трифенилтетразолиума хлорида 0,5 г индикатора растворяют в 25 мл воды и кипятят на водяной бане 20 мин.

В две стерильные бактериологические пробирки наливают по 1 мл расплавленной и охлажденной до 45 50^oС агаризованной среды с сахарозой. В первую пробирку добавляют 0,2 мл раствора резазурина, во вторую 0,2 мл раствора 2,3,5-трифенилтетразолиума хлорида. В обе пробирки добавляют по 1 мл культуральной жидкости, содержащей 20 24 часовую культуру гриба, выращенную в сыворотке крови с лактозой. Содержание пробирки перемешивают, помещают в обычный штатив и инкубируют в термостате при 37^oС в течение 4 6 ч. Одновременно определяют активную реакцию культуральной жидкости 20 - 24-часовой культуры гриба.

К 0,8 1,0 мл культуральной жидкости добавляют 1 2 капли метилового красного, приготовленного по общепринятой технологии.

Видовую принадлежность грибов определяют по таблице.

Как видно из таблицы, желтая окраска культуральной жидкости после добавления метилового красного и изменения цвета среды при дополнительном культивировании с резазурином из сине-фиолетового в малиновый или красный в течение 4 6 ч наблюдается у грибов C.albicans и C.tropicalis, а изменение цвета среды с 2,3,5-трифенилтетразолиумом хлоридом из желтого в оранжевый или розовый у гриба C.tropicalis.

Предлагаемый способ позволяет в течение 24 28 ч идентифицировать гриб C. albicans и гриб C. tropicalis, что представляет существенный практический интерес для микологической диагностики кандидамикоза сельскохозяйственных животных и своевременного проведения лечебно-профилактических мероприятий.

Формула изобретения

Способ идентификации гриба Candida albicans и гриба Candida tropicalis, включающий выращивание культуры гриба в сыворотке крови с лактозой, определение морфологических особенностей культуры гриба, добавление индикатора, дополнительное культивирование в течение 4 6 ч на агаризированной среде, содержащей сахарозу, отличающийся тем, что дополнительное культивирование проводят отдельно с двумя индикаторами, в качестве которых используют резазурин и 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорид, а в качестве показателя идентификации используют изменение цвета среды с сахарозой и этими индикаторами.

РИСУНКИ

Рисунок 1