Лазерный флуориметрический детектор для высокоэффективной микроколоночной жидкостной хроматографии

 

Использование: в области лазерной спектроскопии для анализа малых количеств флуоресцирующих жидкостей в высокоэффективной микроколоночной жидкостной хроматографии. Сущность изобретения: в канале регистрации флуоресцентного излучения на его оптической оси между интерференционным фильтровым монохроматором и фотоприемником расположена фокусирующая линза, в заднем по ходу излучения фокусе которой на входном окне фотоприемника расположена полевая диафрагма с прямоугольным окном, при этом задний фокус линзы и центр прямоугольного окна полевой диафрагмы расположены на оптической оси канала регистрации флуоресцентного излучения и на одинаковом фокусном расстоянии от фокусирующей линзы. Размеры прямоугольного окна полевой диафрагмы связаны с высотой прямоугольного окна щелевой диафрагмы канала возбуждения и шириной проточного канала кюветы соотношением: h_п=f₂/f₁·h_щ, l_п=f₂/f₁·l_к, где h_п и l_п - соответственно, высота и ширина полевой диафрагмы; f₁ - фокусное расстояние объектива сбора флуоресцентного излучения; f₂ - фокусное расстояние фокусирующей линзы канала регистрации флуоресцентного излучения; h_щ - высота окна щелевой диафрагмы канала возбуждения; l_к - ширина проточного канала кюветы. 2 ил.

Изобретение относится к лазерной спектроскопии и может быть использовано для анализа малых количеств флуоресцирующих жидкостей в высокоэффективной микроколоночной жидкостной хроматографии.

Известен лазерный флуориметрический детектор для высокоэффективной микроколоночной жидкостной хроматографии, содержащий канал возбуждения, канал регистрации флуоресцентного излучения, опорный канал и проточную кювету в виде рога Вуда [I] Оптические оси всех трех каналов детектора расположены в одной плоскости. Оптическая ось канала возбуждения расположена под углом 90^o, как к оптической оси опорного канала, так и к оси канала регистрации флуоресцентного излучения.

Особенность конструкции кюветы заключается в наличии удаленных от точки пересечения осей боковых выходных окон. В связи с этим в поле зрения боковых выходных окон кюветы находятся как область пересечения входного бокового отверстия и проточного канала кюветы, так и само входное боковое отверстие кюветы почти целиком. Особенностью оптической схемы детектора является наличие теневых диафрагм, расположенных непосредственно у боковых окон кюветы. Указанные особенности конструкции кюветы и оптической схемы детектора не позволяют иметь линейную калибровочную характеристику рассматриваемого детектора. Это объясняется тем, что для теневых диафрагм, расположенных у окон, боковое входное отверстие кюветы практически является полностью открытым, и в плоскости теневых диафрагм всегда действует флуоресцентное излучение, индуцированное непосредственно в лазерном луче, и одновременно флуоресценция, индуцированная вдоль канала входного бокового отверстия кюветы. Считается, что область флуориметрической пропорциональности для растворов простирается до концентрации 10^-4-10^-5 г/мл. Такая флуориметрическая пропорциональность сохраняется только при регистрации флуоресцентного излучения, индуцированного непосредственно в лазерном луче, флуоресценции, индуцированной вдоль канала бокового входного отверстия кюветы, дает нелинейную калибровочную характеристику детектора второго порядка. Наличие нелинейной калибровочной характеристики является основным недостатком рассматриваемого детектора.

Известен лазерный флуориметрический детектор для высокоэффективной микроколоночной жидкостной хроматографии (2), выбранный в качестве прототипа, содержащий канал возбуждения, на оптической оси которого последовательно установлены источник когерентного излучения, узел формирования лазерного излучения, выполненный в виде цилиндрического телескопа, и щелевая диафрагма с регулируемой высотой и фиксированной шириной прямоугольного окна, прямоточную с внутренним квадратным каналом для протока исследуемой жидкости кювету, канал регистрации флуоресцентного излучения, на оптической оси которого последовательно установлены объектив сбора флуоресцентного излучения, интерференционный фильтровой монохроматор и фотоприемник излучения флуоресценции, опорный канал, оптическая ось которого является продолжением оптической оси канала возбуждения, и канал нормировки сигналов, соединенный с каналом регистрации и опорным каналом, при этом оптическая ось канала регистрации расположена под углом 90^o к оптической оси канала возбуждения, а ось проточного канала кюветы является нормалью к общей для оптических осей каналов плоскости в точке пересечения оптических осей, расположенных в переднем по ходу излучения фокусе объектива.

Лазерным лучом в кювете детектора индуцируется источник флуоресцентного излучения, которое собирается объективом и передается к фотоприемнику. При этом в плоскости входного окна фотоприемника наблюдается увеличенное изображение источника флуоресцентного излучения кюветы. Для реализации максимальной чувствительности детектирования в плоскости входного окна ФЭУ получают полное изображение источника флуоресцентного излучения вместе с изображением остальной части канала кюветы, занятой вторично возбужденным объемом анализируемого вещества. Одновременная регистрация вместе с флуоресцентным излучением, индуцированным непосредственно в лазерном луче, флуоресценции, индуцированной вдоль канала прямоточной кюветы детектора, также дает нелинейную калибровочную характеристику второго порядка. Для линеаризации калибровочной характеристики авторами используется персональная ЭВМ "Искра-226". Линеаризация калибровочной характеристики детектора реализована авторами рассматриваемого детектора только в рамках методики анализа ДНС-аминокислот. При этом калибровочная характеристика линеаризована с помощью персональной ЭВМ в пределах ограниченного линейного динамического диапазона, не превышающего 2-х порядков. При переходе к методикам анализа других веществ линеаризация нарушается.

Поэтому основным недостатком оптической схемы рассматриваемого детектора является наличие линейного динамического диапазона не более двух порядков на одной ступени ослабления оптического сигнала при чувствительности 3,2·10^-11 г/мл по флуоресценту и 7·10^-11 г/мл по ДНС-аминокислотам.

Целью изобретения является расширение линейного динамического диапазона лазерного флуориметрического детектора.

Цель достигается тем, что в лазерном флуориметрическом детекторе для высокоэффективной микроколоночной жидкостной хроматографии, содержащем канал возбуждения, на оптической оси которого последовательно установлены источник когерентного излучения, узел формирования лазерного излучения, выполненный в виде цилиндрического телескопа, и щелевая диафрагма с регулируемой высотой и фиксированной шириной прямоугольного окна, прямоточную с внутренним квадратным каналом для протока исследуемой жидкости кювету, канал регистрации флуоресцентного излучения, на оптической оси которого последовательно установлены объектив сбора флуоресцентного излучения, интерференционный фильтровой монохроматор и фотоприемник излучения флуоресценции, опорный канал, оптическая ось которого является продолжением оптической оси канала возбуждения, и канал нормировки сигналов, соединенный с каналом регистрации и опорным каналом, при этом оптическая ось канала регистрации расположена под углом 90^o к оптической оси канала возбуждения, а ось проточного канала кюветы является нормалью к общей для оптических осей каналов плоскости в точке пересечения оптических осей, расположенных в переднем по ходу излучения фокусе объектива, в канале регистрации флуоресцентного излучения на его оптической оси между интерференционным фильтровым монохроматором и фотоприемником расположена фокусирующая линза, в заднем по ходу излучения фокусе которой на входном окне фотоприемника расположена полевая диафрагма с прямоугольным окном, при этом задний фокус линзы и центр прямоугольного окна полевой диафрагмы расположены на оптической оси канала регистрации флуоресцентного излучения и на одинаковом фокусном расстоянии от фокусирующей линзы, а размеры прямоугольного окна полевой диафрагмы связаны с высотой прямоугольного окна щелевой диафрагмы канала возбуждения и шириной проточного канала кюветы соотношениями: где h_п и l_п соответственно, высота и ширина полевой диафрагмы; f₁ фокусное расстояние объектива сбора флуоресцентного излучения; f₂ фокусное расстояние фокусирующей линзы канала регистрации флуоресцентного излучения; h_щ высота окна щелевой диафрагмы канала возбуждения; l_к ширина проточного канала кюветы.

Расширение линейного динамического диапазона лазерного флуориметрического детектора обеспечивается расположением в канале регистрации флуоресцентного излучения на его оптической оси между интерференционным фильтровым монохроматором и фотоприемником фокусирующей линзы, расположением в заднем по ходу излучения фокусе линзы на входном окне фотоприемника полевой диафрагмы с прямоугольным окном, расположением прямоугольного окна полевой диафрагмы и заднего фокуса линзы на оптической оси канала регистрации флуоресцентного излучения на одинаковом фокусном расстоянии от фокусирующей линзы, увязкой размеров прямоугольного окна полевой диафрагмы с высотой прямоугольного окна щелевой диафрагмы канала возбуждения и шириной проточного канала кюветы соотношениями:

C помощью фокусирующей линзы создается действительное увеличенное изображение канала кюветы в плоскости полевой диафрагмы. Изображение канала состоит из действительных увеличенных изображений первично возбужденного объема 13 и вторично возбужденных объемов 12, 14 (фиг.2).

Полевая диафрагма пропускает изображение первично возбужденного объема на входное окно фотоприемника и не пропускает изображения вторично возбужденных объемов.

В отсутствие в канале регистрации флуоресцентного излучения фокусирующей линзы и расположенной в заднем по ходу излучения фокусе линзы на входном окне фотоприемника полевой диафрагмы с прямоугольным окном вполне определенных размеров, точным образом связанных с размерами окна щелевой диафрагмы канала возбуждения и шириной проточного канала кюветы, фотоприемником регистрируется как флуоресценция, индуцированная в кювете непосредственно в лазерном луче или первично возбужденном объеме, так и флуоресценция, индуцированная вдоль канала кюветы, флуоресценцией, индуцированной непосредственно в лазерном луче или во вторично возбужденном объеме. Причиной флуоресценции вдоль канала кюветы является перекрытие спектров поглощения и флуоресценции. При одновременной регистрации флуоресценции от первично и вторично возбужденных объемов наблюдается сильная нелинейная зависимость (второго порядка) между суммарной интенсивностью флуоресцентного излучения и концентрацией анализируемого вещества. Линейная зависимость для растворов простирается до концентраций 10^-4-10^-5 г/мл. Такая флуориметрическая пропорциональность сохраняется только при регистрации флуоресцентного излучения, индуцированного непосредственно в лазерном луче или первично возбужденном объеме.

Поэтому для получения линейной калибровочной характеристики с помощью фокусирующей линзы в плоскости полевой диафрагмы создается действительное увеличение изображение канала кюветы, которое состоит из действительных увеличенных изображений первично возбужденного объема и вторично возбужденных объемов, и с помощью прямоугольного окна полевой диафрагмы на входное окно фотоприемника пропускается только изображение первично возбужденного объема за счет того, что размеры прямоугольного окна полевой диафрагмы через фокусные расстояния фокусирующей линзы и объектива сбора флуоресцентного излучения точно соотносятся с высотой прямоугольного окна щелевой диафрагмы канала возбуждения и шириной проточного канала кюветы.

Если , то на фотоприемник вместе с изображением первично возбужденного объема попадает изображение вторично возбужденного объема и поэтому линейность калибровочной характеристики нарушается. При на фотоприемник попадает часть изображения первично возбужденного объема и поэтому уменьшается объем детектирования и чувствительность анализа.

Расположением в канале регистрации флуоресцентного излучения на его оптической оси между интерференционным фильтровым монохроматором и фотоприемником фокусиpующей линзы, расположением в заднем по ходу излучения фокусе линзы на входном окне фотоприемника полевой диафрагмы с прямоугольным окном, расположением прямоугольного окна полевой диафрагмы и заднего фокуса линзы на оптической оси канала регистрации флуоресцентного излучения на одинаковом фокусном расстоянии от фокусирующей линзы, увязкой размеров прямоугольного окна полевой диафрагмы с высотой прямоугольного окна щелевой диафрагмы канала возбуждения и шириной проточного канала кюветы соотношениями:

позволяет иметь линейную калибровочную характеристику в пределах 4-х порядков на одной ступени ослабления оптического сигнала при чувствительности 1,5·10^-12 г/мл по флуоресцеину в режиме высокоэффективной микроколоночной жидкостной хроматографии. При этом при наличии дополнительной ступени ослабления оптического сигнала может быть обеспечено дополнительное расширение линейного динамического диапазона регистрации детектора еще на три порядка, и тем самым может быть обеспечена общая линейность в пределах семи порядков.

На фиг. 1 представлена оптическая схема детектора; на фиг.2 изображение канала кюветы в плоскости полевой диафрагмы.

Лазерный флуориметрический детектор для высокоэффективной жидкостной хроматографии содержит лазер 1, узел формирования лазерного излучения 2 в виде цилиндрического телескопа, щелевую диафрагму 3, проточную кювету 4, канал регистрации флуоресцентного излучения, включающий объектив сбора флуоресцентного излучения 5, интерференционный фильтровой монохроматор 6, фокусирующую линзу 7, полевую диафрагму 8, фотоприемник излучения флуоресценции 9, опорный канал 10, канал нормировки сигналов 11.

Детектор работает следующим образом. Излучение лазера 1 формируется цилиндрическим телескопом 2 в параллельный пучок излучения прямоугольного поперечного сечения в виде узкой полоски, вытянутой вдоль канала проточной диафрагмы 4 детектора. С помощью прямоугольного окна щелевой диафрагмы 3 вырезается полоска лазерного излучения, ширина которой равна l_к канала кюветы 4 для протока исследуемой жидкости, а длина определяется высотой h_щ окна щелевой диафрагмы и выбирается исходя из необходимого объема возбуждения. После щелевой диафрагмы параллельный пучок лазерного излучения, ограниченный ее прямоугольным окном, проходит через струю исследуемой жидкости. Струя образуется в канале проточной кюветы 4. Канал кюветы 4 имеет в поперечном сечении прямоугольную форму 0,5·0,5 мм и длину 10 мм. Излучение флуоресценции собирается объективом 5, в переднем фокусе которого расположен лазерно индуцированный источник флуоресцентного излучения, занимающий первично возбужденный объем анализируемого вещества в кювете 4. После объектива 5 параллельный пучок флуоресцентного излучения проходит через интерференционный фильтр 6. Далее излучение с помощью линзы 7 фокусируется на плоскость полевой диафрагмы 8 с прямоугольным окном. В плоскости полевой диафрагмы 8 создается действительное увеличенное изображение первично возбужденного объема и вторично возбужденных объемов. Полевая диафрагма 8 через свое прямоугольное окно пропускает изображение первично возбужденного объема на входное окно фотоприемника 9 и не пропускает изображение вторично возбужденных объемов. Сигналы канала регистрации флуоресцентного излучения и опорного канала 10 подаются в канал нормировки 11, на входе которого получают отношение этих сигналов. При этом в канале нормировки обеспечивается нормировка сигнала флуоресценции на сигнал опорного канала. Нормировка обеспечивает компенсацию нестабильности мощности излучения лазера, которая может приводить к большим погрешностям при измерениях сигнала флуоресценции. Канал регистрации флуоресцентного детектора работает в режиме счета одно-электронных импульсов фотоприемника. В качестве фотоприемника используется квантокон ФЭУ-136.

Преимуществом предлагаемой конструкции по сравнению с известной является расширение линейного динамического диапазона регистрации на два порядка на одной ступени ослабления оптического сигнала. При этом на одной ступени ослабления известный детектор имеет линейный динамический диапазон не более двух порядков, а предлагаемый не менее четырех порядков. Общий линейный динамический диапазон известного детектора на трех ступенях ослабления оптического сигнала составляет не более шести порядков, а линейный динамический диапазон предлагаемого детектора при двух ступенях ослабления обеспечивает семь порядков.

Формула изобретения

Лазерный флуореметрический детектор для высокоэффективной микроколоночной жидкостной хроматографии, содержащий канал возбуждения, на оптической оси которого последовательно установлены источник когерентного излучения, узел формирования лазерного излучения, выполненный в виде цилиндрического телескопа, и щелевая диафрагма с регулируемой высотой и фиксированной шириной прямоугольного окна, прямоточную с внутренним квадратным каналом для протока исследуемой жидкости кювету, канал регистрации флуоресцентного излучения, на оптической оси которого последовательно установлены объектив сбора флуоресцентного излучения, интерференционный фильтровой монохроматор и фотоприемник излучения флуоресценции, опорный канал, оптическая ось которого является продолжением оптической оси канала возбуждения, и канал нормировки сигналов, соединенный с каналом регистрации и опорным каналом, при этом оптическая ось канала регистрации расположена под углом 90^o к оптической оси канала возбуждения, а ось проточного канала кюветы является нормалью к общей для оптических осей каналов плоскости в точке пересечения оптических осей, расположенной в переднем по ходу излучения фокусе объектива, отличающийся тем, что в канале регистрации флуоресцентного излучения на его оптической оси между интерференционным фильтровым монохроматором и фотоприемником расположена фокусирующая линза, в заднем по ходу излучения фокусе которой на входном окне фотоприемника расположена полевая диафрагма с прямоугольным окном, при этом задний фокус линзы и центр прямоугольного окна полевой диафрагмы расположены на оптической оси канала регистрации флуоресцентного излучения и на одинаковом фокусном расстоянии от фокусирующей линзы, а размеры прямоугольного окна полевой диафрагмы связаны с высотой прямоугольного окна щелевой диафрагмы канала возбуждения и шириной проточного канала кюветы соотношениями


где h_п и l_п соответственно высота и ширина полевой диафрагмы,
f₁ фокусное расстояние объектива сбора флуоресцентного излучения,
f₂ фокусное расстояние фокусирующей линзы канала регистрации флуоресцентного излучения,
h_щ высота окна щелевой диафрагмы канала возбуждения,
l_к ширина проточного канала кюветы.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2