Устройство для выделения ооцитов из яичников млекопитающих

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биологии. Сущность изобретения: устройство для выделения ооцитов из яичников млекопитающих представляет собой кусочек лезвия безопасной бритвы, вырезанный ножницами таким образом, что на его торцевых сторонах имеется по одному выступу с закругленными краями длиной 4,5-5 мм, шириной 1,5-2 мм, расположенному параллельно режущей кромке. Сочетание режущего кончика и выступа с закругленными краями на одной рабочей стороне устройства позволяет быстро выделять ооциты с неповрежденным кумулюсом дифференцированно из отдельных фолликулов. 1 табл., 3 ил.

Устройство относится к сельскохозяйственной биологии и может быть использовано для выделения ооцитов из антральных фолликулов яичников млекопитающих, в частности, крупного рогатого скота, с целью получения зародышей путем дозревания и оплодотворения ооцитов in vitro в биологических лабораториях.

Известно несколько устройств для выделения ооцитов из антральных фолликулов яичников крупного рогатого скота.

1. Устройство для забора яйцеклеток из яичников млекопитающих (Германия. Gluth J.et al. патент N 285020, A 61 D 1/00, 1990) состоит из корпуса, внутри которого установлены конусообразные, разделенные каждый на две части подвижный и неподвижный держатели ножей. В держателях ножей на возможно меньшем расстоянии сделаны пазы, в которые установлены специальные ножи. Предусмотрена особая заточка ножей для предотвращения их быстрого затупления, связанного с разрезанием белочной оболочки и ткани яичника. С помощью особого толкателя яичник проталкивается по внутреннему каналу устройства. При этом ткань яичника разрезается, фолликулы вскрываются, и ооциты высвобождаются из фолликулов. Изготовление данного устройства возможно только в заводских условиях на специальном оборудовании. Оно трудоемко при подготовке к работе, стерилизации, разборке и мытье после работы. Упоминания о практическом использовании данного устройства в доступной нам литературе нет.

2. Устройство для извлечения ооцитов из изолированного яичника (Лимонов В. И. Лемонов Н.И. патент N 1750579, A 61 D 19/02, 1992) представляет собой две жестко закрепленные параллельно расположенные инъекционные иглы одинаковой длины, одна из которых герметично соединена со шприцом. Кончики игл вводятся в полость фолликула. Через одну иглу из шприца в фолликул подается среда, через вторую среда вместе с содержимым фолликула собирается в приемник. При этом током жидкости ооцит вымывается из фолликула. Упоминания о практическом применении данного устройства для выделения ооцитов из фолликулов в доступной нам литературе нет.

3. Устройство, представляющее собой единичное лезвие безопасной бритвы (Михайленко А.В. и др. "Биологические науки", 1983, 9, 57-62). Ткань яичника многократно рассекается лезвием безопасной бритвы. При этом антральные фолликулы вскрываются, и ооциты высвобождаются из них. Устройство позволяет выделить большое количество ооцитов в расчете на 1 яичник. Недостатком является невозможность выделить ооциты дифференцированно из фолликулов определенного размера или определенного местоположения (на поверхности яичника или в его мозговом слое). Вследствие этого популяция выделенных ооцитов оказывается очень гетерогенной по качеству. Кроме того, лезвие бритвы быстро тупится в процессе работы. Данное устройство является прототипом к предлагаемому изобретению.

4. Устройство, состоящее из 2-10 лезвий безопасной бритвы, расположенных параллельно на расстоянии 1,5-2 мм друг от друга (Bottecher et al. Wiss Z. Universitat Rostok N-Reihe 1983, 38(4), 21-24), позволяет ускорить процесс рассечения яичников по сравнению с применением единичного лезвия. Однако при этом возрастают затраты времени на подготовку устройства к работе и значительно увеличивается расход лезвий безопасной бритвы.

5. Устройство для выделения ооцитов путем аспирирования состоит из инъекционной иглы, герметично соединенной со шприцом или другим резервуаром, в котором создается разрежение. Это устройство наиболее широко используется в мировой практике выделения ооцитов из антральных фолликулов (Mochizuki et al. Meriogenology, 1991, 36, 973-986; Choi et al. Meriogenology, 1991, 36, 863-873; Madison et al. Reprod. Nutr. Dev. 1991, 31, 159-165). Устройство работает следующим образом. Игла вводится в полость фолликула, и с помощью шприца содержимое фолликула аспирируется. Примерно в 60% случаев вместе с фолликулярной жидкостью из фолликулов выделяются ооциты. Данное устройство позволяет быстро и чисто выделять ооциты дифференцированно из фолликулов заданного размера. Существенными недостатками являются: невозможность выделить ооциты из мелких фолликулов, низкий выход ооцитов в расчете от числа аспирированных фолликулов, повреждение в различной степени слоев кумулюса у комплекса ооцит-кумулюс в процессе отсасывания их из полости фолликула. В итоге получается низкий выход ооцитов с неповрежденным кумулюсом в расчете на 1 яичник.

6. Выделение ооцитов из изолированных фолликулов (Bottcher et al. Wiss. Z. Universitat Rostok N-Reihe, 1983, 38(4), 21-24). Вначале с помощью ножниц из яичника вырезают фолликулы. По морфологическим признакам отбирают неатретические фолликулы нужного размера. Затем с помощью препаровальной иглы вскрывают фолликулы и выскребают внутренние стенки фолликула. При этом ооциты вместе с прилегающими слоями кумулюса высвобождаются из фолликула. В результате получается наиболее однородная популяция ооцитов с неповрежденным кумулюсом, пригодных для дозревания и оплодотворения in vitro. Недостатком метода является то, что он требует больших затрат труда и времени на предварительное вырезание фолликулов из яичников.

Цель изобретения разработать устройство, простое в изготовлении и при использовании, позволяющее быстро выделять ооциты с неповрежденными слоями кумулюса из фолликулов заданного размера без предварительного вырезания фолликулов из яичника.

Характеристика прототипа. Наиболее близким к предлагаемому является устройство, представляющее собой лезвие безопасной бритвы. Ткань яичника рассекается лезвием безопасной бритвы. При этом вскрываются все попадающие под лезвие антральные фолликулы, и ооциты высвобождаются из фолликулов. Достоинством данного устройства является его простота, быстрота проведения работы и большой выход ооцитов, пригодных для культивирования, в расчете на 1 яичник. Недостатком является невозможность дифференцированно выделить ооциты из фолликулов заданного размера или места расположения (на поверхности яичника или в его мозговом слое). Кроме того, лезвие бритвы быстро тупится при разрезании белочной оболочки и ткани яичника, что вызывает большой расход лезвий.

Предлагаемое устройство изготавливается из лезвия безопасной бритвы (марки "Восход", "Рапира") с помощью ножниц, а также может готовиться специально промышленным способом.

Вначале лезвие ножницами разрезают по его осевым линиям на 4 равные части (фиг.1). Каждую из полученных 4 частей подрезают ножницами таким образом, чтобы на их торцевых краях получилось по одному выступу с закругленными краями длиной 4,5-5 мм, шириной 1,5-2 мм, расположенному параллельно режущей кромке бритвы (фиг.2). Таким образом, из одной бритвы получается четыре устройства для выделения ооцитов, каждое из которых имеет по две рабочие стороны. При этом режущая часть образуется за счет режущей кромки бритвы.

Устройство работает следующим образом. Устройство перед работой протирают тампоном, смоченным 70^o-ным этиловым спиртом для очистки его поверхности и дезинфекции. В качестве ручки используют какой-либо хирургический зажим (например, кровоостанавливающий зажим, пинцет Пеана, иглодержатель и т.д. фиг.3).

Яичник крупного рогатого скота помещают в чашку Петри со средой. Кончиком режущей кромки устройства разрезают стенку выбранного антрального фолликула, выступающую над поверхностью яичника. Затем с помощью выступа устройства одним движением выскребают внутренние стенки вскрытого фолликула. При этом ооцит с неповрежденным кумулюсом высвобождается из фолликула в среду. Таким образом, с помощью разработанного устройства в зависимости от задач эксперимента выделяются ооциты из всех видимых на поверхности яичника антральных фолликулов или дифференцированно из фолликулов заданного размера. Для выделения ооцитов из антральных фолликулов, находящихся в мозговом слое, яичник предварительно ножницами разделяют со стороны ворот на две половинки.

После выделения ооцитов из фолликулов нескольких яичников содержимое чашки Петри просветляют несколько раз декантированием. Ооциты собирают со дна чашки под лупой (х30).

Таким образом, сочетание режущего кончика и выступа с закругленными краями на одной рабочей стороне устройства позволяет быстро выделять ооциты с неповрежденным кумулюсом дифференцированно из фолликулов заданного размера и их месторасположения. Режущий кончик долго не тупится, так как разрезается не весь яичник, как в случае применения лезвия, а только стенка фолликула. При затуплении в процессе работы одного режущего кончика используется вторая рабочая сторона устройства.

Было проведено 8 экспериментов по выделению ооцитов из антральных фолликулов крупного рогатого скота с помощью предлагаемого устройства. Выход ооцитов с неповрежденным кумулюсом составил 2828 из 247 яичников, или 11,4 на один яичник в среднем.

По данным литературы (таблица), выход ооцитов с неповрежденным кумулюсом на 1 яичник составляет при применении: устройства для аспирирования 2,5-3,0 лезвия для разрезания яичников 6,0 выделение ооцитов из предварительно вырезанных фолликулов 9,0-10,5 Таким образом, предлагаемое устройство просто при изготовлении и применении, экономично в расходовании лезвий безопасной бритвы (материала), позволяет быстро и гарантированно выделять ооциты с неповрежденным кумулюсом дифференцированно из отдельных фолликулов без предварительного вырезания фоликулов из яичника.

Формула изобретения

Устройство для выделения ооцитов из яичников млекопитающих, содержащее металлическую пластинку в виде лезвия безопасной бритвы, отличающееся тем, что пластинка выполнена в виде 1/4 части лезвия с двумя выступами длиной 4,5-5 мм и шириной 1,5-2 мм с закругленными краями, причем выступы расположены на торцевых сторонах верхней части пластинки и расположены параллельно режущей части.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4