Способ получения сырца гонадотропина хорионического

 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается способа получения сырца гонадотропина хорионического. Целью изобретения является повышение удельной активности целевого продукта. Для достижения этой цели мочу беременных женщин со сроком беременности 8-12 недель осветляют, пропуская через микрофильтрационные мембраны с размером пор 0,22-0,5 мкм. Осветленное сырье концентpиpуют на ультрафильтрационном модуле с полыми волокнами с пределом отсечения 10-70 килоДальтон. Полученный концентрат отмывают от мочевины и солей дистиллированной водой при рН 5,8-7,0. В концентрате доводят рН до 3,8-4,2 и выделяют осадок, содержащий гонадотропин хорионический, добавлением избытка ацетона. Для переосаждения активного осадка, содержащего гонадотропин хорионический, осадок растворяют в 5-10% аммонийно-ацетатном буфере, содержащем 50-70% этилового спирта. Осаждение целевого продукта осуществляется повышением концентрации этанола до 90-92%. Активность полученного продукта составляет 1500-2000 ед/мг, выход 85,7-90%.

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается способа получения сырца гонадотропина хорионического (ХГ).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ получения гонадотропина хорионического, осуществляемый в соответствии с авторским свидетельством СССР N 1504845, кл. А 61 К 37/38, 1987 г.

Согласно этому способу мочу беременных женщин подкисляют до рН 4,2-4,5, осветляют, пропускают через ультрафильтрационный модуль с пределом отсечения 50-100 кД. Концентрат мочи промывают аммонийно-ацетатным буфером, рН 4,2-4,5, пропускают через ультрафильтрационный модуль с пределом отсечения 15-30 кД. Полученный концентрат промывают аммонийно-ацетатным буфером, рН 4,2-4,5, доводят рН концентрата до 5,2-5,5 и осаждают сырец добавлением этанола до конечной концентрации 75-80% Осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом, ацетоном и досушивают на воздухе. Выход сырца гонадотропина хорионического составляет 45-50 мг из 1 л сырья, удельная активность 820-850 ед/мг.

Способ характеризуется низкой удельной активностью получаемого сырца, большим расходом материалов (аммонийно-ацетатного буфера). Потери гормона происходят на начальном этапе получения при подкислении сырья, которое сопровождается выпадением осадка, при этом теряется и ХГ, а также на этапе концентрирования при промывании концентрата большими объемами буфера с кислым значением рН (4,2-4,5) за счет диссоциации в этих условиях гормона на субъединицы с молекулярной массой 15-24 кД.

Целью настоящего изобретения является повышение удельной активности целевого продукта.

С этой целью получение сырца гонадотпропина хорионического включает осветление исходного сырья микрофильтрацией на мембранах 0,22-0,5 мкм при рН 5,6-8,5, концентрирование гормона ультрафильтрацией при тех же значениях рН с последующим промыванием концентрата дистиллированной водой при рН 5,8-7,0, осаждение целевого продукта органическим растворителем и его выделение из осадка путем экстракции аммонийно-ацетатным буфером с последующим переосаждением целевого продукта органическим растворителем.

Сравнение предлагаемого способа с известным показывает, что общими существенными признаками у них являются: осветление исходного сырья, концентрирование гормона с помощью ультрафильтрации с последующей промывкой, осаждение органическим растворителем и выделение конечного продукта. Однако в отличие от прототипа в заявляемом способе исходное сырье осветляют микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,22-0,5 мкм при рН 5,6-8,5, концентрирование ультрафильтрацией проводят при тех же значениях рН, концентрат промывают дистиллированной водой при рН 5,8-7,0, а выделение гормона из осадка осуществляют экстракцией аммонийно-ацетатным буфером с последующим переосаждением продукта органическим растворителем.

Отсутствие подкисления на этапах осветления, концентрирования и промывания концентрата уменьшает инактивацию гормона и его диссоциацию на субъединицы, что способствует повышению удельной активности препарата. Проведение осветления с помощью микрофильтрации без изменения рН снижает потери за счет предотвращения соосаждения ХГ. Кроме того, если в прототипе экстракцию гормона аммонийно-ацетатным буфером проводят в процессе 2-х этапной ультрафильтрации, что, как уже было сказано выше, сопровождается потерями гормона, то в заявляемом способе за счет разделения стадий концентрирования и экстракции гормона аммонийно-ацетатным буфером (экстракция проводится после осаждения ХГ органическим растворителем) повышается удельная активность продукта и значительно уменьшается расход реактивов (аммонийно-ацетатного буфера в 25 раз).

Приведенная совокупность отличительных признаков заявляемого способа в литературе не описана и влияние их на достижение технического результата не следует из известного уровня техники, что свидетельствует о соответствии заявляемого способа критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Способ получения сырца гонадотропина хорионического в соответствии с предлагаемым изобретением осуществляется следующим образом.

Мочу беременных женщин со сроком беременности 8-12 недель осветляют, пропуская через микрофильтрационные мембраны с размером пор 0,22-0,5 мкм. Осветленное сырье концентрируют на ультрафильтрационном модуле с полыми волокнами с пределом отсечения 10-40 килоДальтон. Полученный концентрат отмывают от мочевины и солей дистиллированной водой при рН 6,8-7,0. В концентрате доводят рН до 3,8-4,2 и выделяют осадок, содержащий гонадотропин хорионический, добавлением избытка ацетона. Для переосаждения активного осадка, содержащего гонадотропин хорионический, осадок растворяют в 5-10% аммонийно-ацетатном буфере, содержащем 50-70% этилового спирта. В этих условиях растворяются исключительно белки гликопротеиновой природы. Осаждение целевого продукта осуществляется повышением концентрации этанола до 90-92% Пример 1. Мочу беременных женщин с содержанием ХГ 70 ед/мг, рН 6,0 в количестве 60 л пропускают через микрофильтрационный модуль, заправленный мембранами 0,22 мкм. Осветленное сырье подают на ультрафильтрационный модуль с пределом отсечения 30 килоДальтон и концентрируют до 0,6 л. Концентрат промывают 4-мя объемами дистиллированной воды при постоянном объеме до значения рН 6,5. Затем в концентрате с помощью раствора соляной кислоты (1:1) устанавливают рН 3,8, добавляют 1,8 л ацетона, смесь выдерживают при температуре 4-6^oC 12-14 часов. После этого осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном и досушивают на воздухе. Для экстракции гормона 6 г получившегося осадка обрабатывают 120 мл 10% аммонийно-ацетатного буфера, содержащего 70% этанола, и осаждают сырец гонадотропина хорионического добавлением этанола до концентрации 90-92% Смесь выдерживают при температуре 4-6^oC 12-14 часов, осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом, ацетоном и досушивают на воздухе. Вес сырца гонадотропина хорионического 1,8 г, активность 2000 ед/мг. Выход гормона 85,7% Пример 2. Мочу беременных женщин с содержанием ХГ 50 ед/мг, рН 8,0 в количестве 60 л пропускают через микрофильтрационный модуль с мембранами 0,45 мкм, а затем через ультрафильтрационный модуль с пределом отсечения 10 кД и концентрируют до 0,6 л. Концентрат промывают дистиллированной водой до значения рН 6,0. Затем в концентрате с помощью раствора соляной кислоты (1:1) устанавливают рН 4,2, добавляют 1,8 л ацетона, смесь выдерживают при температуре 4-6^oC 12-14 часов. После этого осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном и досушивают на воздухе. Для экстракции гормона 6 г получившегося осадка обрабатывают 120 мл 10% аммонийно-ацетатного буфера, содержащего 70% этанола, и осаждают сырец гонадотропина хорионического добавлением этанола до концентрации 90-92% Смесь выдерживают при температуре 4-6^oC 12-14 часов, осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом, ацетатом и досушивают на воздухе. Вес сырца гонадотропина хорионического 1,8 г, активность 1500 ед/мг. Выход гормона 90% Заявляемый способ позволяет в 2-3 раза повысить удельную активность сырца гонадотропина хорионического по сравнению с прототипом. Способ технологичен и не требует большого расхода реактивов.

Формула изобретения

Способ получения сырца гонадотропина хорионического из мочи беременных женщин, включающий осветление исходного сырья, концентрирование с последующей промывкой, осаждение целевого продукта органическим растворителем и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что осветление исходного сырья проводят микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,2 0,5 мкм при pH 5,6 8,5, концентрирование осуществляют ультрафильтрацией, концентрат промывают дистиллированной водой при pH 5,8 7,0, а выделение целевого продукта из осадка проводят экстракцией аммонийно-ацетатным буферным раствором с последующим переосаждением органическим растворителем.