Способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью

 

Изобретение относится к медицине, в частности технологии лекарственных средств, и может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения ртутьсодержащих препаратов, предназначенных для использования как при экспериментальных исследованиях, так и в клинической практике. Изобретение заключается в том, что сулему растворяют в молочной сыворотке, в которую предварительно вносят 27 - 33 г/л сахарозы. Затем полученный раствор нагревают на водяной бане при 35 - 45^oС в течение 15 - 20 мину После нагревания смесь выдерживают при 5 - 10^oС в течение 4 - 6 сут. Проведенные исследования свидетельствуют о выраженном цитостатическом действии на опухолевых культурах, а также иммунотропном действии препарата в отношении реакции клеточного иммунитета - реакции "трансплантат против хозяина". Под влиянием препарата происходит стимуляция лимфоцитов как в отношении реакций против чужеродных клеток, так и в отношении клеток того же генотипа, но находящихся в другой особи. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности технологии лекарственных средств, и может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения ртутьсодержащих препаратов, предназначенных для лечения опухолей как доброкачественной, так и злокачественной природы, кожных заболеваний (псориаз, экзема и др.), внутренних болезней (болезни органов пищеварения, кишечные инфекции) и т.д.

Известны различные препараты, обладающие противоопухолевым действием, и способы их получения.

Из патентной литературы известны способы получения композиций, содержащих в своем состав дихлорид ртути (сулему) [1, 2] Их можно рассматривать как аналоги способа получения заявляемого препарата. Так в патенте Индии описан процесс получения композиции для лечения рака мягких тканей человека. Способ включает смешение равных количеств хорошо измельченных просеянных порошкообразных ртутьсодержащих соединений: ртути дихлорида (сулемы, HgCl₂), ртути хлорида (каломели, Hg₂Cl₂), ртути сульфида (киновари, HgS), ртути оксида (HgO), ртути сульфата (HgSO₄). Смесь подвергают сублимации (возгонке). Собирают белый кристаллический десублимат; 1,0 г полученного десублимата растирают (тритурируют) с 10,0 г лактозы. Этот процесс повторяют 10 раз, в каждом случае берут 1,0 г нового тритурированного продукта и 10,0 г лактозы. После 10-й операции к 1,0 г полученного продукта прибавляют 10,0 г абсолютного спирта, энергично встряхивают. Процесс смешения и встряхивания исходных компонентов повторяют 100 раз. Продукт, полученный после 100 операции, смешивают с лактозой в соотношении исходных компонентов 1:5. Готовый препарат фасуют по 200 мг. Полученное лекарственное средство предназначено для внутреннего применения.

Метод имеет следующие недостатки: 1. Использован сложный компонентный состав, включающий 5 ртутьсодержащих соединений. Из них сублимации (возгонке) при нагревании могут подвергаться лишь два соединения, а именно: дихлорид ртути (сулема) с т.пл. 280^oС и т. кип. 301,8^oС и сульфид ртути (киноварь), температура его возгонки 580^oС. Ртути хлорид и ртути оксид при температуре выше 400^oС разлагаются. Ртути сульфат претерпевает процесс разложения при температуре выше 500^oС. Эти процессы протекают по следующим уравнениям: Таким образом, для трех ртутьсодержащих соединений указанный выше процесс протекает с разложением до металлической ртути (Hg), которая имеет т. пл. -39^oС и т.кип. 357^oС. Последняя легкоплавка и летуча. В этой связи не ясен компонентный состав препарата на конечном этапе его приготовления. В патенте отсутствует его аналитическая характеристика.

2. В технологическом исполнении данный метод является чрезвычайно сложным и достаточно кропотливым.

Известен патент США, в котором описан способ приготовления композиции, которая в основном предназначена для наружного применения для лечения кожных заболеваний, таких как псориаз, экзема, ихтиоз и др. Способ получения композиции заключается в том, что в этиловом спирте в определенных соотношениях растворяют камфору, масло горьких миндалей, масло можжевеловых ягод и др. компоненты. Далее по порядку прибавляют карболовую кислоту, дихлорид ртути и раствор ментола. К смеси прибавляют оливковое масло, но можно это масло в состав препарата не включать или его количество уменьшить. Для получения готового продукта смесь выдерживают от одного дня до недели для того, чтобы в ней прошли химические превращения. Следует отметить, что этиловый спирт, который применяется как растворитель при приготовлении данной композиции, не защищает ионы ртути (Hg²⁺) от их токсического действия на организм человека, т.к. не может образовывать с ртутью соединений по ее координационным связям.

Ближайшим аналогом предложения является способ получения противоракового средства на основе дихлорида ртути (сулемы), используемого в народной медицине.

Способ заключается в растворении 1,0 г дихлорида ртути (сулемы) в 3 л дистиллированной или кипяченой (родниковой, колодезной) воды с последующим выдерживанием смеси в течение 6 ч. Затем 30 г этого раствора смешивают с 3,0 л воды и полученный раствор выдерживают в течение 12 ч.

Однако получаемый известным образом препарат является токсичным, поскольку при приготовлении композиции в раствор не вводится каких-либо компонентов, защищающих ионы ртути (Hg²⁺) от их токсического воздействия на организм. Вода, которая применяется в качестве растворителя, не имеет в своем составе комплексообразующих соединений, реактивных групп (например, сульфгидрильных и других групп), которые реагировали бы с ртутью и тем самым уменьшали ее токсические свойства.

Кроме того, при хранении в водном растворе и в контакте с воздухом дихлорид ртути постепенно разлагается и препарат теряет свои фармакологические свойства.

Целью изобретения является создание оригинального способа, который бы позволил получить высокоактивный и нетоксичный препарат широкого спектра действия.

Для этого разработан способ получения другого ртутьсодержащего препарата, названного условно Витуридом С.

Его состав: дихлорид ртути (сулема), молочная сыворотка. Введение в компонентный состав в качестве растворителя молочной сыворотки для растворения дихлорида ртути (сулемы) позволило с помощью предлагаемого способа исключить токсическое действие ионов ртути.

Молочная сыворотка применяется в пищевой промышленности и по способу подразделяется на творожную, подсырную и казеиновую.

Все виды молочных сывороток вырабатываются на молочных заводах из пастеризованного молока, обладают практически идентичным составом и свойствами. Качество их регламентируется в соответствии с техническими условиями (ТУ) по следующим показателям: кислотность в ^oТ, активная кислотность по показателю (рН), плотность (в кг/м³ при 15^oС), содержанию массовой доли белковых веществ, сухих веществ, содержанию молочного сахара (лактозы), и др.

Молочная сыворотка имеет желто-зеленую окраску, что объясняется наличием в ней рибофлавина (витамина В₂). Молочная сыворотка имеет специфический физико-химический состав и физико-химические свойства, структурно-механические, оптические, теплофизические и электрические характеристики.

Компонентный состав молочной сыворотки близок к компонентному составу плазмы крови и является физиологичным для организма человека. В ее состав входят сывороточные белки, пептиды, пептоны, свободные аминокислоты, молочный сахар (лактоза), молочная, лимонная кислоты, витамины водорастворимые: тиамин (D₁), рибофлавин (В₂), ниацин (РР), пиридоксин (В₆), цианкобаломин (В₁₂), аскорбиновая кислота (С), биотин (Н), пантотеновая кислота (В₃), фолацин (В_c), холин; жирорастворимые витамины: ретинол (А), β-каротин, токоферолы (Е); микроэлементы ионы Cu, Zn, Fe, Со, и др. соли кальция (Са), фосфора (Р), магния (Mg), натрия (Na), калия (К).

Всего в молочной сыворотке обнаружено до 30 различных макро-, микро-, ультрамикроэлементов.

Энергетическая ценность молочной сыворотки составляет 1013 кДж/кг или 36% энергетической ценности цельного молока.

Многие компоненты молочной сыворотки сывороточные белки, молочный сахар (лактоза), органические кислоты, ферменты, витамины и другие являются лигандами по отношению к ионам двухвалентной ртути (Hg²⁺), последние токсичны в свободном виде для живого организма.

Отличительной особенностью ионов (Hg²⁺) является их сильная комплексообразующая способность со многими лигандами.

В результате комплексообразования обеспечивается протекторная защита ионов ртути (Hg²⁺), что приводит к получению не токсичного конечного продукта Витурида С.

Важной особенностью получаемого препарата является то, что основной действующий компонент его дихлорид ртути, содержащий ион (Hg²⁺), будучи одним из наиболее сильно связывающихся ионов металлов подвергается также быстрому лигандному обмену, что является важной характерной чертой ртутной токсикологии.

В организме человека ртутьсодержащие комплексы распадаются, свободные ионы ртути (Hg²⁺), взаимодействуя с сульфгидрильными группами белковых макромолекул (например, известно, то многие формы опухолей сопровождаются нарушением продукции ферментов, белков, гормонов), блокируют их действие, создают желаемый противоопухолевый эффект и далее выводятся из организма через почки, слюну и кожу при потоотделении.

Возвращаясь к характеристике молочной сыворотки, следует подчеркнуть, что сывороточные белки ее составляют 20% от массовой доли белков молока. Основную часть сывороточных белков составляют β-лактальглобулин и a-лактальбумин, для последнего характерно высокое содержание серы вдвое больше, чем в казеине.

Под действием протеолитических ферментов (протеаз, куда входят протеиназы и пептидазы) происходит дальнейшее расщепление сывороточных белков по пептидным связям с образованием свободных аминокислот, таких как аргинин, аланин, аспарагиновая кислота, валин, глицин, глютаминовая кислота, лейцин, изолейцин, пролин, серин, тирозин, цистеин, фенилаланин. Особенно богаты сывороточные белки незаменимыми аминокислотами, в которых содержание таких дефицитных аминокислот, как лизин, гистидин, треонин, триптофан, метионин, наиболее высоко. Аминокислоты в своем составе содержат активные донорные атомы, в основном атомы серы (S) и азота (N), которые участвуют в комплексообразовании с ионами двухвалентной ртути (Hg²⁺), тем самым уменьшая ее токсичность.

При приготовлении Витурида С оптимальные условия проведения процесса ферментации температура не выше 40^oС, что связано с тем, что молочная сыворотка богата продуктами жизнедеятельности протеолитических ферментов, таких как дипептидазы, аминополипептидазы, карбоксиполипептидазы, карбоксипептидазы, пролиназы и др. химическая структура которых чрезвычайно лабильна и легко инактивируется с повышением температуры.

В этой связи процесс нагревания раствора дихлорида ртути (сулемы) в молочной сыворотке предлагается проводить при температуре 40±5^oС. Для этой цели можно использовать обычную водяную баню, что значительно упрощает аппаратурную схему технологического процесса. В защите ионов ртути (Hg²⁺) от токсического действия на человеческий организм принимает участие за счет гидроксильных групп, находящийся в молочной сыворотке, сахар - лактоза.

Молочный сахар (лактоза) является основным углеводом молока и положительно влияет на усвоение кальция и фосфора в организме человека. По физико-химическим свойствам он отличен от сахарозы. Благодаря наличию в молекуле карбонильной группы лактоза проявляет в растворах редуцирующие (восстанавливающие) свойства. Лактоза вступает в реакцию с аминогруппами белков и свободных аминокислот и рядом других функциональных групп в организме человека. В отличие от многих других сахаров лактоза медленно гидролизуется под действием кислот и ферментов. Поэтому в пищеварительном тракте она достигает тонкого отдела кишечника и может быть использована для питания микрофлорой и способствует питанию этих полезных видов бактерий в кишечнике.

На первой стадии молочнокислого брожения (содержание бактерий в молоке таково: при 15 30^oС преобладают Streptococcus lactis. Данный вид грамположительных микроорганизмов хорошо развивается при 10^oС, но при температуре выше 40^oС его рост прекращается. При температуре 30 40^oС доминируют различные виды Lactobacillus. Streptococcus lactis и Lactobacillus относятся к молочнокислым бактериям. В ходе брожения (анаэробного дыхания) эти бактерии образуют из лактозы (молочного сахара) молочную кислоту, которая, накапливаясь, вызывает скисание молока. Стрептококки необходимы для нормального получения молочнокислых продуктов, в том числе и молочной сыворотки) лактоза подвергается сбраживанию после предварительного расщепления ее ферментом β-галактозидазой (лактозой) на составляющие ее моносахара: глюкозу и галактозу. Фермент b-галактозидаза выделяется молочнокислыми бактериями и некоторыми грибами. Отличительная особенность галактозы состоит в том, что она необходима человеческому организму для построения нервных и мозговых тканей. Глюкоза, подвергаясь ряду ферментативных превращений, в конечном итоге образует две молекулы пировиноградной кислоты.

На второй стадии молочнокислого брожения пировиноградная кислота восстанавливается в молочную кислоту при участии фермента лактодегидразы.

Молочная кислота является важным показателем качества молочной сыворотки. Полезное свойство данной кислоты для живого организма ее антимикробное действие подавление развития гнилостных бактерий в кишечнике и улучшение состава микрофлоры. Молочная кислота в процессе брожения (ферментации) частично преобразуется в пропионовую, уксусную кислоты, соединяется с кальцием, образуя лактазы, и разлагается на более простые соединения.

Особенно следует подчеркнуть, что молочная кислота, содержащаяся в молочной сыворотке, создавая кислую среду (активная кислотность (рН) для творожной, подсырной, казеиновой сывороток составляет: 4,7; 6,1 и 4,5 4,7 соответственно) защищает основной действующий компонент дихлорид ртути (сулему) от разложения и окисления в процессе приготовления препарата, а также при его хранении.

Следует также отметить, что процесс молочнокислого брожения молока является очень близким к гликолизу в мышцах, т.е. процессу анаэробного ферментативного расщепления моносахаридов, главным образом глюкозы, через промежуточный 1,6-дифосфат фруктозы в тканях с образованием молочной кислоты.

Освобождающаяся при гликолизе энергия в организме используется для синтеза АТФ (аденозинтрифосфорной кислоты) из АДФ (аденозиндифосфата). Образующаяся в скелетных мышцах молочная кислота при гликолизе может затем превратиться в глюкозу, а последняя в печени превращается в гликоген.

Этот биохимический путь известен как цикл Кори. Образовавшаяся пировиноградная кислота поступает в организме человека в цикл Кребса, где полностью окисляется до СO₂ и Н₂O, при этом образуется большое число молекул АТФ и высвобождается значительное количество энергии.

В связи со сказанным, используемая для приготовления препарата Витурида С молочная сыворотка является сама дополнительным источником питания для организма больного человека, особенно детей.

Согласно разработанному способу к молочной сыворотке для усиления ее протекторных свойств по отношению к основному действующему компоненту препарата дихлориду ртути (сулеме) дополнительно ex tempore прибавляют сахар-рафинад или сахарный песок в количестве 3% За счет свободных гидроксильных групп, находящихся в молекуле сахарозы, осуществляется защита ионов ртути (Hg²⁺) по ее координационным связям.

Процесс приготовления препарата Витурида С состоит в следующем: вначале готовят 3% -ный раствор сахарозы в молочной сыворотке. Затем дихлорид ртути (сулему) растворяют в растворе сахарозы в молочной сыворотке. Полученный раствор нагревают на водяной бане в течение 15 20 мин таким образом, чтобы температура реакционной массы составляла 40±5^oС. Далее раствор дихлорида ртути (сулемы) в 3% -ном растворе сахарозы в молочной сыворотке оставляют на выдержку в течение 5 дней (±1 сутки).

Процесс нагревания раствора дихлорида ртути (сулемы) проводят, чтобы усилитель процесс ферментации и одновременно комплексообразования ионов ртути (Hg²) с лигандными компонентами, содержащимися в молочной сыворотке. Химическая реакция осуществляется за счет активных сульфгидрильных (SН), гидроксильных (OH), амино- (NH₂) и других функциональных групп лигандных молекул по координационным связям ионов ртути (Hg²⁺). В результате химической реакции комплексообразования образуются ртутьсодержащие комплексные соединения.

Кислая реакция молочной сыворотки (рН 4,3 4,7) способствует образованию гидрокомплексов, которые при неправильном хранении препарата на свету, при доступе атмосферного кислорода и т.д. могут выпадать в осадок в результате образования полиядерных комплексов.

Для препарата Витурид С не отмечена аллергическая реакция на организм человека и его можно назначать больным по медицинским показаниям без ограничения возраста.

Пример 1. К 5,1 л творожной молочной сыворотки прибавляют 0,153 кг сахара-рафинада или сахарного песка, смесь перемешивают до полного растворения сахара. Выход составляет 100% считая на сахар-рафинад (сахарный песок).

В стеклянный стакан вместимостью 1 л наливают 0,7 л 3%-ного раствора сахарозы в творожной молочной сыворотке, прибавляют к ней 1,70 г (6,2 ммоль) дихлорида ртути (сулемы). Смесь тщательно перемешивают деревянной или стеклянной палочкой до полного растворения дихлорида ртути (сулемы).

В 10 л бутыль с помощью пластмассовой воронки наливают 3,5 л 3%-ного раствора сахарозы в творожной молочной сыворотке. Затем прибавляют к нему при перемешивании (деревянной палочкой) свежеприготовленный раствор дихлорида ртути (сулемы). Далее к раствору прибавляют остальное количество (0,9 л) 3% -ного раствора сахарозы в творожной молочной сыворотке. Полученный раствор перемешивают деревянной палочкой в течение 5 10 мин.

Далее бутыль с приготовленным раствором помещают на водяную баню и нагревают при перемешивании (деревянной палочкой) при температуре реакционной массы 40^oС в течение 15 мин. Затем раствор охлаждают в естественных условиях и оставляют для выдержки при температуре 7^oС в течение 5 сут.

Раствор в количестве 0,2 л передают в аналитическую лабораторию для проведения анализов.

Выход на стадии с учетом передачи раствора в аналитическую лабораторию составляет 96,1% считая на исходный дихлорид ртути.

После получения положительных результатов анализа полученный раствор дихлорида ртути (сулемы) в 3%-ном растворе сахарозы в творожной молочной сыворотке (Витурид С) разливают в соответствующие емкости.

Физико-химическая характеристика препарата Витурида С приведена в таблице.

Пример 2.

Способ осуществляют, как описано в примере 1, с тем отличием, что для приготовления препарата Витурида С используют казеиновую молочную сыворотку. Температура нагревания реакционной массы 45^oС, время нагревания 17 мин. Выдержку приготовленного раствора дихлорида ртути (сулемы) в 3%-ном растворе сахарозы в казеиновой молочной сыворотке осуществляют при температуре 5^oС в течение 4 сут.

Физико-химическая характеристика препарата приведена в таблице.

Пример 3.

Процесс проводят аналогично способу, описанному в примере 1, с тем отличием, что для приготовления препарата используют подсырную молочную сыворотку. Температура нагревания реакционной массы 35^oС, время нагревания 20 мин. Выдержку приготовленного раствора дихлорида ртути (сулемы) в 3%-ном растворе сахарозы в подсырной молочной сыворотке проводят при температуре 10^oС в течение 6 сут.

Физико-химическая характеристика препарата приведена в таблице.

Токсикологическая характеристика препарата Витурида С.

Изучение острой токсичности LD₅₀ проводили в соответствии с методическими рекомендациями ФК Минздрава СССР.

Перорально крысам вводили жидкую лекарственную форму Витурида С в количествах: 2; 1,5; 1 и 0,5 мл, что соответствовало дозам сулемы 0,66;495; 0,33 и 0,165 мг/кг. В контроле животным вводили соответственно растворитель молочную сыворотку.

Показано, что лекарственная форма Витурида С, вводимая крысам перорально, соответственно лечебному назначению не оказывала острого токсического воздействия на организм крыс.

Оценка аллергенных свойств препаратов группы "Витурид" (исследования проведены в институте "Биотехнология").

Опыты проводили на морских свинках и мышах беспородных и гибридах первого поколения линий СВА и С₅₇В₁. Препарат животным вводили по схеме, предложенной для клинического применения: в течение месяца, кроме случаев, специально предусмотренных используемой методикой постановки теста. Были использованы терапевтические дозы и дозы в 5 раз их превышающие.2 Витурид С использовали, как описано в примерах 1,2,3.

На животных изучены реакции: общей анафилаксии, активной кожной анафилаксии, гиперчувствительности замедленного типа, иммунных комплексов, накожных аппликаций.

Результаты реакций отрицательные как у контрольных, так и у опытных животных.

Исследовано влияние препарата Витурида С на пищевую аллергенность.

Установлено, что ни у опытных, ни у контрольных животных не было обнаружено проявления аллергических реакций.

Противоопухолевая активность препарата на перевиваемых опухолевых культурах линии L-41.

Исследование проведено на перевиваемых лейкоцитарных опухолевых культурах линии L-41.

Культивирование культур проводили по общепринятому методу. Плотность посева клеток составляла 1·10⁵ клеток в 1 мл среды. В качестве питательной среды использовали в равных соотношениях среду 199, среду Игла с добавлением 10% -ной бычьей сыворотки и антибиотиков: 100 ед. пенициллина и 50 ед. стрептомицина на 1 мл среды.

Препарат Витурид С и отдельно молочную сыворотку и дихлорид ртути (сулему) разводили на безбелковой питательной среде и вносили их в различных концентрациях в 3 4 культуры для контакта с клеточным монослоем. Так как действующим началом в препарате Витурид С является сулема, то в предварительном опыте для сравнения установили, что ЕД₅₀ сулемы, тормозящей рост опухолевых культур L-41, составляет 10 мкг/мл. На вторые сутки после постановки опыта производили микроскопическую оценку действия препарата по 4-х бальной системе и количественное определение содержания белка культур по методу Лоури в модификации Ояма и Игла.

Критерий цитостатической активности препарата процент торможения роста культур по угнетению синтеза белка.

Исследование биологического действия препарата Витурид С, молочной сыворотки и действующего основного компонента сулемы на перевиваемых лейкоцитарных опухолевых культурах линии L-41 показало, что ЕД₅₀ препарата Витурид С составляет 9,9 мкг/мл. ЕД₅₀ сулемы примерно 8 мкг/мл. Близость значений ЕД₅₀ позволяет предположить, что действующим началом в препарате является сулема. Молочная сыворотка оказывает незначительное стимулирующее влияние на культуры до 10% в исследуемых концентрациях.

Согласно существующим стандартным методам отбора противоопухолевых препаратов в СССР и США, препарат является активным in vitro, если его ЕД₅₀ меньше или равны 100 мкг/мл.

Наши исследования показали, что ЕД₅₀ препарата Витурид С составляет 10 мкг/мл, что в 10 раз превышает стандарт и свидетельствует о его выраженном цитостатическом действии на опухолевых культурах.

Изучение иммунофармакологических свойств препаратов группы Витурид Проведены исследования некоторых иммунофармакологических свойств препаратов группы Витурид (Витурид С и Витурид В); изучено влияние препаратов данной группы на реакцию трансплантат против хозяина, титры антител к корпускулярному антигену, на количество антителообразующих и антигеносвязывающих клеток в селезенках мышей, на массу тимуса и селезенки мышей, функциональное состояние монооксигеназной системы ферментов организма.

Опыты проведены на мышах как беспородных, так и линейных (гибридах первого поколения линий СВА и С₅₇В₁) в соответствии с методикой, рекомендованной ФК МЗРФ. Препараты вводили в дозах, эквивалентных рекомендованным для клинического применения у людей (50 мкл каждой мыши ежедневно), в течение первых трех дней в половинной дозе. Продолжительность введения 10 и 20 дней. Выполнена статистическая обработка полученных данных.

Результаты: обнаружено, что препараты группы Витурид обладают оригинальными иммунофармакологическими свойствами, которые, вероятно, определяют один из механизмов противоопухолевой активности препаратов (см. таблицу).

Формула изобретения

Способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, включающий растворение дихлорида ртути в растворителе и последующее выдерживание смеси, отличающийся тем, что в качестве растворителя используют молочную сыворотку, содержащую сахарозу в количестве 27 33 г/л, а дихлорид ртути растворяют до его концентрации в растворе 0,033% после чего полученный раствор нагревают на водяной бане при температуре 35 45^oС в течение 15 - 20 мин и его выдерживание проводят при 5 10^oC в течение 4 6 суток.

РИСУНКИ

Рисунок 1