Производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями

 

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям - производным поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы где R₁ - алкил (С₁-С₁₆), (СН₂)_1-16ОН, -(СН₂)_1-5СОR₂, где R₂ - -ОН, -ОСН₃, -О(СН₂)_1-3СН₃, -NHNH₂, -NН(СН₂)_1-10NH₂, n = 310-2000, q = 0,2-0,9, Z = 0,1-0,8, Hal - Cl, Br, I, обладающих иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями. Производные поли-1,4-этиленпиперазина могут найти применение в медицине и ветеринарии для коррекции иммунного ответа и профилактики вирусных и бактериальных инфекций. Указанные соединения получают частичным N-оксидированием поли-1,4-этиленпиперазина перекисью водорода и полученные N-оксиды поли-1,4-этиленпиперазина алкилируют с образованием четвертичных аммониевых солей. 3 табл.

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям - производным поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы R₁ алкил (С₁-С₁₆), (СН₂)_1-16ОН, (СН₂)_1-5СОR₂, где R₂ -ОН, -ОСН₃, -О(СН₂)_1-3СН₃, -NHNH₂, -NН(СН₂)_1-10NH₂,
n 310-2000,
q (0,2-0,9),
Z (0,1-0,8),
Hal Cl, Br, I, обладающих иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями.

Известны синтетические биологически активные полимеры, которые являются четвертичными аммонийными солями поли1,4-этиленпиперазина, полученные алкилированием соответствующего полимера. Они обладают антигепариновой активностью. Однако эти соединения токсичны (LD₅₀50-100 мг/кг массы тела), не выводятся из организма и не могут использоваться в качестве медицинских препаратов [1]
Цель изобретения новые высокомолекулярные производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие высокой иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями, нетоксичные, способные к деструкции и выведению из организма.

Поставленная цель достигается производными поли-1,4- этиленпиперазина вышеприведенной общей формулы.

Указанные соединения получают путем химического синтеза в две стадии. На первой стадии проводят частичное N- оксиды указанного полиамина [2] Затем N-оксиды поли-1,4- этиленпиперазина модифицируют по реакции свободных третичных атомов азота с различными алкилирующими соединениями. Получают модификаты, содержащие N-оксидные и четвертичные аммониевые группы в основной цепи и реакционноспособные функциональные группы в боковой цепи макромолекулы.

Предлагаемые высокомолекулярные производные поли-1,4- этиленпиперазина характеризуются ярко выраженной иммуномодулирующей активностью. Показатель иммуностимуляции превышает в ряде случаев 10. Противовирусная активность соединений выражена к ряду вирусных заболеваний животных, антибактериальная эффективность отмечена для группы кишечных заболеваний.

Данные соединения водорастворимы, нетоксичны (LD₅₀1-2,5 г/кг), деструктируют и выводятся из организма, не проявляют побочных действий. Наличие в боковой цепи реакционноспособных функциональных групп позволяет использовать данные соединения в качестве носителей антигенов при получении конъюгатов антиген-полимер.

Структура производных поли-1,4-этиленпиперазина и основные физико-химические характеристики однозначно определяются методами ЯМР-, ПМР-, ИК-спектроскопии, малоуглового лазерного светорассеяния.

Ниже приводятся конкретные примеры получения и изучения биологической активности производных поли-1,4-этиленпиперазина.

Пример 1. C 1. Поли-1,4-этиленпиперазин (М_w= 35000, n 310) в количестве 5 г растворяют в 250 мл 1%-ного раствора уксусной кислоты. К раствору при охлаждении (2-4^oС) и перемешивании добавляют 4,6 мл 30%-ного раствора перекиси водорода. Окисление проводят в течение 48 ч, после чего проводят ультрафильтрационную очистку и лиофильное высушивание. Полученный N-оксид поли-1,4-этиленпиперазина растворяют в 125 мл метилового спирта и добавляют 16,5 г бромуксусной кислоты. Реакцию алкилирования поли-N-оксида проводят при 25^oС в течение 14 ч. Растворитель упаривают в вакууме, остаток растворяют в воде, диализуют против воды, лиофильно высушивают. Получают соединение формулы

с выходом 95% степень окисления, определяемая методами хромометрического титрования и по соотношению интегральных интенсивностей полос ПМР-спектра в области 2,5-4,5 м.д. составляет z 0,65n; степень алкилирования, определяемая по ИК-спектрам (полоса 1735 см^-1) и ПМР-спектрам (область 2,5-4,5 м.д.), составляет q 0,35n.

Данные элементного анализа:
Найдено, С 46,91; Н 7,75; N 16,30. С_6,7Н_13,05О_1,35N₂Br_0,5
Вычислено, С 47,00; Н 7,63; N 16,37.

Пример 2. C-2. Поли-1,4-этиленпиперазин (М_w225000, n 2000) в количестве 5 г растворяют в 250 мл 1%-ного раствора уксусной кислоты. К раствору при охлаждении (2-4^oС) и перемешивании добавляют 6,0 мл 30%-ного раствора перекиси водорода. Окисление проводят в течение 28 ч, после чего проводят ультрафильтрационную очистку и лиофильное высушивание. Полученный N-оксид поли-1,4-этиленпиперазина растворяют в 125 мл метилового спирта и добавляют 30 мл этиленбромгидрина. Реакцию алкилирования N-оксида проводят при 30^oС в течение 24 ч. Растворитель упаривают в вакууме, остаток растворяют в воде, диализуют против воды, лиофильно высушивают. Получают соединение формулы

с выходом 93% степень окисления, определяемая, как в примере 1, составляет z 0,1n; степень алкилирования, определяемая по ИК- и ПМР-спектрам, составляет q 0,9n.

Данные элементного анализа:
Найдено, С 41,30; Н 7,40; N 12,31. С_7,8Н_16,5ОN₂Br_0,9
Вычислено, С 41,30; Н 7,30; N 16,38.

Пример 3. C-3. Поли-1,4-этиленпиперазин (М_w= 110000, n 1000) в количестве 1 г растворяют в 50 мл 1%-ной уксусной кислоты. К раствору при охлаждении (2-4^oС) и перемешивании добавляют 3,0 мл 30%-ного раствора перекиси водорода. Окисление проводят в течение 56 ч, после чего проводят ультрафильтрационную очистку и лиофильное высушивание. Полученный N-оксид поли-1,4-этиленпиперазина растворяют в 25 мл метилового спирта и добавляют 4,2 мл этилбромида. Реакцию алкилирования проводят при 20^oС в течение 6 ч. Растворитель упаривают в вакууме, проводят ультрафильтрационную очистку водного раствора, затем лиофилизуют.

Получают соединение формулы

с выходом 90% Степень окисления и степень алкилирования определяют как описано в примере 1: z 0,8 n q 0,2 n.

Данные элементного анализа:
Найдено, С 51,21; Н 8,71; N 18,63. С_6,4Н₁₃N₂OBr_0,2
Вычислено, С 51,27; Н 8,68; N 18,69.

В табл. 1 приведены другие примеры получения водорастворимых производных поли-1,4-этиленпиперазина с указанием их структуры, физико-химической характеристики, условий проведения реакции (соединения 4-36).

Пример 4. Изучение иммуномодулирующей активности производных поли-1,4-этиленпиперазина и острой токсичности.

Иммуномодулирующую активность предлагаемых соединений оценивали по числу антителообразующих клеток (АОК), формирующихся на 4-7 сутки в селезенке мышей, иммунизированных эритроцитами барана, или белковыми антигенами (В-суб'единица холерного токсина, токсин сибирской язвы и др.) с одновременной инъекцией высокомолекулярного соединения.

Антителообразующие клетки селезенки определяли методом локального гемолиза в агаре (метод Ерне). Титры антител на введение специфических белковых антигенов оценивали методом иммуноферментного анализа. Эффективность адъювантного действия определяли как отношение уровня АОК при совместном введении антигенов и полимеров к уровню АОК контрольных животных.

Дозы препаратов варьировали в пределах 1-1000 мкг/мышь при внутрибрюшинном и подкожном введении препаратов.

Острую токсичность полученных соединений определяли на мышах, крысах и морских свинках. Соединения вводили подкожно или внутрибрюшинно, одно- или двукратно в виде 5-8%-ных растворов. ЛД50 определяли по принятой методике. В каждой группе было 10-20 животных.

Результаты испытаний представлены в табл. 2.

Пример 5. Изучение противовирусной активности производных поли-1,4-этиленпиперазина на птицефабрике на цыплятах-бройлерах.

Изучали влияние иммуностимулятора сополимера N-окиси этиленпиперазина и N-гидроксипропилэтиленпиперазиний бромида с ММ 120000 на формирование иммунитета против вируса болезни Ньюкасла, повышение сохранности и прироста живой массы тела цыплят-бройлеров.

Цыплят содержали в клеточной батарее типа КБУ-3. Обработке подвергнуто 100000 цыплят-бройлеров.

Цыплят иммунизировали аэрозольно. Специфические антитела определяли в сыворотке крови по реакции задержки гемагглютинации. За птицей велось постоянное наблюдение. взвешивание, учет сохранности. Проводился серологический контроль напряженности иммунитета.

Изучение напряженности иммунитета к вирусу болезни Ньюкасла показало, что на 21 день после введения препарата титр антигемагглютинина превышал в 4 раза титр контрольной группы. В группах, обработанных препаратом, отмечено уменьшение падежа цыплят на 65% и увеличение массы тела на 30% по сравнению с контролем.

Аналогичные результаты были получены при испытаниях производных поли-1,4-этиленпиперазина: соединения 4-8, 11-17, 21-27, 29-34 (табл.1).

Пример 6. Изучение антибактериальной активности производных поли-1,4-этиленпиперазина (соединения 3,4,10-12, 18-22 в табл.1).

Антибактериальная активность соединений изучалась в опытах по определению неспецифической резистентности мышей к заражению Streptococcus pneumoniae и Salmonella typhimu- rium.

Использовались мыши (СВАхС57l/6)F. Препараты вводили внутрибрюшинно и подкожно в диапазоне доз 0,05-50 мкг/кг за 96, 72, 48 ч до заражения. Гибель животных учитывали в течение 21 дня после заражения. Этот метод позволяет оценить выживаемость и состояние естественного иммунитета.

В табл. 3 представлены результаты проведенных экспериментов.

Аналогичные результаты были получены при испытании производных поли-1,4-этиленпиперазина (соединения 3,4,10-12, 18-22 в табл.1).

Из представленных в табл. 3 данных видно, что производные поли-1,4-этиленпиперазина обладают выраженным протективным эффектом по отношению к развивающейся инфекции, что обусловлено, по-видимому, активацией переваривающей способности перитонеальных макрофагов мышей.

Пример 7. Изучение антибактериальной активности производных поли-1,4-этиленпиперазина на птицефабрике на цыплятах-бройлерах.

Изучали влияние сополимера N-окиси этиленпиперазина и N-этил-этиленпиперазиний хлорида с ММ 200000 на защиту цыплят-бройлеров от смешанной инфекции (пуллороза и колибактериоза).

Лечебно-профилактическую обработку препаратом цыплят против указанных инфекций осуществляли аэрозольно. Обработке подвергнуто 200000 цыплят двукратно в дозе 3-5 мг/кг. Интервал между введениями 7 сут. Получены следующие результаты.

При клиническом осмотре цыплят в партиях, подвергшихся обработке иммуностимулятором, симптомы заболевания пуллорозом и колибактериозом не обнаружены. При патологоанатомическом вскрытии убитых с диагностической целью цыплят патогномоничные изменения установлены у 5,2% в партиях, обработанных препаратом. В контрольных партиях бройлеров у 28% Сохранность составила соответственно 95 и 60% Среднесуточные привесы цыплят, обработанных стимулятором, составили 30 г, контрольных 17 г.

Аналогичные результаты были получены при испытаниях производных поли-1,4-этиленпиперазина: соединения 1-5,9-12, 16-18,27-30,34-36.

Наряду с повышением сохранности и продуктивности поголовья, резко сократилось применение антибиотиков, что позволило получить экологически чистую продукцию птицеводства.

Таким образом, впервые синтезирован новый класс физиологически активных высокомолекулярных соединений производных поли-1,4-этиленпиперазина, обладающих иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями.

Применение иммуномодуляторов только в ветеринарии может дать существенный экономический эффект, поскольку данным международных служб здоровья животных вирусные и бактериальные инфекции снижают продуктивность животных на 20-25% что приводит к многомиллиардному ущербу.

Формула изобретения

Производные поли-1,4-этиленпиперазина общей формулы

где R₁-алкил C₁-C₁₆, -(CH₂)_1-16OH, -(CH₂)_1-5COR₂ где R₂
-OH, -OCH₃, O(CH₂)_1-3, CH₃, NHNH₂, -NH(CH₂)_1-10NH₂,
n 310 2000;
q 0,2 0,9;
Z 0,1 0,8;
Hal Cl, Br, I,
обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5