Способ получения стабильных соматотропинов, стабильные соматотропины и композиция стабильного соматотропина

 

Использование: в сельском хозяйстве. Сущность изобретения: способ получения стабильных соматотропинов путем селективного восстановления дисульфитной связи малой петли соматотропина органическими соединениями: R-SH, R-алкил (С1-C6) необязательно защищенный гидрокси и меркаптогруппой, и последующего взаимодействия в полученном соединении двух меркаптогрупп из дисульфидной связи малой петли соматотропина с карбамоилалкилгалогенидом C1-C6, стабильные соматотропины, фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала модифицированный стабильный соматотропин в эффективном количестве. 3 с. и 9 з.п. ф-лы, 4 табл.

Это изобретение относится в основном к соматотропинам, и в частности к стабильному и биоактивному соматотропину, а также к способам получения стабильных и биоактивных соматотропинов.

Известный уровень техники Выделение, очистка и свойства соматотропинов известны в данной области техники. Соматотропин иногда называемый гормоном роста и получают из гипофиза на протяжении жизни животного. Известно, что соматотропин ускоряет рост скелета, фиксацию азота, синтез белка и воздействует на метаболизм глюкозы и липидов. Таким образом соматотропин известен как анаболический агент.

Соматотропин может быть выделен путем иссечения ткани гипофиза. Смотри, например, Li, F.Biol.Chem, 211, 55 (1954). Соматотропин может быть также получен путем генной инженерии из микроорганизмов, содержащих рекомбинантную ДНК, которая определяет получение (производство) соматотропина. Смотри, например, Seeburg, et al. Nature, 276, 795-798 (1978); Seeburg et al. Nature, 270, 486-494 (1978); Martial Science, 205, 602-607 (1979); Seeburg, et al. DNA, 2, 37-45 (1983).

Соматотропины отдельных видов изучены и охарактеризованы. Известно, например, что бычий соматотропин представляет собой полипептид, синтезированный внутри и выделенный из передней доли гипофиза. О нуклеотидной кодированной последовательности и последовательности аминокислот природного бычьего соматотропина сообщалось, например, Miller et al. S.Biol.Chem, 255, 7521-24 (1980); Wallis, FEBS Lett, 35, 11-14 (1973). Бычий соматотропин представляет собой белок из 191 аминокислот и, по-видимому, синтезируется первоначально в виде бычьего пресоматотропина из 217 аминокислот; при этом сигнальную последовательность из 26 аминокислот удаляют от N-концевого положения во время синтеза и выделения, например, Lingapa et al. Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 74, 2432-36 (1977).

Получение бычьего соматотропина хорошо известно в данной области. Например, бычий соматотропин экстрагируют из бычьих желез крупного рогатого скота или получают по технологии рекомбинантной ДНК в соответствующих хозяевах, например, Miller et al. F.Biol. Chem, 255, 7521-24 (1980). Пат. США N 4443539, Frazur et al. раскрывает способ получения бычьего соматотропина путем использования методологии рекомбинантной ДНК, помещая структурный ген бычьего соматотропина в дрожжевые клетки. Пат. США N 4371462 раскрывает способ очистки передних гипофизных пептидов. Заявка на Евр. Пат. N 83304574.3, поданная 8 августа 1983, с номером публикации 103 395; N 82304880.6, поданная 16 сентября 1982, с номером публикации 075 444; N 81303824.7, поданная 21 августа 1981, с номером публикации 047 600; заявка на Пат. Великобритании N 2073245 А раскрывают способы продуцирования бычьего соматотропина с высокими выходами. Штаммы E.Coli, которые продуцируют бычий соматотропин, имеются в American Type Culture Collection под регистрируемыми номерами АТСС 31826, 31840, 31841, 31842 и 31843.

Аналогично получение природного и рекомбинантного свиного и человеческого соматотропина хорошо известно. Например, в дополнение к вышеупомянутым публикациям, которые раскрывают способы получения свиного и человеческого соматотропина, Пат. США N 4604359 раскрывает способы микробиологической экспрессии человеческого соматотропина; Пат. США N 4332717 раскрывает способы очистки человеческого соматотропина; заявка на Евр. Пат. N 83305717.7, поданная 26 сентября 1983, с номером публикации 104 920, раскрывают способы продуцирования рекомбинантного свиного соматотропина с высокими выходами. Пат. США N 4604359 раскрывает способы синтеза биоактивного человеческого соматотропина, включая способы синтеза биоактивного тетра-S-карбамидометил производного. Многие такие публикации и способы для различных соматотропинов хорошо известны специалисту в данной области, например, Пат. США N 4645755 раскрывает способ продуцирования рыбьего соматотропина.

Хотя способы продуцирования соматотропинов хорошо известны, способы хранения соматотропина в течение длительного периода между получением соматотропина и его использованием развиты плохо. Соматотропины имеют тенденцию образовывать бионеактивные димеры, олигомеры и нерастворимые агрегаты во время хранения. Эти бионеактивные формы соматотропина понижают количество соматотропина, пригодного для использования, и вызывают проблемы во время приема, в частности, когда нерастворимые агрегаты образуют осадки в растворах соматотропина.

Поэтому существует потребность в способах получения стабильного и биоактивного соматотропина, который не будет образовывать бионеактивные димеры, олигомеры и агрегаты во время хранения.

Сущность изобретения Поэтому целью настоящего изобретения является разработка стабильного и биоактивного соматотропина, который не должен образовывать бионеактивные димеры, олигомеры и агрегаты в течение хранения.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа получения стабильного и биоактивного соматотропина, который не должен образовывать бионеактивные димеры, олигомеры и агрегаты во время хранения.

Следующей целью настоящего изобретения является разработка композиции, содержащей стабильный и биоактивный соматотропин, который не будет образовывать бионеактивные димеры, олигомеры и агрегаты во время хранения. Композиция должна быть пригодной в течение длительного хранения, легко приготовляться в дозах и легко применяться.

Эти и другие цели достигаются путем использования способа, который включает селективное восстановление дисульфидных связей в малой петле соматотропина, чтобы получить меркапто группы, и замещение меркапто групп в малой петле. Замещение меркапто групп в малой петле препятствует меркапто группам образовывать внутримолекулярные дисульфидные связи, которые вызывают образование димеров соматотропина, олигомеров и агрегатов и инактивируют соматотропин. Соматотропин, полученный с использованием этого способа, стабилен в течение длительного срока хранения и имеет биологическую активность, равную или большую, чем биологическая активность незамещенного соматотропина. Замещенный соматотропин выделяют и, при необходимости, подвергают дальнейшей обработке, чтобы получить форму соматотропина, пригодную для длительного хранения и последующего введения животному.

Другие цели, преимущества и новые признаки настоящего изобретения должны стать очевидными из последующего подробного описания изобретения.

Подробное описание изобретения Соматотропины, выделенные от различных видов животных, имеют высокую степень гомологии последовательности (около 96 процентов); однако соматотропины от различных видов все же отличаются количеством и последовательностью аминокислот, присутствующих в цепи соматотропина. Например, природный человеческий соматотропин (nhST) представляет собой полипептид, состоящий из 188 аминокислот. Молекула соматотропина имеет две дисульфидные связи; одна между 179 и 186 аминокислотами, и одна между 68 и 162 аминокислотами. Эти дисульфидные связи образуют "малую петлю" из шести аминокислот и "большую петлю" из 94 аминокислот соответственно. Сложная последовательность и структура человеческого соматотропина, демонстрирующие "малую петлю" и "большую петлю" иллюстрируются в Пат. США N 3853832, включенном здесь ссылкой.

Аналогично природный свиной соматотропин (npST) представляет собой полипептид из 190 аминокислот, имеющий две дисульфидные связи, образующие характерные "малую петлю" и "большую петлю", одна между 180 и 188 аминокислотами и одна между 163 и 52 аминокислотами соответственно. Также природный бычий соматотропин (nbST) представляет собой полипептид из 191 аминокислот, имеющий две дисульфидные связи, образующие характерные "малую петлю" и "большую петлю", одна между 181 и 189 аминокислотами и одна между 53 и 164 аминокислотами соответственно. Многочисленные синтетические и рекомбинантные соматотропины имеют различное число и различные последовательности аминокислот. Однако биоактивные соматотропины имеют третичную конформацию с характерными малой петлей и большой петлей.

Термин "соматотропин", используемый здесь, заключает в себе любые соматотропины, имеющие "малую петлю" и включает не только "природные соматотропины", но также и "синтетические соматотропины" и "рекомбинантные соматотропины", имеющие аминокислотную последовательность природного соматотропина, аминокислотные последовательности, в основном сходные с ней, или форму ее укороченной последовательности, и их аналоги и мутеины, имеющие замещенные, изъятые, удлиненные, восстановленные или другим способом модифицированные последовательности. В частности, используемый здесь соматотропин включает рекомбинантный белок той же самой последовательности, как и природный соматотропин, но имеющий аминокислоты, изъятые из аминного и/или карбоксильного конца. Примеры таких белков включают (но не ограничиваются) дельта-7 рекомбинантный свиной соматотропин, дельта-4 рекомбинантный бычий соматотропин, природные соматотропины, имеющие 7 и 4 остатков, изъятых из аминного конца соответственно, и тому подобное.

Термин "соматотропин с замещенной малой петлей", используемый здесь, описывает "соматотропины", которые имеют "большую петлю", образованную дисульфидной связью, но не имеют "малую петлю"; причем меркапто группы "малой петли" замещают, чтобы предотвратить образование дисульфидных связей "малой петли". "Соматотропин с замещенной "малой петлей" идентичен в аминокислотной последовательности незамещенному "соматотропину за исключением присутствия замещающих групп на меркапто группах цистеина, которые обычно образуют дисульфидную связь, ответственную за "малую петлю".

Согласно настоящему изобретению способ предусматривает получение стабильного и биоактивного соматотропина. Способ включает селективное восстановление дисульфидных связей "малой петли" соматотропина с получением меркапто групп и замещение меркапто групп "малой петли". Замещение меркапто групп "малой петли" препятствует меркапто группам образовывать внутримолекулярные дисульфидные связи, которые являются причиной образования димеров соматотропина, олигомеров и агрегатов и инактивируют соматотропин. Соматотропин, полученный с использованием этого способа, стабилен при длительном хранении и имеет биоактивность, равную или большую, чем биоактивность незамещенного соматотропина. Замещенный соматотропин выделяют и, при необходимости, подвергают дальнейшей обработке для того, чтобы получить форму соматотропина, пригодную для длительного срока хранения и последующего введения животному.

Используемый здесь соматотропин может быть получен из любого подходящего источника. Способы получения, выделения и очистки природных, синтетических и рекомбинантных соматотропинов хорошо известны в данной области. Соматотропин из любого вида животного может быть использован здесь; эти соматотропины включают (но не ограничиваются) человеческий, бычий, свиной, собачий, кошачий, лошадиный, птичий, рыбий и овечий соматотропины.

Дисульфидную связь малой петли соматотропина селективно восстанавливают взаимодействием соматотропина соответствующим восстанавливающим агентом в условиях, при которых восстанавливаются дисульфидные связи "малой петли", но не восстанавливаются дисульфидные связи "большой петли". Любые пригодные восстанавливающие агенты, которые взаимодействуют с меркапто группами белка, могу быть использованы. Обычно восстанавливающий агент представляет собой любое органическое меркапто соединение, представленное формулой R-SH, где R есть органический углеводородный радикал, имеющий от около 1-30 углеродных атомов. Предпочтительные восстанавливающие агенты включают (но не ограничиваются) 2-меркаптоэтанол и дитиотреит.

Обычно раствор, содержащий от около 1-20 миллиграммов на миллилитр (мг/мл) соматотропина, смешивают с достаточным количеством восстанавливающего агента, чтобы довести концентрацию восстанавливающего агента до около 15-300 миллимоля (мМ), pH раствора доводят до около 6-10 и восстанавливающий агент подвергают взаимодействию с соматотропином в течение около 0,5-3 часов при температуре около 15-50oС. Избыток восстанавливающего агента удаляют любым подходящим способом, предпочтительно диализом, и образующийся восстановленный соматотропин с "малой петлей", содержащий две меркапто группы в "малой петле" подвергают замещению, как описано ниже.

В одном варианте осуществления изобретения, подходящее количество соматотропина растворяют в карбонатном буфере (СВ-) (CB- содержит 25 мМ NaCO3, 18 мМ Na2CO3, pH около 9,5), чтобы получить около 5 мг/мл раствора. Добавляют дитиотреит в количестве, достаточном для получения 20 мМ раствора, доводят pH до около 8 и осуществляют восстановление в темноте в течение около 1 часа при около 37oС.

В другом варианте осуществления изобретения, СВ- раствор (pH около 9,8) соматотропина с его концентрацией около 5 мг/мл, содержащий 2-меркаптоэтанол при концентрации около 50 мМ, подвергают взаимодействию в темноте в течение около 1 часа при около 20-37oС. Избыток восстанавливающего агента удаляют и соматотропин подвергают замещению, чтобы получить стабильный и биоактивный соматотропин.

Меркапто группы "малой петли", которые являются результатом восстановления, замещают путем взаимодействия восстановленного соматотропина с соответствующим замещающим агентом. Замещающим агентом, используемым для замещения восстановленных меркапто групп "малой петли", может быть любой пригодный замещающий агент, который взаимодействует с меркапто группами. Специалисту в данной области известны многие классы замещающих групп, которые реагируют с меркапто группами. Примеры таких классов включают, но не ограничиваются, замещающие агенты, такие как этиленимин, акрилонитрил, N-этил имид малеиновой кислоты, 3-бромпропионовая кислота, 3-бромпропионамид, иодацетамид, иодуксусная кислота, N-(иодэтил)-трифтор-асетамид, 4-винилпиридин, метил метантиосульфонат. Наиболее предпочтительно, когда замещающим агентом является алкилирующий агент, имеющий формулу R-X, где X есть галоид, предпочтительно S, BR или Cl, и R является алкильной цепью, разветвленной или линейной, имеющей около 1-30 углеродных атомов, предпочтительно около 1-12 углеродных атомов.

Обычно 1-200 мг/мл раствор восстановленного соматотропина с "малой петлей" смешивают с подходящим замещающим агентом до доведения концентрации замещающего агента до около 50-800 миллимолярной (мМ), pH раствора доводят до около 6-10 и замещающий агент подвергают взаимодействию с соматотропином в течение около 0,5-3 часов при температуре около 15-50oС. Избыток замещающего агента удаляют любым подходящим способом, предпочтительно диализом, и образующийся соматотропин с замещенной "малой петлей", содержащий две замещенные меркапто группы, подвергают обработке, чтобы получить соматотропин в форме, пригодной для длительного срока хранения и введения животному, обычно в лиофилизованной форме.

В предпочтительном варианте осуществления, СВ- раствор с содержанием около 5 мг/мл соматотропина, восстановленного в малой петле, содержащий иодацетамид при концентрации около 200 мМ при pH около 8,5-9 подвергают взаимодействию в темноте в течение около 1 часа при около 20-37oС. Избыток иодацетамида удаляют диализом против 2% СВ-. Образующийся замещенный соматотропин в дальнейшем очищают обычным способом, если необходимо, и лиофилизуют с получением соматотропина, который является стабильным в течение длительного срока хранения и имеет биоактивность, равную или большую, чем биоактивность незамещенного соматотропина.

В соответствии с настоящим изобретением обеспечивается соматотропин с замещенной малой петлей, который является стабильным в течение длительного срока хранения и имеет биоактивность, равную или большую, чем биоактивность незамещенного соматотропина. Замещенный соматотропин отличается от незамещенного соматотропина тем, что меркапто группы на цистеинах, которые образуют дисульфидную связь "малой петли", замещены, а меркапто группы на цистеинах, которые обычно образуют дисульфидную связь "большой петли", не замещены. Поэтому соматотропин с "малой петлей" имеет "большую петлю", типичную для незамещенного соматотропина, но не имеет "малой петли", поскольку замещенные меркапто группы не могут образовывать дисульфидные связи.

Соматотропин с замещенной "малой петлей" неожиданно имеет биоактивность, равную или большую, чем биоактивность незамещенного соматотропина. Кроме того, соматотропин с "малой петлей" имеет дополнительное преимущество в том, что он не может образовывать внутримолекулярные дисульфидные связи между меркапто группами "малой петли", которые являются причиной образования димеров соматотропина, олигомеров и агрегатов и инактивации соматотропина. Поэтому соматотропин с замещенной малой петлей более стабилен в течение длительного срока хранения.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается разработка композиции, включающей смесь соматотропина с замещенной малой петлей в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями, такими как различные разбавители и связующие. Носитель может быть любым биосовместимым и носителем, совместимым с соматотропином с замещенной малой петлей, предпочтительно фосфат буферный солевой, Трис-HCl, аргинин, гистидин, и тому подобное. В общем, любой биосовместимый раствор или носитель с pH между 6 и 11 должен функционировать в настоящем изобретении в качестве носителя для соматотропина с замещенной "малой петлей". Соматотропин с замещенной "малой петлей" смешивают с фармацевтически приемлемыми носителями с образованием композиции, которая является стабильной в течение длительного срока хранения и позволяет легко препарироваться в дозах и легко приниматься. Композиция предпочтительно является лиофилизованной формой соматотропина с замещенной "малой петлей" и носителя.

Настоящее изобретение, в основном, описано, следующие примеры иллюстрируют конкретные варианты осуществления изобретения и демонтируют использование и преимущества его. Рекомбинантный свиной соматотропин (RpST), используемый в примерах ниже, получают, используя E.coli микроорганизм, депонированный в American Type Culture Collection, Rockville MD, с регистрационным N 53031. Полное описание микроорганизма представлено в Пат. США N 4656255, включенном здесь ссылкой. Понятно, что данные примеры даны с целью иллюстрации, и подразумевается, что они не ограничивают описание изобретения или формулу изобретения каким-либо способом.

Пример 1 Пять (5) мг/мл растворы рекомбинантного свиного соматотропина (RpST) в карбонатном буфере (25 мМ NaHCO3, 18 мМ Na2CO3, pH 9,8) восстанавливают в течение 1 часа при комнатной температуре в присутствии 0, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и 100 мМ 2-меркаптоэтанола (МЭ). Вслед за восстановлением каждый образец подвергают взаимодействию при комнатной температуре в темноте в течение 1 часа с 200 мМ иодацетамида (ИА), чтобы заместить меркапто группы, полученные из восстановительных цистинов. Образцы анализируют методом SDS-PAGE.

Анализ SDS-PAGE геля показывает, что полное восстановление дисульфидных связей "малой петли" достигается при инкубации с 50 мМ МЭ, в то время как дисульфидные связи "большой петли" остаются незатронутыми. Поскольку "малая петля" восстанавливается, имеется небольшое (1-2 мм) уменьшение в подвижности RpST, обусловленное "растяжением" C-концевой части петли. Такие изменения подвижности для сшитых белков по отношению к несшитым белкам по данным SDS-PAGE ранее сообщались Griffith, Biochem.S. 126, 553-560 (1972). Когда добавляют больше восстановителя, большая петля также восстанавливается, приводя к даже более сильному уменьшению подвижности (10-12 мм). Материал с восстановленной большой петлей существенно нерастворим, так как, когда материал, восстановленный в >30 мМ МЭ, центрифугируют, только материал с незатронутой "большой петлей" остается в супернатанте. Эти результаты показывают, что приблизительно 40-50 мМ МЭ дает оптимальный выход восстановленного в "малой петле", карбамидометилированного RpST.

Пример 2 Селективное восстановление дисульфидных связей малой петли дитиотреитом Пять (5) мг/мл растворы рекомбинантного свиного соматотропита (RpST) в карбонатном буфере (25 мМ NaHCO3, 18 мМ Na2CO3, pH 9,25) восстанавливают в течение 1 часа в присутствии 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 и 100 мМ дитиотреита (ДТТ) в атмосфере азота при 37oС. После восстановления каждый образец подвергают взаимодействию при 37oС между pH 8,5-9,0 в темноте в течение 1 часа с 150 мМ ИА, чтобы заместить меркапто группы, полученные из восстановленных цистинов. Избыточный/непрореагировавший ИА гасят небольшим молярным избытком ДТТ над ИА и диализуют в течение ночи против 0,1 М NH4HCO3, pH 7,8-8,2. Диализованный RpST анализируют пептидным-картированием после 2 часового гидролиза с ТРСК-обработанным трипсином. Результаты показаны в Таблице 1.

В таблице использованы следующие сокращения: время удержания (ВУ) каждой HPL C дано в минутах; /Т-Х/ каждую зону анализируют и обозначают как трипсиновый пептид согласно положению, начиная от амино-концевой части последовательности; /Т-Х+Т-У/ два трипсиновых пептида связаны ковалентно дисульфидным мостиком;
в немодифицированном pST "малая петля" состоит из двух трипсиновых пептидов Т-23 и Т-25, которые ковалентно связаны дисульфидной связью, аналогично в большой петле связаны Т-5 и Т-18;
x T-1 зона также элюируется в этом положении;
xx восстановленные цистеины замещают ИА;
разделение 100 ug трипсинового продукта варки RpST достигается на Аквапоре С-8 колонке RP-HPL C (Brown-Lee), которую предварительно уравновешивают 0,1% трифторуксусной кислотой (ТФК) и элюируют при 0,5 мл/мин 50% 2-пропанолом в 0,1% ТФК.

Согласно Таблице 1 результаты показывают, что полное восстановление дисульфидных связей "малой петли" достигается инкубацией с 20 мМ ДТТ, в то время как дисульфидные связи "большой петли2 остаются незатронутыми. Это далее подтверждается, как показано в Примере 3.

Пример 3
Характеристика соматотропина с замещенной "малой петлей"
Незамещенный RpST и RpST с замещенной малой петлей, полученный согласно способу Примера 1, варят в течение двух часов, используя трипсин. Продукты варки с трипсином анализируют, используя жидкостную хроматографию под высоким давлением с обращенной фазой (RP-HPL C). Результаты показывают зоны HPL C с временами удерживания 40,4 и 98 минут, соответствующие "малой петле" и "большой петле", соответственно. Однако после селективного восстановления и карбамидометилирования "малой петли", HPL C зона с временем удерживания 40,4 минут полностью исчезает с сопутствующим появлением двух зон с временами удерживания 3,6 и 50,9 минут. Анализы новых HPL C зон с помощью автоматизированного разложения по Edman подтверждают, что модифицированный RpST образец, содержит RpST с замещенной "малой петлей", как предсказано. Данные для аминокислотной последовательности для незамещенных и замещенных в малой петле трипсиновых пептидов представлены в Таблице 2. Дополнительное доказательство для карбамидометилирования двух цистеинов модифицированного RpST получено с помощью аминокислотного анализа. Значение 1,6 карбоксиметил цистеинов (СМС) вместо 2 для теоретического замещения в одной петле получено. Эти результаты представлены в Таблице 3.

Пример 4
Биоактивность замещенного соматотропина
Биоактивность незамещенного RpST и RpST, замещенного в малой петле, полученного согласно способу Примера 1, определяют с помощью проб по связыванию pST, используя мембраны печени беременного кролика и RpST, меченый 1251. Модифицированная версия пробы, раскрытая Tsushima et al. Radioreceptor Assay for Growth Hormone, F. Clin. Endocrinol. Metab. 37:334-337 (1973), использована: Образец RpST инкубируют при 30oС в течение 3,5 часов с 1251-RpST с числом распадов 16000 в минуту. Область концентрации, используемой для кривой замещения RpST стандарта и RpST, замещенного в малой петле, находится между 0,38-200 нг/мл. Дополнительная информация для пробы по связыванию pST описана Tsushima et al. Radioreceptor Assay for Growth Hormone, F. Clin. Endocrinol. Metab. 37:334-337 (1973). Результаты показывают, что рассчитанная концентрация иода при 50% (IС-50) pST, карбамидометилированного в малой петле, составляла 1,24 нг/0,5 мл эквивалента связывания, тогда как незамещенный и диализованный образцы давали значение 3,0 нг/мл и 2,9 нг/0,5 мл соответственно. Стандарт дает IС50 2,35 нг/0,5 мл. Из этих данных, как рассчитано, процент 181% в противоположность значению около 75% для незамещенного соматотропина.

Пример 5
Биоактивность замещенного соматотропина
Биоактивность незамещенного RpST и RpST, замещенного в малой петле, полученного согласно способу Примера 1, определяют, используя связывающую активность в мембранах печени свиньи согласно модификации способа Haro et al. Homologous Somatotropin Radioreceptor Assay Utilizing Recombinant Bovine Growth Hormone, Mol. Cell Endocrinol, 38:109-116 (1985). Результаты показывают, что рассчитанное IС-50 pST, карбамидометилированного в малой петле, составляет 1,29 нг/0,5 мл по сравнению 1,61 нг/0,5 мл для незамещенного pST и RpST стандарта. Результаты показывают, что замещенный RpST имеет 125% активность по сравнению с 100% для немодифицированного (незамещенного) RpST. Эти результаты показывают неожиданно высокое связывание, что соматотропины, полученные согласно настоящему изобретению, не только более стабильны, но и более биологически активны, чем их немодифицированные предшественники соматотропинов.

Пример 6
Биоактивность и биопотенция замещенного соматотропина
Относительная биоактивность и биопотенция незамещенного RpST и RpST, замещенного в малой петле, полученного по способу Примера 1, определяют путем измерения прироста веса тела у гипофизэктомизированных (гипокс) крыс. Четыре (4) группы, по 10 гипокс крыс в группе, получали 24 ug pST/день стандартный pST, диализованный Zn-RpST, Zn-RpST, замещенный в "малой петле", или незамещенный Zn-RpST в течение 9 дней. Крыс контролировали ежедневно и приросты веса их тела записывали на протяжении периода 10 дней. Прирост веса измеряли и рассчитывали относительную биоактивность в процентах, как процент от стандарта. Результаты показаны в Таблице 4.

Согласно Таблице 4, данные показывают, что замещенный RpST дает значение прироста веса в процентах 13,5% по сравнению с 14,4% для незамещенного RpST. Кроме того, данные демонстрируют, что карбокси-концевая часть "малой петли" не требуется для соматотропина, чтобы ускорять рост.

Пример 7
Стабильность раствора замещенного соматотропина
Растворы 8 мг/мл незамещенного RpST и RpST, замещенного в малой петле (полученного с ИА согласно Примеру 1), содержащие 0,5% азида натрия, приготавливают либо в 46 мМ карбонатном буфере (pH 9,8), либо в фосфатном буфере (pH 7,4). Аликвотные пробы по 1,25 мл инкубируют в микроцентрифужных трубках Eppendorf в течение 0,6, 4,6, 8,8, 22 и 120 дней при 37oС.

В конце каждого инкубационного периода аликвотные пробы удаляют и анализируют на RpST мономер, используя Superose-12 Size вытеснительную хроматографию с подвижной фазой 46 мМ карбонатного буфера (pH 9,8). Относительное количество мономера, димера и образуемых агрегатов с более высокой молекулярной массой показывает, что имеется более высокое процентное содержание мономера, выделяемого при восстановлении и замещении малой петли.

Пример 8
Стабильность замещенного соматотропина во влажном состоянии
Незамещенный RpST и RpST с замещенной "малой петлей" (полученный с ИА согласно Примеру 1), содержащий 5 мг/мл, диализуют против 0,46 мМ карбонатного буфера и лиофилизуют, получая сухие RpST образцы для дальнейшего испытания. Пять мг сухих замещенного в малой петле и незамещенного RpST увлажняют 0,01 мл 50 мМ Трис-НСl, pH 7,4, 0,05% азида натрия или 46 мМ карбонатного буфера, pH 9,8, 0,05% азида натрия. Пасты подвергают инкубации в течение 14 дней при 37oС. По окончании этого времени, RpST разбавляют до конечной концентрации около 1,8 мг/мл в 46 мМ карбонатном буфере, pН 9,8, гомогенизируют в ультразвуковом гомогенизаторе Branisonic 220 в течение нескольких минут и центрифугируют при 15000 Х G в течение 5 минут. Супернатант анализируют на содержание мономера методом хроматографии, описанным в Примере 6. Результаты показывают, что выделение RpST мономера было много больше для RpST, замещенного в "малой петле", независимо от pH при увлажнении, по сравнению с незамещенным RpST.

Очевидно возможны многие модификации и вариации настоящего изобретения в свете вышеупомянутых указаний. Поэтому следует понимать, что не выходя за рамки объема нижеследующей формулы изобретения изобретение может быть осуществлено иначе, чем, в частности, описано.


Формула изобретения

1. Способ получения стабильных соматотропинов, отличающийся тем, что включает стадии селективного восстановления дисульфидной связи малой петли соматотропина органическим меркаптосоединением общей формулы R-SH для получения двух меркаптогрупп, где R представляет углеводородную группу, имеющую 1 6 атомов углерода, необязательно замещенную гидрокси- или меркаптогруппой, взаимодействия в полученном соединении двух меркаптогрупп из дисульфидной связи малой петли соматотропина с карбамоилалкилгалогенидом, имеющим 1 7 атомов углерода.

2. Способ по п.1, в котором полученным соматотропином является свиной рекомбинантный соматотропин.

3. Способ по п.1, в котором дисульфидную связь малой петли соматотропина восстанавливают дитиотреитолом или 2-меркаптоэтанолом.

4. Способ по п.1, в котором меркаптогруппы из дисульфидной связи малой петли соматотропина подвергают взаимодействию с йодацетамидом.

5. Стабильные соматотропины, полученные селективным восстановлением дисульфидной связи малой петли соматотропина органическими меркаптосоединением общей формулы K-SH для получения двух меркаптогрупп, где R представляет углеводородную группу, имеющую 1 6 атомов углерода необязательно замещенную гидрокси- или меркаптогруппой, и последующим взаимодействием в полученном соединении двух меркаптогрупп из дисульфидной связи малой петли соматотропина с карбамоилалкилгалогенидом, имеющим 1 7 атомов углерода.

6. Соматотропин по п. 5, где соматотропин представлен свиным рекомбинантным соматотропином.

7. Композиция стабильного соматотропина, содержащая соматотропин и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве соматотропина она содержит модифицированный соматотропин по п.5 в эффективном количестве.

8. Композиция по п.7, где соматотропин представляет собой свиной рекомбинантный соматотропин.

9. Композиция по п.7, где сульфгидрильные группы малой петли соматотропина модифицированы с помощью йодацетамида.

10. Соматотропин по п. 5, отличающийся тем, что меркаптогруппы из дисудьфидной связи малой петли соматотропина подвергают взаимодействию с йодацетамидом.

11. Соматотропин по п. 5, отличающийся тем, что дисульфидная связь малой петли соматотропина восстановлена дитиотреитолом или 2-меркаптоэтанолом.

12. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что дисудьфидная связь малой петли соматотропина восстановлена дитиотреитолом иди 2-меркаптоэтанолом.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:
Мэллинкродт Ветеринари, Инк. (US)

Извещение опубликовано: 27.10.2004        БИ: 30/2004

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 08.09.2007

Извещение опубликовано: 20.07.2010        БИ: 20/2010




 

Похожие патенты:

Изобретение относится к сельскому хозяйству , а именно к ветеринарии

Изобретение относится к биологическим активным полипептидным композициям, которые могут быть введены парентерально животным, и которые характеризуются увеличенным периодом выделения, а также к методам применения таких композиций

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к ветеринарии

Изобретение относится к медицине, при этом гормон роста человека применяют в комбинации с ингибитором синтеза кортизола, в частности кетоконазолом, для предупреждения или лечения состояний, относящихся к метаболическому синдрому (нейроэндокринный синдром)
Наверх