Способ доочистки химопапаина

 

Использование: биотехнология, может быть применено в фармацевтической промышленности, в частности при лечении патологий межпозвонковых дисков млекопитающих. Сущность изобретения: cпособ доочистки химопапаина, заключающийся в приготовлении исходного раствора химопапаина, пропускании неочищенного раствора через колонку с матрицей аффинной хроматографии, направленной на его активный центр, включающей подложку, ковалентно связанную через спейсорную группу с N-концом обратимого хипопапаин-ингибитором пептида, у которого С-концевая аминокислота является производной фенилаланина, аланина, циклогексиаланина или лейцина, и связанного с активным сайтом химопапаина более прочно, чем с активным сайтом РРIV, причем указанный пептид присоединен к активному центру молекулы химопапаина, и элюировании подходящим элюентом, или сначала осуществляют кислотное осаждение хипопапаина при рН 1,2 - 1,8 из его исходного раствора, отделение примесных белков, нейтрализацию полученного раствора и обессоливание его при необходимости диализом, пропускание через колонку с указанной матрицей аффинной хроматографии, элюирование химопапаина подходящим элюентом, объединение активных фракций, их диализ и сушку замораживанием. 3 з. п. ф-лы, 10 табл.

Изобретение относится к химопапаину, его улучшенным фармацевтическим композициям и к способам лечения пораженных выпяченных или имеющих иную патологию межпозвонковых спинальных дисков млекопитающих, включающим инъецирование в эти диски раствора улучшенной композиции. Изобретение относится к способам получения заявляемого химопапаина, к пептидам и матрицам для аффинной хроматографии, использующимся при осуществлении таких способов, а также к композициям антител по отношению к химопапаину.

Химопапаин представляет собой протеиназу цистеина, содержащуюся в растении paW-paW (Carica papaya). Было установлено, что он может использоваться в клинической практике, в частности для лечения выпавших или выпяченных дисков или ишиалгии методом, известным под названием "хемонуклеозис" (L. Smith, 1964, J. Amer. Med. Assoc. 187, с. 137 140).

Попытка очистки и идентификации химопапаина впервые была предпринята Jansen'ом и Balls'ом (1941, J. Biol. Chem, 137, с. 405 417), которые использовали методы кислотного осаждения и высаливания для получения этого фермента. Позже для очистки использовались методы, основанные на ионообменной хроматографии. Так, например, в патентах Великобритании N 2098897 (Smith Laboratories Inc.) и N 2156821 (Simmons) описано использование катионообменных смол для отделения химопапаина от других известных протеиназ цистеина. Оба описанных в этих патентах способа использовались для получения химопапаина в промышленных масштабах. Было установлено, однако, что полученный в результате материал обладает относительно низкой активностью по сравнению с химопапаином, полученным Buttle и Barret (1984, Biochem. J. 223, с. 81 88) в небольших количествах многостадийным способом, включающим, в частности, стадию катионообменной хроматографии. Хотя этот материал и обладал высокой активностью, однако получен он был с очень низким выходом, и этот способ непригоден для использования в промышленных масштабах. Battle (Biochem. J. июль 1989, 261, с. 469 476) было установлено, что полученный этим способом продукт загрязнен недавно выделенной и идентифицированной протеиназой, протеиназой IV папаин, которая элюируется вместе с химопапаином из катионообменных смол. С помощью катионообменной хроматографии невозможно отделить химопапаин от протеиназы IV папайи до такой степени, чтобы его можно было использовать для получения химопапаина, практически не содержащего протеиназы IV папайи.

В литературе есть сведения также о способах, одной из стадий которых является аффинная хроматография. Так, в Biochem. Biophys. Acta, 658, с. 262 269, 1981, описана очистка химопапаина с использованием помимо других методов аффинной хроматографии на ртутно-агарозной колонке, а в Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1988, 369, с. 733 740, Dibois и др. опубликовали сообщение о выделении протеиназ цистеина, из Carica papaya c помощью аналогичных методов. Этот тип аффинной хроматографии основан на взаимодействии ртутных лигандов, связанных с инертной матрицей, с тиольными группами зафиксированных на ней белков. В результате все остальные белки, кроме химопапаина, в частности другие протеиназы цистеина, например протеиназа IV папайи, могут быть связаны с материалом, которым заполнена колонка, и затем элюированы вместе с химопапаином.

Недавно в научных статьях было описано использование аффинной хроматографии с помощью иммобилизированных производных пептидов для очистки отдельных протеиназ, таких как человеческий катепсин В (Rich и др. 1986, Biochem. J. 235, с. 731 734) и гистолизин из Entamoeba histolytica (Liaces and Barret, Biochem. J. 250, с. 903 909). До настоящего времени этот метод не использовался для очистки химопапаина и проблема разработки усовершенствованного способа очистки химопапаина, который можно было бы использовать в промышленных масштабах, по-прежнему остается актуальной.

Некоторые синтетические производные пептидов, являющиеся ингибиторами протеиназы серина химотрипсина, описаны в W 084/00365.

Был разработан новый способ очистки и выделения обладающего высокой активностью химопапаина, не содержащего примесей, в частности других содержащихся в латексе папайи протеиназ цистеина, включая протеиназу IV папайи.

Продуктом изобретения является практически чистый химопапаин с высоким содержанием активной формы этого фермента.

Химопапаин в соответствии с изобретением практически не содержит иммунологически отличных протеинах, обнаруженных в латексе папайи, а именно папаина, протеиназы III папайи (РРIII) (эти две протеиназы описаны Buttle and Barret в Biochem. J. 1984, 223, с. 81 88) и в особенности недавно открытой протеиназы IV папайи (РРIV). Используемое в данном описании выражение "практически чистый" следует поэтому понимать как "практически иммунологически чистый" и означает практическое отсутствие перекрестных реакций между химопапаином в соответствии с изобретением и специфическим антителами, индуцируемыми против чистой РРIV, выделенной и идентифицированной Buttle и др. (Biochem. J. июль 1988, 261, с. 469 476) и кратко описанной ниже, а также отсутствие перекрестных реакций с специфическими антителами против папаина и ppIII, описанный ранее Buttle и Barrett (1984) (см. цитированный выше источник). Следует, в частности, отметить, что так называемый "чистый" химопапаин, полученный по способу, описанному Buttle и Barrett, содержит, как это было установлено, значительное (около 14) количество ppIV и поэтому содержащая индуцированные им антихимопапаиновые антитела композиция обладает специфичностью как по отношению к очищенному химопапаину в соответствии с изобретением, так и к очищенной ppIV. Химопапаин в соответствии с изобретением содержит менее 0,2, предпочтительно не более 0,1 ppIV, ppIII и папаина.

Перекрестная реакция между антигеном и антителом может быть обнаружена с помощью обычных известных методов. К таким методам относятся, например, слитный ракетный иммуноэлектрофорез и двойная иммунодиффузия (описанная Buttle и Barrett (1984) в цитированном ранее источнике), однорадиальный иммуноанализ, радиоиммуноанализ (RIA) и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Количество активного фермента, содержащегося в ферментной композиции, обычно характеризуется его удельной активностью по отношению к определенному субстрату в конкретных условиях проведены анализа. Используемое в данном описании выражение "удельная активность по отношению к BAPNA" означает протеиназную активность в пикомолях п-нитроанилина, образующегося в секунду на мг сухого продукта (пмоль/c/мг) при проведении анализа с использованием синтетического субстрата N-α-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилина (BAPNA) в стандартных условиях. Стандартные условия анализа, в которых исследуются известные фармацевтические композиции химопапаина, детально описаны ниже в разделе "BAPNA анализ, методика 1" или "Анализ по Смиту". Определенные этим методом удельные активности выражаются в единицах удельной активности по отношению к BAPNA (1 ммоль) при 37^oC и рН 6,0. Химопапаин в соответствии с изобретением характеризуется удельной активностью по отношению к BAPNA (1 ммоль) при 37^oC и рН 6,0, равной 800 1700, предпочтительно 1000 1700, например 1200 1500 ед/мг (при проведении анализа при 37^oC и рН 6). По предпочтительному варианту осуществления изобретения удельная активность получаемого химопапаина по отношению к BAPNA (1 ммоль) при 37^oC и рН 6,0, равная как минимум 1300 ед./мг.

Поскольку в многочисленной литературе, относящейся к химопапаину и другим цистеиновым протеиназам, протеиназная активность очень часто выражается как количество п-нитроанилина, выделяющегося в свободном виде из синтетического субстрата BAPNA, то возникает проблема непосредственного сравнения приведенных в этих работах значений удельной активности. Точные значения зависят от ряда факторов, в частности от условий проведения анализа, например рН, температуры, состава буфера и концентрации использовавшегося субстрата. Химопапаин, полученный Buttle и Barrett (1984, цитированная выше работа), согласно приведенным в этой работе данным имеет удельную активность по отношению к BAPNA,равную 0,154 мкмоль/мин/мг или 2567 пмоль/c/мг. Однако условия, в которых проводили анализ Buttle и Barrett, отличались от условий для химопапаина известной фармацевтической квалификации и поэтому прямое сопоставление их удельных активностей невозможно.

Поскольку считается, что химопапаин, полученный Buttle и Barrett, обладает наиболее высокой удельной активностью из всех известных к тому времени аналогичных материалов, то на начальном этапе работ по созданию изобретения анализ проводился в условиях, приведенных в указанной работе. Эта методика проведения анализа называется далее "Анализ BAPNA, методика N 2". Определенные с ее помощью удельные активности получены по отношению в BAPNA (2,5 ммоль) при 40^oC и рН 6,8, которые безусловно отличаются от условий, использующихся при анализе фармацевтических композиций химопапаина. Полученные при использовании этой методики результаты в 2 3 раза превышают по величине результаты, полученные при использовании обычного фармацевтического анализа BAPNA по методике 1, хотя с научной точки зрения сравнение результатов, полученных двумя различными методами анализа, с помощью простого коэффициента пересчета является некорректным. Тем не менее, как следует из результатов, полученных на начальной стадии осуществления изобретения, удельная активность чистого химопапаина в соответствии с изобретением по отношению к BAPNA (2,5 ммоль) при 40^oC и рН 6,8 находится в пределах 3000 4500, например 3500 4500 ед./мг.

Сравнительно недавно была очищена и идентифицирована ранее неизвестная примесь в химопапаине, полученном известными способами, а именно протеиназа IV папайи (ppI=V). PPIV неактивна по отношению к BAPNA, но обладает протеиназной активностью по отношению к азоказеину. Кроме того, было установлено, что концентрации куриного цистеина до 1 мкмоль очень мало влияют на активность ppIV по отношению к азоказеину. Активность же химопапаина в соответствии с изобретением по отношению к азоказеину при этих концентрациях куриного цистеина ингибируется как минимум на 95 Выражение "активность по отношению к азоказеину", используемое в данном описании, означает протеиназную активность, определяемую как количество образующихся в единицу времени на единицу сухого веса продукта растворимых в трихлоруксусной кислоте пептидов при использовании дериватизированного белкового субстрата азоказеина в стандартных условиях анализа, описанных ниже. Предпочтительно химопапаин в соответствии с изобретением имеет активность по отношению к азоказеину, которая по меньшей мере на 97, предпочтительно на 98 100 ингибируется куриным цистеином при концентрации его до 1 мкмоль.

Следует считать, что заявляемый химопапаин представляет собой впервые полученный практически чистый продукт без примесей белков и с высоким содержанием активной формы указанного фермента. Это достижение стало возможным только благодаря пониманию того, что загрязняющий его белок в случае известных способов подвергался очистке вместе с химопапаином, например, при использовании для этой цели ионообменных и известных аффинных колонок. Дальнейшие исследования привели к выделению и идентификации этого загрязнения, который был определен как PPIV. Способ, использовавшийся для получения PPIV, неприменим для получения чистого химопапаина, однако получение PPIV позволило выявить два важных параметра, с помощью которых может быть охарактеризован чистый химопапаин. Эти параметры следующие: 1) отсутствие перекрестной реактивности чистого химопапаина со специфичными по отношению к PPIV антитела; 2) различная активность чистого химопапаина и PPIV по отношению к азоказеину в присутствии куриного цистеина.

Эти две особенности являются существенными факторами для разработки способа очистки химопапаина.

Очевидно, что химопапаин в соответствии с изобретением превосходит другие известные продукты почти со всех точек зрения. Композиции чистого фермента имеют важное значение для исследований, целью которых является детальное изучение всех характеристик фермента, например его строения и каталитической способности.

Предметом изобретения далее является композиция, включающая заявляемый химопапаин. Такая композиция практически не содержит PPIV. Содержащийся в ней химопапаин имеет удельную активность по отношению к BAPNA (1 ммоль) при 37^oC и рН 6,0, равную 800 1700 ед./мг. Предлагаемые композиции могут выпускаться в виде отдельных доз соответствующего веса, например в виде аликвотных количеств химопапаина, герметизированного в условиях отсутствия доступа влаги, например в откачанных пузырьках или ампулах. Такие композиции могут, кроме того, включать восстановитель, например дитиотреитол, цистеин в виде свободного основания или его кислой аддитивной соли, назначение которых состоит в предотвращении существенного уменьшения активности фермента за счет окисления. По другому варианту предлагаемые композиции могут содержать далее обратный ингибитор протеиназы цистеина в форме соли, например тетратионат натрия или хлорид ртути. Такие обратимые ингибиторы блокируют активные центры фермента, благодаря чему предотвращается снижение активности последнего за счет окисления взамен, например, восстановителя, который реактивирует фермент. Другими обычными добавками, которые при желании могут входить в состав композиции, являются, например, консерванты, в частности бисульфит натрия, комплексоны, в частности ЭДТА, и носители, в частности хлорид натрия.

Композиции чистого фермента имеют, в частности, важное значение при клиническом применении химопапаина, например при хемонуклеолизисе, и поскольку, как следует из литературных данных, при использовании этого метода лечения могут возникать аллергические реакции у 3 пациентов. Порошкообразный экстракт папайи широко используется в пищевой промышленности и считается, что многие аллергические реакции на хемонуклеозис возникают вследствие предсенсибилизации такими композициями. Однако общеизвестно, что инъекция антигенов чужеродных белков млекопитающим всегда несет в себе опасности анафилактического шока. В медицинской практике принято использовать наиболее чистые и наиболее активные из имеющихся белковых препаратов, что позволяет получить оптимальный эффект от процедуры и свести к минимуму риск аллергических реакций.

Поэтому, предметом изобретения является также фармацевтическая композиция, включающая заявляемый химопапаин. Предлагаемая композиция практически не содержит PPIV. Входящий в ее состав химопапаин имеет удельную активность по отношению к BAPNA (1 ммоль) при 37^oC и рН 6,0, равную 800 - 1700 ед./мг. Предлагаемые фармацевтические композиции предпочтительно содержат кроме того фармацевтически приемлемый нетоксичный восстановитель, такой как цистеин, в виде свободного основания или его кислой аддитивной соли, например моногидрат L-цистеин гидрохлорида. Как правило, восстановитель присутствует в композиции в количестве примерно 0,5 3 мг на 4000 ед. химопапаина, что соответствует, например, 15 90 мас. в расчете на химопапаин. Фармацевтические композиции в соответствии с изобретением могут, кроме того, содержать любой обычный фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель, например консерванты, в частности бисульфит натрия, комплексы, в частности ЭДТА, и носители, в частности хлорид натрия.

Фармацевтические композиции, содержащие химопапаин в соответствии с изобретением, могут использоваться в офтальмологии, например при лечении глазных болезней, или для хирургической обработки струп тканей, например ожоговых ран, язв, омертвевших в результате отдавливания тканей, пролежней и других ран с омертвлением тканей. Такие композиции обычно выпускают в формах для местного применения, например в форме стерильных растворов, гелей, суспензий или мазей, которые могут использоваться для непосредственной обработки ими ран или наноситься на раны через пропитанные ими повязки.

Предпочтительно химопапаин в соответствии с изобретением используется для приготовления на его основе композиций для ортопедических целей. Такие фармацевтические композиции обычно выпускают в виде единичных доз для парентерального введения, например в виде стерильных, не содержащих пирогенов, растворов или суспензий в подходящем носителе или в виде концентратов, пригодных для реконструкции перед использованием. Композиции в виде единичных доз, пригодные для растворения или лечения пульпозных ядер патологических или пораженных межпозвонковых дисков путем введения их в эти диски, могут содержать 500 5000 ед. (проведение анализа при концентрации BAPNA 1 ммоль, при температуре 37^oC и рН 6,0) химопапаина в соответствии с изобретением и восстановитель, например цистеинат натрия гидрохлорид, заключенные в эвакуированную ампулу. Предпочтительная единичная доза включает 2000 или 4000 единиц BAPNA (1 ммоль BAPNA, 37^oC, рН 6,0) химопапаина. Единичная доза композиции может состоять из, например, 2 5, предпочтительно, 2,5 3,5 мг химопапаина и 0,2 3, предпочтительно 1,0 2,0 мг цистеината натрия гидрохлорида, при желании в смеси с подходящим носителем, например, хлоридом натрия, заключенных в эвакуированную емкость.

В ходе описанных ниже опытов было обнаружено 26 образцов индивидуальных сывороток, содержащих естественно приобретенные ИгЕ антитела по отношению к выпускаемой композиции химопапаина химодиактин, получаемого по способу, описанному в патенте Великобритании N 2098997. В этих опытах экспериментально показано, что в этих сыворотках содержат ИгЕ антитела по отношению к химопапаину в соответствии с изобретением, а также к трем другим протеиназам цистеина, обнаруженным в латексе папайи, а именно к папаину, РРIII и PPIV. Однако средние содержания ИгЕ, обнаруженные в химопапаине, PPIII и PPIV, свидетельствует о том, что PPIII и PPIV вместе отвечают за примерно 75 обнаруженного ИгЕ. Из этих результатов неопровержимо следует, что указанные белки имеют существенно иммуногенный характер и могут составлять большую часть антигенных детерминант, содержащихся в выпускаемых в настоящее время композициях химопапаина, и представляют необычайно широкие антигенные возможности. Поэтому, фармацевтические композиции в соответствии с изобретением обладают существенным преимуществом перед известными композициями.

Изобретение относится также к способу лечения с помощью хемонуклеозиса пораженных, выпяченных или других патологических заболеваний межпозвонковых спинальных дисков у млекопитающих, включающий инъекцию в эти диски, фармацевтически приемлемого раствора химопапаина в соответствии с изобретением в количестве, достаточном для селективного растворения части диска.

Предметом изобретения является далее способ лечения патологических спинальных дисков у млекопитающих, включающий: I) введение иглы в диск; II) контроль положения иглы с помощью рентгеноскопии; III) введение в диск фармацевтически приемлемого раствора химопапаина и в соответствии с изобретением в количестве, достаточном для селективного растворения части диска.

Изобретение относится также к способу очистки химопапаина, включающему: а) инкубацию водного раствора сырого химопапаина с матрицей аффинной хроматографии с активными центрами, включающей подложку, ковалентно связанную, при желании через спейсерную группу, с концевым N-атомом обратимо ингибирующего химопапаин пептида, в результате чего указанный пептид связывается с активным центром молекулы химопапаина; b) элюирование химопапаина, подходящим элюентом.

Сырым химопапаином, использующимся в качестве исходного материала для очистки химопапаина в соответствии с изобретением, может быть экстракт свежего латекса папайи, раствор, полученный из промышленно выпускаемого латекса после распылительной сушки, концентрат папаина или частично очищенный химопапаин, а также раствор выпускаемого препарата, так называемого "чистого" химопапаина. Специалисты однако прекрасно понимают, что довольно сложные по составу экстракты папайи, например латекс папайи, содержат значительные количества других природных компонентов, которые желательно удалить из них. Предпочтительно основное количество этих компонентов удаляют до инкубации раствора сырого химопапаина с матрицей аффинной хроматографии путем фильтрации или центрифугирования, с помощью которых удаляется нерастворимый материал. Однако было установлено, что более эффективным является кислотное осаждение, при котором происходит осаждение основного количества примесей.

Кислотное осаждение, при котором рН водного раствора сырого химопапаина снижают до 2, дают раствору отстояться и затем отделяют раствор химопапаина, используется для очистки химопапаина вот уже в течение 50 лет. Совершенно неожиданно было установлено, что значение рН, устанавливаемое при осуществлении этого процесса, оказывает решающее влияние на степень загрязнения получаемого раствора химопапаина PPIV. Как показало изучение этого процесса, который ранее рассматривали как стадию предварительной трубой очистки химопапаина, тщательное дозирование и контроль приводят к резкому снижению содержания примеси PPIV, белка, который, как теперь установлено, при использовании обычных способов подвергается очистке совместно с химопапаином. Предметом изобретения, таким образом, является способ очистки химопапаина, включающий:
1) осаждение из водной смеси, содержащей сырой химопапаин, при рН 1,2 - 1,8;
2) отделение водного раствора сырого химопапаина от указанной смеси;
3) нейтрализацию и при желании обессоливание раствора сырого химопапаина.

Предпочтительно удалять из такой композиции все оставшиеся в ней примеси белков, включая в процесс очистки по меньшей мере одну стадию обычной ионообменной хроматографии, например, как это описано Buttle и Barrett, 1984 (см. цитированную выше опубликацию). Предпочтительно, в частности, использовать для этой цели в качестве последней стадии хроматографию высокого разрешения, например FPLCR (жидкостная экспресс-хроматография белков) на катионообменной смоле, такой как смола, выпускаемая под торговым названием моно-S или S-сефароза^R HP (Pharmacia).

По предпочтительному варианту предметом изобретения является способ очистки химопапаина, включающий
I) осаждение водной смеси, содержащей сырой химопапаин, при рН менее 1,0;
II) отделение водного раствора сырого химопапаина от указанной смеси;
III) нейтрализацию и при желании обессоливание раствора сырого химопапаина;
IV) инкубацию раствора, полученного на стадии (III), c матрицей аффинной хроматографии с активными центрами, включающей подложку матрицы, ковалентно связанную, при желании через спейсерную группу, с концевым атомом азота обратимо ингибирующего химопапаин пептида, в результате чего пептидсвязывается с активными центрами молекулы химопапаина, и V) элюирование химопапаина подходящим элюентом.

Для специалиста, очевидно, что указанную предпочтительную стадию катионообменной хроматографии можно проводить альтернативно или дополнительно перед или после стадии аффинной хроматографии.

Водная смесь, содержащая сырой химопапаин, может включать, например, свежий латекс папайи, латекс папайи, высушенный в распылительной сушилке, или концентрат папаина (например, высушенный в распылительной сушилке латекс, выпускаемый фирмой Powell and Scholefield, Великобритания, или Siebels, США), суспендированный в воде или в водном буфере, например, фосфатном или ацетатном. Предпочтительно перед кислотным осаждением смеси удалять из нее нерастворимый материал, для чего используют обычный способ, например фильтрацию или центрифугирование. Для снижения рН смеси до 1,0 2,0, предпочтительно до 1,2 1,8, наиболее предпочтительно до примерно 1,5, ее можно подкислять путем постепенного добавления к ней органической или неорганической кислоты, предпочтительно водного раствора неорганической, в частности, соляной кислоты. Осажденный материал может быть удален обычным способом, например путем фильтрации или центрифугирования. Было установлено, что полученный в результате кислый раствор сырого химопапаина обеднен по PPIV, папаину и в меньшей степени по РРIII.

Любому специалисту понятно, что прежде чем подвергнуть кислый раствор сырого химопапаина последующим стадиям хроматографической очистки, его необходимо нейтрализовать щелочным реагентом, например водным раствором гидроксида натрия, и предпочтительно удалить из него избыток солей способом, например, с помощью гель-фильтрации или диализа. Любой выпадающий при этом в осадок материал может быть удален путем фильтрации или центрифугирования.

Общеизвестно, что активность протеиназ цистеина может быть существенно повышена путем активирования их с помощью восстановителя, например дитиотреитола или цистеина, а также путем очистки их от следов тяжелых металлов, таких как ртуть, с помощью комплексонов, например ЭДТА, или обладающих хелатными свойствами смол, например выпускаемой под торговым названием смолы Chelex (фирма Bio-Rad Великобритания). С помощью таких мер удается добиться оптимального содержания свободных тиольных групп, которые, как известно, являются отличительным признаком активных центров протеиназ цистеина, и наличие их необходимо для проявления последними активности. Предпочтительно удаление примесей тяжелых металлов осуществляется путем диализа в буфер, содержащий ЭДТА. По другому варианту (при использовании катионообменной хроматографии) для удаления тяжелых металлов можно провести активацию химопапаина с помощью восстановителя. Химопапаин при этом связывается с катионообменной смолой и затем вымывается из колонки.

Для получения максимального количества активных центров раствор сырого химопапина, полученный после нейтрализации, обрабатывают восстановителем, например цистеином, и разбавляют до необходимой концентрации белка, например, до концентрации 30 мг/л. Нейтрализованный раствор сырого химопапаина подвергают затем инкубации с чувствительной с этим активным центрам матрицей аффинной хроматографии, в результате чего химопапаин через активные центры специфически связывается с ингибирующей пептидной связью матрицы. Раствор химопапаина можно пропускать через колонку с матрицей аффинной хроматографии со скоростью, например, 35 40 мл/ч/см². Одним литром матрицы аффинной хроматографии может быть связано примерно 1 4 г химопапаина.

Матрица аффинной хроматографии включает подложковую матрицу, например гелевую или мембранную матрицу, с которой ковалентно связан и, таким образом, иммобилизован ингибиторный пептид. Предпочтительной подложковой матрицей является гель агарозы, например гель, выпускаемый под торговым названием сефароза^R (Рharmacia), хотя могут использоваться и дериватизированные целлюлозные мембранные матрицы, например матрицы, выпускаемый под торговым названием зета (Anachem). Концевой атом азота пептида может быть связан с подложковой матрицей или непосредственно, или через спейсерную группу, например спейсерную группу из девяти атомов углерода, так как это имеет место в предпочтительной гелевой матрице, выпускаемой под торговым названием ЕСН сефароза^R 4B (Pharmacia). Связь между карбоксильными группами этой гелевой матрицы и свободными аминогруппами ингибиторного пептида, в результате чего происходит образование пептидной связи, может быть получена обычным образом, например путем конденсации, проводимой в присутствии кислого катализатора, протеканию которой способствует добавка водорастворимого карбодиимида, например, N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорида (EDC). Обычно реакцию сочетания проводят путем умеренного перемешивания гелевой матрицы с раствором ингибиторного пептида в присутствии Е С, например при комнатной температуре в течение 24 ч. Соотношение между реагентами может составлять, например, 3 4 г пептида на л геля.

Матрица аффинной хроматографии может быть загружена в колонку перед использованием. Однако при использовании в качестве матрицы хроматографии гелевой матрицы инкубацию можно проводить и периодическим способом и, при желании, загружать матрицу в колонку для последующего элюирования фермента. Предпочтительно, перед использованием тщательно промывать матрицу водным буфером для удаления следов не связанного пептида и катализатора реакции конденсации. При проведении процесса в промышленных масштабах колонну с матрицей аффинной хроматографии предпочтительно подвергнуть санитарной обработке in situ, например, водный раствором этанола, и таким образом, сделать ее пригодной для повторного использования.

Пептидами, обратимо ингибирующими химопапаин, являются пептиды, которые будучи иммобилизованными на подложковой матрице способны связываться с активными центрами химопапаина более прочно, чем с активными центрами других протеиназ цистеина, содержащихся в препаратах сырого химопапаина, в частности PPIV, но которые впоследствие могут быть вытеснены с этих центров. Предпочтительной группой ингибиторных пептидов являются аминокислоты с концевым атомом углерода, включающие альдегидные производные, такие как семикарбазоны, метоксимины или оксимы фенилаланина или его аналогов. Наиболее предпочтительными аминокислотами с концевым атомом углерода являются производные фенилаланина, такие как D или L-фенилаланинсемикарбазоны (Phesc), метоксиимины (PheMo) или оксимы (PheOx), или производные аналогов фенилаланина, такие как D или L-аланинсемикарбазоны (Alasc), D и L-циклогексилаланинсемикарбазоны (Chasc), или D или L-лейцинсемикарбазоны (Leisc). Было установлено, в качестве ингибирующих химпопапаин пептидов с успехов могут использоваться следующие дипептиды с концевым атомом углерода: L-Ala-L-Phesc, L-Ala-D-Phesc, L-Phe-D-Phesc, L-Phe-L-Phesc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-L-PheOx, L-Tyg-L-Phesc, L-Ala-L-Chasc и L-Ala-L-Leisc.

Дипептид L-Phe-L-Phesc описан Liaces и Barrett (1988) 250, с. 903 909. Предпочтительными пептидами являются, в частности, дипептиды, в особенности L-Ala-L-Phesc, L-Ala-D-Phesc и L-Phe-D-Phesc. Новые ингибирующие пептиды сами по себе и новые матрицы аффинной хроматографии, содержащие эти пептиды, также составляют предмет изобретения.

Перед элюированием химопапаина из матрицы аффинной хроматографии предпочтительно промыть ее для удаления неспецифично связанного материала. Промывку осуществляют, например, водным буфером, например цитратным или ацетатным буфером с рН 4 5. Было установлено, что целесообразно добавлять к используемому для промывки и для элюирования буферу реагенты, подавляющие гидрофобное взаимодействие и другие неспецифические связывающие реакции между матрицей и содержащимися в сыром химопапаине компонентами. К таким реагентам относятся, в частности, ЭДТА, изопропанол и этандиол.

Связанный химпопапаин может быть затем элюирован из матрицы подходящим элюентом, который разрывает связь между иммобилизированным ингибирующим пептидом и связанным с ним химопапаином за счет изменения характеристик активных центров с помощью денатурирующего агента, такого как изопропанол, или элюента с рН выше или ниже интервала рН, при котором происходит связывание химопапаина. Следует отметить однако, что подходящими для этой цели являются лишь такие элюенты, которые не вызывают необратимой инактивации элюируемого фермента. По другому варианту химопапаин может селективно вытеснен из иммобилизированного ингибирующего пептида с помощью элюента, содержащего избыток компонента, прочно связывающего с ингибирующим пептидом. Таким образом, таким компонентом может быть, например, другая протеиназа цистеина.

Однако по предпочтительному варианту осуществления изобретения такой элюент включает обратимый ингибитор протеиназы цистеина, который конкурентно связывается с активными химопапаина и таким образом вытесняет его из иммобилизированного ингибирующего пептида. Подходящими являются известные ингибиторы, например низкомолекулярные дисульфиды, такие как 2,2-дипиридилдисульфид, оксиэтилдисульфид, метил-2-пиридилдисульфид и тетратионат натрия, а также ртутные реагенты, такие как хлорид ртути, п-хлормеркурийбензоат и мерсалил. Для специалиста очевидно, что сродство между химопапаином и иммобилизированным ингибиторным пептидом будет зависеть от природы используемого пептида, рН, ионной силы и состава буфера, используемого для элюирования, а также от температуры. Поэтому в зависимости от этих параметров будут меняться и природа и концентрация используемой для элюирования химопапаина ингибирующей протеиназы. Следует отметить далее, что в случае ртутных реагентов равновесное состояние со связанным химопапаином устанавливается быстрее, чем в случае дисульфидных реагентов, и поэтому, такие ингибиторы можно использовать для осуществления элюирования непрерывным способом. В случае использования ингибиторов, которые медленно приходят в равновесие со связанным химопапаином, перед элюированием химопапаина может потребоваться инкубация матрицы с ингибитором в течение, например, 1 2 или более ч. Однако содержание белка и активность протеиназы во фракциях элюата могут контролироваться обычным образом, для эффективного и селективного вытеснения химопапаина из матрицы можно изменять ионную силу или природу элюента и продолжительность инкубации матрицы с ингибитором. Фракции элюента с низким содержанием белка или с низкой активностью химопапаина могут быть затем отброшены.

Для того чтобы ослабить взаимодействие между химопапаином и ингибиторным пептидом, рН элюента предпочтительно поддерживать достаточно низким, например в пределах 4 5, наиболее предпочтительно равным 4,5. Было установлено, что подходящими элюентами являются, например, оксиэтилдисульфид (100 ммоль) в водном растворе этадиола (33), содержащем цитрат натрия (50 ммоль) и ЭДТА (1 ммоль), рН 4,5; дипиридилдисульфид (30 ммоль) в водном растворе этандиола (33 ), содержащем цитрат натрия (50 ммоль) и ЭДТА (1 ммоль), рН 4,5; метилпиридилдисульфид (30 ммоль) в водном растворе этандиола (33), содержащем цитрат натрия (50 ммоль) и ЭДТА (1 ммоль), рН 4,5; мерсалиловая кислота (10 ммоль) в водном растворе этандиола (33), содержащем гидроксид натрия (50 ммоль) и ЭДТА (25 ммоль), рН которого устанавливают равным 4,5 с помощью уксусной кислоты, и хлорид ртути (10 ммоль) в водном растворе этандиола (33), содержащем ацетат натрия (50 ммоль), рН 4,5. Предпочтительным обратимым ингибитором протеиназы цистеина является хлорид ртути.

Используемая по предпочтительному варианту осуществления способа в соответствии с изобретением для очистки химопапаина аффинная хроматография существенно увеличивает удельную активность последнего, которая определяется как активность по отношению к BAPNA или путем титрования активных центров реагентов Е-64 или иодуксусной кислотой. Активная форма химопапаина связывается в первую очередь и элюируется, и таким образом, отличается от его неактивной формы и других протеиназ цистеина, содержащихся в исходном продукте. Свежеприготовленный химопапаин в соответствии с изобретением, очищенный с помощью аффинной хроматографии, как правило, содержит не менее 70, предпочтительно не менее 80, наиболее предпочтительно не менее 90 активного фермента.

Как правило, очищенный химопапаин извлекают из элюата перед хранением или использованием. Предпочтительно элюированный химопапаин подвергают дополнительной очистке для вытеснения ингибитора протеиназы цистеина с активных центров фермента. Ингибитор может быть вытеснен путем добавления избытка восстановителя, например цистеина, и затем, при желании, удален с помощью обычных способов, например гель-фильтрации или диализа. По другому варианту ингибитор может быть удален путем адсорбции на определенной смоле. Так, например, низкомолекулярные дисульфиды могут адсорбироваться на глутатионовой аффинно-хроматографической колонке, а ртутные реагенты на смолах, обладающих комплексующими свойствами. По предпочтительному варианту ингибитор удаляют путем активирования фермента восстановителем, например цистеином, находящимся в связанном состоянии в колонке с катионообменной смолой, и последующего вымывания ингибитора из колонки. Извлеченный очищенный химопапаин перед хранением предпочтительно лиофилизируют, например, путем сублимационной сушки.

Характеристики химопапаина в соответствии с изобретением могут быть определены известными методами. К таким методам относятся, например, аминокислотный (для аминокислот с концевым атомом азота) анализ; титрование активных центров реагентом Е-64 или иодуксусной кислотой и определение одновременно скорости инактивации; электрофорез в додецилсульфате натрия или многозональный катодный электрофорез в полиакриламидном геле, а также определение активности по отношению к различным субстратам потеиназ.

Новые ингибиторные пептиды в соответствии с изобретением могут быть получены аналогичными известными методами. Так, например, производные дипептидов могут быть получены путем многостадийного синтеза следующим образом:
a) Концевой атом углерода аминокислоты (первой аминокислоты), который впоследствии должен стать концевым С-атомам ингибирующего пептида, может быть защищен, например, путем взаимодействия с О,N-диметилгидроксиламин гидрохлоридом в присутствии изобутил-хлорформиата и N-метилморфолина с образованием в результате диметилоксиамидного производного. Предпочтительно, чтобы концевой атом азота первой аминокислоты был вначале защищен, например, третбутоксикарбонильной группой.

b) Защищенная первая аминокислота, например ее диметилоксиамидное производное, может быть затем подвергнуто взаимодействию с сильной, например трифторуксусной, кислотой, с образованием четвертичной соли аммония.

с) Четвертичная соль аммония защищенной первой аминокислоты может быть затем подвергнута взаимодействию с производным второй аминокислоты, например, с N-карбобензоксипроизводным, с образованием в результате производного дипептида.

d) Полученное производное дипептида может быть восстановлено путем его взаимодействия с мягким восстановителем, например диизобутилалюминийгидридом или литийалюминийгидридом, с образованием в результате у концевого атома углерода дипептида свободной альдегидной группы.

е) Полученный альдегид может быть переведен, например, в семикарбазон, путем взаимодействия с семикарбазидом; в метоксиимин, путем взаимодействия с метоксиамин гидрохлоридом, или в оксим, путем взаимодействия с гидроксиламином.

f) На последней стадии у защищенного концевого атома азота может быть удалена защитная группа, например N-карбобензокси-группа может быть удалена путем каталитического восстановления с использованием 10-ного палладия на активированном угле.

Описание аналитических методов.

Определение белка.

В том случае, если это было возможно, концентрацию белка определяли методом А₂₈₀, используя А₂₈₀, 1 20,0 для анализа препаратов латекса папайи и А₂₈₀, 1 18,3 для анализа препаратов очищенного или частично очищенного химопапаина (Robinson, 1975, Biochemistry 14, с. 3695 3700). Некоторые тиолсодержащие реагенты и дисульфиды склонны к поглощению при 280 нм, поэтому, в случае их присутствия, для определения концентрации белка использовали Bio-Rad-анализ со связыванием красителя (Bio-Rad-Laboratories, Великобритания). В качестве стандартов использовали отфильтрованные растворы высушенного в распылительной сушилке латекса папайи (А₂₈₀, 1 20,0). Этот метод менее чувствителен к наличию примесей, чем А₂₈₀. В препаратах очищенного фермента количество белка определялось в расчете на общее содержание сухого вещества.

Определение активности химопапаина.

а) Активность по отношению к BAPNA (методика N 1) анализ по Смиту.

Исследуемую пробу добавляли к "буферу 1", водному буферному раствору фосфата натрия (0,1 М) рН 6,0, содержащему ЭДТА (1 ммоль) и моногидрат цистеин гидрохлорида (10 ммоль), с таким расчетом, чтобы конечный объем составлял 1,0 мл. Фермент (при наличии его в пробе) активировали в течение 5 мин при 37^oC перед началом реакции путем добавления 4 мл раствора субстрата, N-a-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилида (BAPNA) (1,25 ммоль), предварительно нагретого до 37^oC.

Примечание: раствор субстрата готовили путем растворения 300 мг BAPNA в теплом диметилсульфоксиде, медленного добавления приготовленного раствора к 450 мл предварительно нагретого до 37^oC буфера 1 и доведения затем общего объема до 500 мл буфером 1; температуру раствора субстрата поддерживали выше 30^oC для предотвращения осаждения BAPNA.

Инкубацию при 37^oC продолжали в течение 30 мин, после чего реакцию прекращали путем добавления к реакционной смеси 1 мл уксусной кислоты (4 н.). Выделяющийся 4-нитроанилин определяли путем измерения DA₄₁₀. Одна единица активности соответствовала выделению в этих условиях 1 пкмоль 4-нитроанилина ε 8800 M^-1·cм^-1) в секунду.

Приведенные условия проведения анализа соответствовали условиям, описанным в патенте Великобритании N 2098997, поданном Smith Laboratories Inc. B этих условиях анализируются фармацевтические препараты химопапаина во всем мире, например химопапаин, выпускаемый фирмой The Boots Company PLC, Великобритания, под торговым названием химодиактин, и химопапаин, выпускаемый фирмой Sinpoong в Южной Корее под торговым названием дискен. Эти единицы активности международно признаны и обычно называются "Smith BAPNA Assay Units".

b) Активность по отношению к BAPNA (Методика N 2).

Исследуемую пробу добавляли к водному буферному раствору фосфата натрия (0,10 М) рН 6,8, содержащему ЭДТА (1 ммоль) и дитиотреитол (2 ммоль) или цистеин (4 ммоль) с таким расчетом, чтобы конечный объем составлял 0,975 мл. Фермент (в случае присутствия его в пробе) активировали путем выдержки в течение 5 мин при 40^oC перед началом реакции путем добавления 25 мкл N-a-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилида (BAPNA) (100 ммоль) в диметилсульфоксиде. Инкубацию при 40^oC продолжали в течение 10 мин, после чего реакцию прекращали путем добавления к реакционной смеси 1 мл водного буферного раствора хлорацетата натрия (0,10 М) и ацетата натрия (0,20 М) рН 4,3. Количество выделяющегося 4-нитроанилина определяли путем измерения DA₄₁₀. Одна единица активности соответствовала выделению в этих условиях 1 пкмоль 4-нитроанилина (ε 8800 м^-1·см^-1) в секунду.

Абсолютные значения активности химопапаина, полученные с помощью описанных методик NN 1 и 2, отличаются друг от друга, а именно: значения, полученные с помощью методики N 2, примерно в 2 3 раза больше значений, полученных с помощью методики N 1 (см. пример 31).

c) Титрование активных центров иодуксусной кислотой.

Титрование активных центров химопапаина иодуксусной кислотой проводили таким же образом, как и титрование активных центров реагентом Е-64, описанное Zicheg'om и др. в Biochim Biophys. Acta (1985), 828, с. 196 204. Раствор химопапаина разбавляли в буфере 1, как это описано в вышеприведенном разделе (а), получая раствор, содержащий 60 мкМ белка (E₂₈₀ 4,3284 x 10⁴ M^-1·см^-1, рассчитанное по данным анализа A₂₈₀, 1 18,3 Robinson (1975) (см. цитированную выше работу) и М. В. 23656, рассчитанный из аминокислотной последовательности Jacqiet и др. (май 1989, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 370, с. 425 434). Аликвотные доли по 20 мкл раствора химопапаина помещали в пробирки для титрования и проводили инкубацию в течение 5 мин при 37^oC c 20 мкл буфера 1 (40 мкл в контрольном опыте). Затем в каждую пробирку добавляли 20 мкл (соответственно 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мкмоль) иодуксусной кислоты и смесь предварительно выдерживали в течение 10 20 мин при 37^oC. Реакцию инициировали путем добавления к смеси 4 мл раствора субстрата BAPNA, описанного в вышеприведенном разделе (а), предварительно нагретого до 37^oC. Инкубацию продолжали при 37^oC в течение 30 мин, после чего реакцию прекращали, как это описано в разделе (а), и определяли количество выделившегося 4-нитроанилина путем измерения DA₄₁₀. Полученную таким образом молярную концентрацию активного химопапаина сравнивали с молярной концентрацией белка на основе молярного коэффициента экстинкции для химопапаина, равного 4,3284 х 10⁴ M^-1·см^-1. Содержание активного химопапаина выражали затем в процентах относительно общего содержания белка.

d) Активность по отношению к азоказеину.

Активность по отношению к азоказеину определяли по методике, описанной ранее Rowan'om и др. (1988), Arch. Biochem. Biophys. 267 270, используя менее 1 мкМ фермента (из расчета на мол. в. 24000) и при необходимости 1 мкМ куриного цистеина. Все концентрации ферментов и ингибитора относятся к концентрации активных молекул.

Иммунологический анализ методом простой радиальной иммунодиффузии.

Простая радиальная иммунодиффузия основана на методе Mancin и др. 1965, Immunochem. 2, 235 254 и проводится следующим образом. Агарозу (1 мас.) в водном растворе фосфата натрия (10 ммоль), содержащем NaCl (0,14 M), рН 7,3, содержащую препарат моноспецифического ИгГ, выливали на Gel Bond^R (FMC Corporation, Maine, США) и вырезали прямоугольные лунки (r 1 ммоль) 1,5 см. Контрольные образцы и исследуемые пробы распределяли по лункам случайным образом для сведения к минимуму краевого эффекта. После внесения в лунки антигена пластинки составляли на 24 ч для развития колец преципитина. Затем их промывали, высушивали и окрашивали. Для получения кривых зависимости антигена от квадрата диаметра кольца использовали чистый, умеренно карбоксиметилированный антиген. Интервал определения составлял 25 300 нг антигена на лунку.

Получение PPIV и ее антител.

a) Получение аффинной колонки.

П-нитрофениловый эфир бутоксикарбонил-L-Phe (10 ммоль) добавляли к перемешиваемой смеси α-NH₂CH₂CN·HCl (20 ммоль) и диизопропилэтиламина (20 ммоль) в диметилформамиде (20 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч при 20^oC, после чего разбавляли этилацетатом (100 мл), дважды промывали водой, 5 раз водным раствором триэтиламина, 3 раза водой, дважды водным раствором бисульфата калия, 3 раза водой, высушивали и упаривали. Остаток перекристаллизовывали из смеси этилацетата и гексана, получая в результате Boc-L-Phe-NHCH₂CN т. пл. 134,5 135^oC. Охлажденную льдом трифторуксусную кислоту (10 мл) добавляли к раствору Boc-a-Phe-NHCH₂CN (5 ммоль) в дихлорметане (10 мл). Реакционную смесь выдерживали в течение 30 мин при 20^oC, после чего растворитель удаляли выпариванием при 40^oC. Остаток растворяли в хлорформе, раствор упаривали и повторяли описанную процедуру еще два раза. Полученную в результате сырую трифторацетатную соль растворяли в растворе диизопропилэтиламина (7,5 ммоль) в диметилформамиде (10 мл) и добавляли к приготовленному раствору п-нитрофениловый эфир Boc-Gly (6,25 ммоль)и моногидрат N-оксибензотриазола (6,25 ммоль). Затем для выделения п-нитрофенола (окрашивание в золотой цвет) к смеси добавляли по каплям достаточное количество диизопропилэтиламина и перемешивали ее при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого к смеси добавляли N,N-диэтилэтилендиамин (1,5 мл), через 15 мин этилацетат (60 мл), а затем промывали ее водой, водным раствором триэтиламина, водой, водным раствором бисульфата калия, водой, высушивали и упаривали. Остаток подвергали очистке с помощью хроматографии на диоксиде кремния, осуществляют элюирование смесью этилацетата и гексана в соотношении 20 1. В результате получали Boc-Gly-L-Phe-NHCH₂CN в виде пены.

Boc-Gly-L-Phe-NHCH₂CN (30 мг) растворяли в смеси трифторуксусной кислоты, дихлорметана и анизола в соотношении 25 65 10 (1 мл) и выдерживали раствор в течение 30 мин при 0^oC. Смесь затем высушивали в ротационном выпарном аппарате при 34^oC и остаток растворяли в метаноле (1,5 мл) и водном растворе NaHCO₃ (0,1 M, pH 8,0, 1,5 мл), получая раствор лиганда.

Активированную СН-сефарозу^R 4B (Pharmacia, 3 г, сухой вес) гидратировали в течение ночи в водном растворе соляной кислоты (1 ммоль, 75 мл) при 4^oC, после чего промывали соляной кислотой (1 ммоль, 600 мл), а затем водным раствором NaHCO₃ (0,1 M, pH 8,0, 300 мл). Гель суспендировали в водном растворе NaHCO₃ (0,1 M, pH 8,0, 30 мл), добавляли к суспензии приготовленный ранее раствор лиганда и смесь осторожно перемешивали в течение ночи при 20^oC. Полученный гель собирали на спеченном стеклянном фильтре, промывали водным раствором метанола (50 об. 180 мл), водой и суспендировали в водном растворе этаноламина (0,1 М, 30 мл) рН которого устанавливали равным 9,0 с помощью соляной кислоты. Суспензию встряхивали в течение 4 ч при 20^oC, после чего гель собирали, промывали водой (500 мл) и хранили в "рабочем" буфере (фосфат натрия, 50 ммоль); ЭДТА (1 ммоль); этандиол (33%), рН 6,8 при 4^oC.

b) Колонку, заполненную сефароза^R Ahx-Gly-L-Phe-NHCH₂CN (объем слоя 4 мл), промывали "элюирующим" буфером (цитрат натрия, 50 ммоль); этандиол (33 ), рН 4,5; 12,5 мл), а затем рабочим буфером (см. выше, 12 мл).

Высушенный в распылительной сушилке латекс папайи (0,5 г) растворяли в рабочем буфере (10 мл) и раствор фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Концентрацию белка в фильтрате определяли с помощью Bio-Rad lye-binding анализа (Bio-Rad Laboratories, Великобритания). К смеси добавляли дитиотреитол в таком количестве, чтобы конечная концентрация равнялась 2 мМ, и выдерживали ее в течение 20 мин при 0^oC. Через колонку пропускали 80 мг латекса белка (38 мл/ч/см²) при 20^oC, а затем рабочий (8 мл) и элюирующий (8 мл) буферы. После этого через нее пропускали элюирующий буфер (4 мл), содержащий оксиэтилдисульфид (50 ммоль), затем проток через колонку прекращали и оставляли ее на ночь при 20^oC. После выдержки в течение ночи возобновляли элюирование содержащим оксиэтилдисульфид элюирующим буфером (10 мл)и собирали фракции элюата (1 мл). Фракции, активные по отношению к BAPNA, объединяли и пропускали через колонку, заполненную Monos HR 5/5^R (катионообменная смола), предварительно обработанную водным раствором смеси ацетата натрия и уксусной кислоты (50 ммоль) рН 5,0, содержащим ЭДТА (1 ммоль). После этого, колонку промывали тем же самым буфером (1 мл/мин) до тех пор, пока А₂₈₀ нм основа не давало нулевого значения. Затем через колонку пропускали градиент (21,5 ммоль Na⁺/мл) до 1 М ацетата натрия (Buttle и Barrett, 1984, цитированная ранее работа) и собирали фракции по 1 мл. Элюировали два главных пика белка: первый пик, элюирование которого происходило при примерно 0,17 М Na⁺, соответствующий папаину, и второй пик, элюирование которого происходило при примерно 0,38 М Na⁺, соответствующий PPIV. Фракции с пиком, соответствующим PPIV, объединяли, подвергали диализу в водный раствор ЭДТА (1 ммоль), высушивали методом сублимационной сушки и хранили при -20^oC. Чистая PPIV не проявляла активности по отношению к BAPNA, но в то же время обладала активностью по отношению к гидролизованному азоказеину, которая не ингибировалась куриным цистеином при концентрации 1 мкМ.

с) Получение антител против PPIV.

Чистый антиген PPIV мягко карбоксиметилировали перед использованием по методу Zickeg и др. 1985, Biochim. Bio ys. Acta, 828, с. 196 204. Антисыворотку к PPIV инициировали у кролика путем внутримышечной инъекции 360 мкг карбоксиметилированного белка в полном адъюванте Фрейнда с последующей через 2 недели подкожной инъекцией 100 мкг в неполном адъюванте. ИгГ частично очищали от сыворотки путем фракционирования с помощью сульфата аммония, как это описано Heide и Schwick (1978) в Handbook of Experimenal Immunology (ред. D.M.Weir) т. 1, 7.1 7.11, Blackwell, Oxford, с последующим диализом в водный раствор фосфата натрия (10 ммоль), содержащий NaCl (0,14 M), pH 7,3.

Для анализа PPIV методом простой радиальной иммунодиффузии (см. выше) использовали препарат специфичного по отношению к PPIV игГ.

Более подробно отдельные аспекты изобретения иллюстрируются с помощью нижеприведенных примеров, которые однако являются исключительно иллюстративным материалом и никоим образом не ограничивают объема защиты.

Используемые аббревиатуры имеют следующие значения: ABTS - 2,2-азинобис(3-этилбензтиазолинсульфокислота); Ahx 6-аминогексаноил, Ala - аланин; BAPNA N-альфа-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилид; Вос - бутилоксикарбонил; CBZ карбобензокси; Cha циклогексилаланин; ДМГ - N,N-диметилформамид; Е-64-L-3-карбокси-2,3-транс-эпоксипропионил-дейциламидо-(4-гуанидино)-бутан; EDC N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид, гидрохлорид; ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота (динатриевая соль); Gly глицин; Leu - лейцин; Мо метоксиимин; OBZ оксибензил,Ox оксим, Phe фенилаланин, Sc - семикарбазон, THF тетрагидрофуран, Tyr тирозин.

Bio-Rad, Chelex, Chymodiactin, CH-сефароза 4В, Chymofast, Disken, ECH-сефароза, Enzfitter, FPLC, Gel Bond, Mono SHR, S-сефароза НР, Tween, Zeta Zetaffinity являются торговыми названиями.

Все стадии, если это не оговорено, проводились при комнатной температуре.

Пример 1. L-аланил-L-фенилаланил-семикарбазон.

Стадия A.

А) К сухому N,N-диметилформамиду (ДМФ) (100 мл) добавляли при перемешивании, при комнатной температуре О,N-диметил-гидроксиламин гидрохлорид (10,23 г). После этого к смеси добавляли N-метилморфолин (10,6 г) в течение 5 мин, поддерживая температуру ниже 30^oC. При этом выпадал белый осадок и смесь охлаждали до 0^oC.

B) N-t-Boc-L-Phe (26,5 г) растворяли в сухом тетрагидрофуране (ТГФ) (200 мл) и охлаждали раствор до -10^oC, после чего добавляли к нему в течение 5 мин изобутилхлорформиат (14,38 г), поддерживая температуру равной -10^oC. Затем к смеси добавляли N-метилморфолин (10,6 г) в течение 10 мин, поддерживая ее температуру равной -10^oC, и перемешивание продолжали в течение еще 10 мин.

с) Суспензию А добавляли к суспензии В в течение 15 мин при -10^oC. Смеси давали нагреться до комнатной температуры и затем перемешивали ее в течение 3 ч. Полученную смесь охлаждали до 0^oC и добавляли к ней 3-диметиламинопропиламин (10,2 г) в течение 5 мин. Затем добавляли воду (200 мл) и этилацетат (200 мл), отделяли верхний органический слой и последовательно промывали его: а) водой (200 мл); b) водным раствором KHCO₃ (5 200 мл); с) водным раствором HCl (0,5 н, 200 мл); d) водой (3 х 200 мл). После этого растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC, получая в результате N-t-Boc-L-Phe-O,N-диметилгидроксамат.

Стадия В.

Смесь N-t-Boc-L-Phe-O, N-диметилгидроксамата (2,9 г) и трифторуксусной кислоты (8 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Избыток трифторуксусной кислоты удаляли затем в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. К остатку добавляли диэтиловый эфир (30 мл), получая раствор, после чего эфир отгоняли в вакууме. Эфирную обработку повторяли до тех пор, пока не начиналась кристаллизация. Твердое вещество отфильтровывали, промывали эфиром и высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате трифторацетатную соль L-Phe-O,N-диметилгидроксамата.

Стадия С.

А) Трифторацетатную соль L-Phe-O,N-диметилгидроксамата (7,15 г) растворяли в сухом ДМФ (30 мл) при перемешивании при комнатной температуре, после чего добавляли к раствору N-метил-морфолин (2,35 г) в течение 5 мин, поддерживая температуру ниже 30^oC. Полученную смесь охлаждали до 0^oC.

B) CBZ-L-Ala (4,96 г) растворяли при перемешивании в сухом ТГФ (55 мл) и смесь охлаждали до -10^oC. Затем к ней добавляли изобутилхлорформиат (3,05 г) в течение 5 мин при -10^oC, N-метилморфолин (2,35 г) в течение 10 мин и перемешивали реакционную смесь при -10^oC в течение еще 10 мин.

C) Раствор А добавляли к раствору В в течение 15 мин при -10^oC, после чего давали смеси нагреться до комнатной температуры и продолжали перемешивание в течение 3 ч. Смесь затем охлаждали до 0^oC, добавляли к ней 3-диметиламинопропиламин (2,27 г) в течение 5 мин и продолжали перемешивание в течение еще 5 мин. После этого к смеси добавляли воду (50 мл) и этилацетат (50 мл), отделяли верхний органический слой и промывали его последовательно: а) водой (50 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (5 мл); b) водным раствором KHCO₃ (5 50 мл); с) водным раствором HCl (0,5 н. 50 мл); d) водой (3 х 50 мл). Растворитель затем отгоняли в вакууме в ротационном выпарном аппарате при температуре ниже 30^oC, добавляли к остатку свежий этилацетат (50 мл) и удаляли его упариванием, получая в результате CBZ-L-Ala-L-Phe-O,N-диметилгидроксамат.

Стадия D.

CBZ-L-Ala-L-Phe-O, N-диметилгидроксамат (27,8 г) растворяли в сухом ТГФ (280 мл) и охлаждали раствор до -70^oC в атмосфере азота. После этого добавляли к нему раствор гидрида диизобутилалюминия в ТГФ (1 М, 72 мл) в атмосфере азота в течение 60 мин при -70^oC и продолжали перемешивание в течение еще 60 мин при -70^oC. Реакцию прекращали, выливая смесь в насыщенный водный раствор NaCl (400 мл) и раствор соли Pochell'a (600 мл) при перемешивании при 0^oC в атмосфере азота, после чего давали ей нагреться до комнатной температуры и добавляли этилацетат (600 мл). Смесь затем фильтровали, отделяли водный слой и проводили из него экстракцию этилацетатом (200 мл). Объединенные органические фазы трижды промывали водой (600 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (400 мл). Растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. Остаток перекристаллизовывался из толуола и высушивали и вакууме над P₂O₅, получая в результате альдегид CBZ-L-Ala-L-Phe.

Стадия E.

A) Альдегид CBZ-L-Ala-L-Phe- (3 г) растворяли в техническом метилированном спирте (20 мл). Раствор нагревали до 50^oC и фильтровали для удаления нерастворимого материала.

B) Раствор гидрохлорида семикарбазида (1,3 г) в воде (10 мл) добавляли к раствору KHCO₃ (1,1 г в воде (10 мл)).

C) Раствор В добавляли к раствору А и полученную смесь перемешивали при 50^oC в течение 2 ч, после чего добавляли к ней этилацетат (50 мл) и воду (100 мл), водный слой отделяли, проводили из него экстракцию этилацетатом (2 х 20 мл) и объединенные органические фазы промывали последовательно: а) водным раствором KHCO₃ (5 50 мл); b) водным раствором HCl (0,5 н. 50 мл); с) водой и насыщенным водным раствором NaCl (50 мл/20 мл х 3). Растворитель затем отгоняли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC, получая в результате CBZ-L-Ala-L-Phesc.

Стадия F.

CBZ-L-Ala-L-Phesc (680 мг) растворяли в метаноле (90 мл) и нерастворимый остаток отделяли путем фильтрования. Прибор, содержащий метанольный раствор CBZ-L-Ala-L-Phesc, продували азотом и загружали в него катализатор, 10-ный палладий на активированном угле (100 мг). В замкнутую систему пропускали водород в течение 75 мин. После этого катализатор отфильтровывали и метанол удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. Из остатка при стоянии выпадал кристаллический осадок, который высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате семикарбазон L-аланил-L-фенилаланина (L-Ala-L-Phesc).

Пример 2. Семикарбазон L-фенилаланил-L-фенилаланила.

Стадии A и B.

Трифторацетатную соль L-Phe-O, N-диметилгидроксамата получали таким же образом, как и на стадиях A и B примера 1.

Cтадия C.

A) Трифторацетатную соль L-Phe-O,N-диметилгидроксамата (1,932 г) растворяли в сухом ДМФ (8 мл) при перемешивании при комнатной температуре. К полученному раствору в течение 5 мин добавляли N-метилморфолин (0,606 г), поддерживая его температуру ниже 30^oC, и образующуюся смесь охлаждали до 0^oC.

B) CBZ-L-Phe (1,794 г) растворяли в сухом ТГФ (15 мл) при перемешивании и охлаждали раствор до -10^oC, после чего добавляли к нему изобутилхлорформиат (0,822 г) в течение 5 мин при -10^oC, N-метилморфолин (0,606 г) в течение 10 мин и перемешивали реакционную смесь при -10^oC в течение еще 10 мин.

C) Раствор А добавляли к раствору В в течение 15 мин при -10^oC, после чего давали смеси нагреться до комнатной температуры и продолжали перемешивание в течение 3 ч. Смесь затем охлаждали до 0^oC, добавляли к ней 3-диметиламинопропиламин (0,612 г) в течение 5 мин и продолжали перемешивание в течение еще 5 мин. Затем к смеси добавляли воду (20 мл) и этилацетат (30 мл) отделяли органическую фазу и промывали ее последовательно: а) водным раствором KHCO₃ (5 20 мл); b) водным раствором HCl (0,5 н. 20 мл); с) водой (2 х 30 мл). Растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 35^oC и остаток перекристаллизовывали из изопропилового спирта, получая в результате CBZ-L-Phe-L-Phe-O,N-диметилгидроксамат.

Стадия D.

CBZ-L-Phe-L-Phe-O, N-диметилгидроксаматa (4,89 г) растворяли в сухом ТГФ (40 мл). В сухую колбу загружали гидрид литийалюминия (0,493 г) и сухой ТГФ (20 мл) в атмосфере азота и перемешивали загруженную смесь при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего охлаждали до -50^oC. После этого в нее добавляли в течение 10 мин при -50^oC в атмосфере азота раствор гидроксамата в сухом ТГФ и продолжали перемешивание при 0 5^oC в течение еще 20 мин.

Реакционную смесь охлаждали затем до -50^oC и добавляли к ней насыщенный раствор соли Pochell'a (60 мл) в атмосфере азота. Смеси давали нагреться до комнатной температуры, добавляли к ней HCl (конц. 10 мл), доводя рН водной фазы до 3, и отфильтровывали нерастворимую часть. Затем к отфильтрованному раствору добавляли этилацетат (50 мл) и органическую фазу отделяли и промывали последовательно: а) водой (50 мл); b) водным раствором KHCO₃ (5 50 мл); с) водным раствором HCl (0,5 н. 50 мл); d) водой (3 х 50 мл). Этилацетат удаляли затем в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. Остаток оставляли стоять на ночь, после чего засушивали в вакууме над P₂O₅ и подвергали кристаллизации из толуола, получая в результате альдегид CBZ-L-Phe-L-Phe.

Cтадия E.

A) Альдегид CBZ-Phe-L-Phe растворяли в техническом метилированном спирте (10 мл) при 70^oC.

B) К раствору семикарбазила HCl (0,183 г) в воде (3 мл) добавляли тригидрат ацетата натрия (0,224 г), технический метилированный спирт (2 мл) и смесь нагревали до 60^oC.

C) Раствор А добавляли к раствору В, колбу из-под раствора А промывали техническим метилированным спиртом (3 мл), промывную жидкость добавляли к смеси и перемешивали ее в течение 30 мин при 60 70^oC. Смеси затем давали медленно охладиться в течение часа, оставляли ее стоять на льду в течение еще часа и затем оставляли стоять на ночь при 4^oC. Твердый продукт отделяли путем фильтрования, промывали его смесью технического метилированного спирта и воды (4 1, 3 мл) и высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате CBZ-L-Phe-L-Phesc.

Стадия F.

CBZ-L-Phe-L-Phesc (2,1 г) растворяли в метаноле (315 мл, при 30^oC) и нерастворимый остаток удаляли путем фильтрации. Прибор, содержащий раствор семикарбазона, продували азотом, загружали в него катализатор 10-ный палладий на активированном угле (0,35 г) и пропускали в замкнутую систему водород в течение 30 мин. После этого катализатор отфильтровывали и растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. Остаток высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате семикарбазон L-фенилаланил-L-фенилаланила (L-Phe-L-Phesc).

Пример 3. Метоксиимин L-фенилаланин-L-фенилаланила.

Стадия A D.

Альдегид CBZ-L-Phe-L-Phe получали таким же образом, как это описано в примере 2 (стадии A D).

Стадия E.

A) Альдегид CBZ-L-Phe-L-Phe (0,645 г) растворяли в техническом метилированном спирте (35 мл) при 60 65^oC и отфильтровывали нерастворимый остаток.

B) К раствору метоксиламин гидрохлорида (0,138 г) в воде (25 мл) добавляли тригидрат ацетата натрия (0,224 г) при 60^oC.

C) Раствор В добавляли к раствору А, колбу из-под В промывали водой (10 мл) при 60^oC, промывную воду, объединяли со смесью и нагревали смесь в течение получаса при 60^oC, после чего оставляли охлаждаться до комнатной температуры в течение 2 ч. Твердый продукт отфильтровывали, промывали техническим метилированным спиртом в смеси с водой (1 1,6 мл) и высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате метоксиимин CBZ-L-Phe-L-Phe
Стадия D.

CBZ-L-Phe-L-Phe-метоксиимин (550 мг) растворяли в метаноле и нерастворимый остаток отфильтровывали. Прибор, содержащий метанольный раствор метоксиимина, продували азотом и затем добавляли в него катализатор 10-ный палладий на активированном угле (100 мг). В герметизированную емкость подавали водород и при необходимости подачу продолжали в течение 4,5 ч. После чего катализатор отфильтровывали и удаляли растворитель в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC, получая в результате L-фенил-аланил-L-фенилаланил-метоксиимин (L-Phe-L-PheMo).

Пример 4. L-фенилаланил-D-фенилаланил-семикарбазон.

Стадия A.

A) 0,N-диметилгидроксиламин гидрохлорид (3,891 г) суспендировали в сухом ДМФ (40 мл) при комнатной температуре. К приготовленной суспензии добавляли N-метилморфолин в течение 5 мин, поддерживая температуру смеси ниже 30^oC, после чего ее охлаждали при перемешивании до 0^oC.

B) N-t-Boc-D-Phe (10,08 г) растворяли в сухом ТГФ (80 мл) и охлаждали полученный раствор до -10^oC, после чего добавляли к нему изобутилхлорформиат (5,47 г) в течение 5 мин, поддерживая эту температуру. Затем, поддерживая эту же температуру, добавляли N-метилморфолин (4,032 г) в течение 10 мин и перемешивание продолжали в течение еще 10 мин.

C) Суспензию А добавляли к суспензии В течение 15 мин при -10^oC, смеси давали нагреться до комнатной температуры, после чего ее перемешивали в течение 3 ч. Затем ее охлаждали до 0^oC, добавляли 3-диметиламинопропиламин (3,88 г) в течение 5 мин и продолжали перемешивание в течение еще 5 мин. После этого к смеси добавляли воду (60 мл) и этилацетат (60 мл), органический слой отделяли и промывали последовательно: а) водой (60 мл); b) водным раствором KHCO₃ (5 60 мл); с) водным раствором HCl (0,5 M, 60 мл); d) водой (3 х 60 мл). Растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC, получая в результате N-t-Boc-D-Phe-O,N-диметилгидроксамат.

Стадия В.

N-t-Boc-D-Phe-O,N-диметилгидроксамат (11,3 г) охлаждали льдом, добавляли к нему трифторуксусную кислоту (30 мл) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 3 ч. Избыток уксусной кислоты удаляли в вакуумном ротационном выпарном аппарате при температуре ниже 30^oC и растворяли остаток в диэтиловом эфире (100 мл). Растворитель отгоняли в вакууме и повторяли операцию до тех пор, пока не начиналась кристаллизация. Выпадающий твердый осадок отфильтровывали, промывали диэтиловым эфиром и высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате трифторацетатную соль D-Phe-O,N-диметилгидроксамата.

Стадия С.

A) Трифторацетатную соль -Pe-O-диметилгидроксамата (10,1 г) растворяли в сухом ДМФ (41 мл) при перемешивании при комнатной температуре. К полученному раствору добавляли N-метилморфолин (3,155 г) в течение 5 мин, поддерживая температуру ниже 30^oC, после чего смесь охлаждали до 0^oC.

B) CBZ-L-Phe (9,4 г) растворяли в сухом ТГФ (80 мл) при перемешивании и охлаждали раствор до -10^oC. После этого к нему добавляли изобутилхлорформиат (4,307 г) в течение 5 мин, N-метилморфолин (3,155 г) в течение 10 мин и реакционную смесь перемешивали при -10^oC в течение еще 10 мин.

C) Раствор А добавляли к раствору В в течение 15 мин при -10^oC, затем смеси давали нагреться до комнатной температуры и продолжали перемешивание в течение 3 ч. Смесь охлаждали до 0^oC, добавляли к ней 3-диметиламинопропиламин (3,20 г) в течение 5 мин и продолжали перемешивание в течение еще 5 мин, после чего добавляли к ней воду (60 мл) и этилацетат (60 мл), отделяли органическую фазу и промывали ее последовательно: а) водой (60 мл) и насыщенным раствором NaCl (60 мл); b) водным раствором КHCO₃ (5 60 мл); с) водным раствором HCl (0,5 н. 60 мл); d) (3 x 60 мл). Растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. Добавляли к остатку свежий этилацетат и затем удаляли его упариванием. Остаток перекристаллизовывали из изопропанола, получая в результате СBZ-L-Phe-D-Phe-O,N-диметилгидроксамат.

Стадия D.

В продутую азотом колбу загружали гидрид диизобутилалюминия в виде раствора в дихлорметане (1 М, 10 мл). Колбу нагревали до 50^oC, пока не отгонялся весь дихлорметан, и всю систему снова продували азотом. Затем к содержимому колбы добавляли сухой ГТФ (10 мл) и охлаждали смесь до -70^oC. CBZ-L-Phe-D-Phe-O, N-диметилгидроксамат (0,978 г) растворяли в сухом ТГФ (10 мл) и добавляли приготовленный растворе в течение 10 мин при -70^oC к раствору гидрата диизобутилалюминия, после чего продолжали перемешивание при -70^oC в течение еще 10 мин. Реакционную смесь затем выливали в метанол (30 мл) и насыщенный раствор соли Rockell'a (30 мл) при -60^oC и давали смеси нагреться до комнатной температуры, после чего добавляли к ней воду (60 мл) и этилацетат (50 мл), отделяли органическую фазу, а водную фазу подвергали экстракции этилацетатом (50 мл). Объединенные органические фазы промывали водой (2 х 200 мл) и фильтровали. Органическую фазу отделяли и удаляли растворитель в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC, добавляли свежий этилацетат и затем удаляли его, получая в результате CBZ-L-Phe-D-Phe-альдегид.

Стадия E.

A) Альдегид CBZ-L-Phe-D-Phe (400 мг) растворяли в техническом метилированном спирте (10 мл) при 60^oC.

B) Раствор тригидрата ацетата натрия (0,298 г) в воде (3 мл) добавляли к раствору семикарбазид гидрохлорида (0,244 г) в виде (3 мл) при 60^oC.

C) Смешивали растворы А и В и образующуюся смесь перемешивали в течение 5 ч при 60^oC, после чего оставляли стоять на ночь при 4^oC. Выпадающий твердый осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате CBZ-L-Phe-D-Phesc.

Стадия F.

CBZ-L-Phe-D-Phesc (600 мг) растворяли в метаноле (90 мл) и нерастворимый остаток отфильтровывали. Прибор, содержащий метанольный раствор семикарбазона, продували азотом и загружали в него катализатор, 10-ный палладий на активированном угле (100 мл). В герметизированную емкость подавали в течение 2 ч водород, после чего катализатор отфильтровывали и метанол удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC, получая в результате L-фенилаланил-D-фенилаланил-семикарбазон (L-Phe-D-Phesc).

Пример 5. Оксим-L-фенилаланил-L-фенилаланила.

Стадия A D.

Альдегид CBZ-L-Phe-D-Phe получали таким же образом, как это описано в примере 2 (стадии A D).

Стадия E
A) CBZ-L-Phe-L-Phe (0,645 г), полученный вышеописанным образом, растворяли в техническом метилированном спирте (35 мл) при 60 65^oC и раствор фильтровали для удаления нерастворимого остатка.

B) К раствору гидроксиламин гидрохлорида (0,114 г) в воде (25 мл) добавляли при 60^oC тригидрат ацетата натрия (0,224 г).

C) Раствор B добавляли к раствору А и колбу из-под раствора В промывали водой (10 мл), которую добавляли к смеси, и смесь перемешивали в течение 3/4 ч при 60 65^oC, затем охлаждали до 4^oC и выдерживали при этой температуре в течение 2 3 ч. Выпадавший твердый осадок отфильтровывали, промывали смесью технического метилированного спирта и воды (1 1,5 мл) и высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате CBZ-L-Phe-L-PheOx в виде смеси син- и антиизомеров.

Стадия F.

CBZ-L-Phe-L-PheOx (500 мг) растворяли в метаноле (130 мл) и отделяли нерастворимый остаток путем фильтрования. Прибор, содержащий метанольный раствор оксима, продували азотом и загружали в него катализатор, 10-ный палладий на активированном угле (83 г). В герметизированную емкость в течение 30 мин подавали водород, после чего катализатор отфильтровывали и удаляли растворитель в ротационном выпарномаппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. Остатки растворителя удаляли в создаваемом насосом высоком вакууме. Остаток высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате оксим L-фенилаланил-L-фенилаланина (L-Phe-L-PheOx).

Пример 6. L-аланил-D-фенилаланил-семикарбазон.

Стадии A и B.

Трифторацетатную соль D-Phe-O, N-диметилгидроксамата получали таким же образом, как и в случае примера 4 (стадии A и B).

Стадия С.

A) Трифторацетатную соль D-Phe-O,N-диметилгидроксамата (5,000 г) растворяли в сухом ТГФ (20 мл). К полученному раствору медленно добавляли N-метилморфолин (1,578 г), поддерживая температуру ниже 30^oC, образующуюся смесь охлаждали до 0^oC.

B) CBZ-L-Ala (3,463 г) растворяли в сухом ТГФ (40 мл) и охлаждали раствор до -10^oC, после чего добавляли к нему изобутилхлорформиат (2,158 г) в течение 5 мин при -10^oC, N-метилморфолин (1,578 г) в течение 10 мин и перемешивали реакционную смесь при -10^oC в течение еще 10 мин.

C) Смешивали растворы А и В при -10^oC в течение 10 мин, после чего давали смеси нагреться до комнатной температурыи продолжали перемешивание в течение 3 ч. Смесь затем охлаждали до 0^oC, добавляли к ней 3-диметиламинопропиламин (1,585 г) и прекращали реакцию путем добавления воды (50 мл). Затем добавляли к реакционной смеси этилацетат (50 мл), органическую фазу отделяли и водный слой подвергали экстракции этилацетатом (2 х 30 мл). Органические слои объединяли и промывали последовательно: а) водой (50 мл) и насыщенным раствором NaCl (10 мл); b) водным раствором KHCO₃ (5 50 мл); с) водным раствором НСl (0,5 г, 50 мл); d) водой (3 х 50 мл). Растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. Твердый остаток перекристаллизовывали из этилацетата, получая в результате CBZ-L-Ala-D-Phe-O,N-диметилгидроксамат.

Стадия D.

CBZ-L-Ala-D-Phe-O, N-диметилгидроксамат (2,9 г) растворяли в сухом ТГФ (25 мл) и охлаждали раствор до -70^oC в атмосфере азота. После этого к нему добавляли раствор гидрида диизобутилалюминия в ТГФ (1 М, 37 мл) в течение 10 мин при -70^oC и продолжали перемешивание в течение еще 10 мин.

Реакцию, прекращали, выливая смесь в насыщенный раствор соли Pochell'a (125 мл) и ТГФ (125 мл) при перемешивании при -30^oC и продувке азотом, после чего давали смеси нагреться до комнатной температуры. Добавляли этилацетат (100 мл) и органический слой отделяли. Водный слой подвергали экстракции этилацетатом (2 х 30 мл), органические слои объединяли и промывали водой (3 х 30 мл). Реакционную смесь фильтровали и растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. Добавляли свежий этилацетат и затем снова удаляли его, получая в результате альдегид СBZ-L-Ala-D-Phe.

Стадия E.

A) Альдегид CBZ-L-Ala-D-Phe (1,2 г) растворяли в ТГФ (20 мл) и техническом метилированном спирте (20 мл) и нагревали раствор до 50^oC.

B) Горячий раствор семикарбазон гидрохлорида (1,8 г) в воде (15 мл) добавляли к горячему раствору KHCO₃ (1,5 г) в воде (15 мл).

C) Раствор В добавляли к раствору А и перемешивали полученную смесь в течение 4 ч при 50^oC. Растворитель затем удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. К остатку добавляли воду (50 мл), твердый продукт отфильтровывали, промывали смесью воды и технического метилированного спирта (1 1) и высушивали и вакууме над P₂O₅, получая в результате CBZ-L-Ala-D-Phesc.

Стадия F.

CBZ-L-Ala-D-Phesc (750 мг) растворяли в метаноле (50 мл) и нерастворимый остаток отфильтровывали. Прибор с метанольным раствором продували азотом и загружали в него катализатор, 10-ный палладий на активированном угле. В герметизированную систему в течение 90 мин подавали водород. Катализатор затем отфильтровывали и растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. Остаток высушивали в вакууме при P₂O₅, получая в результате L-аланил-D-фенилаланил-семикарбазон (L-Ala-D-Phesc)
Пример 7. L-тирозинил-L-фенилаланил-семикарбазон.

Стадии A и B.

Фторацетатную соль L-Phe-O,N-диметилгидроксамата получали таким же образом, как и в случае примера 4 (стадии A и B).

Стадия C.

А) Трифторацетатную соль L-Phe-O,N-диметилгидроксамата (7,95 г) растворяли в сухом ДМФ (30 мл) при перемешивании при комнатной температуре, после чего добавляли к раствору N-метилморфолин (2,49 г) в течение 5 мин, поддерживая температуру после 30^oC, и охлаждали смесь до 0^oC.

B) CBZ-OBZ-L-Tyr (10 г) растворяли в сухом ДМФ (60 мл) при перемешивании и охлаждали раствор до -10^oC, после чего добавляли к нему изобутилхлорформиат (3,38 г) в течение 5 мин при этой же температуре. Затем к смеси добавляли N-диметилморфолин (2,49 г) в течение 10 мин и перемешивали ее при -10^oC в течение еще 10 мин.

C) Раствор А добавляли к раствору В в течение 15 мин при -10^oC, после чего смеси давали нагреться до комнатной температуры и продолжали перемешивание в течение 3 ч. Смесь затем охлаждали до 0^oC и добавляли к ней 3-диметил-аминопропиламин (2,52 г) в течение 5 мин. Добавляли к ней воду (50 мл) и этилацетат (50 мл), отделяли верхний органический слой и промывали его последовательно: а) водой (50 мл); b) водным раствором KHCO₃ (5 50 мл); с) водным раствором HCl (0,5 M, 50 мл); d) водой (3 х 30 мл). Растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC и остаток перекристаллизовывали из изопропилового спирта, получая в результате CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-ON-диметилгидроксамат.

Стадия D.

CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-O, N-диметилгидроксамат (0,012 г) растворяли в сухом ТГФ (10 мл), добавляли к полученному раствору раствор гидрида диизобутилалюминия в ТГФ(1M, 8,5 мл) в атмосфере азота в течение 10 мин при -70^oC и продолжали перемешивание в течение еще 10 мин.

Реакцию продолжали, выливая смесь в метанол (20 мл) и раствор соли Rochell'a (30 мл) при перемешивании, при температуре -60^oC, в атмосфере азота и давали смеси нагреться до комнатной температуры. Затем добавляли к ней воду (50 мл) и этилацетат (50 мл), отделяли органическую фазу и промывали ее водой (200 мл). Реакционную смесь затем фильтровали и удаляли из нее растворитель в ротационном выпарном аппарате. Твердый остаток высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате альдегид CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe.

Стадия E.

A) Альдегид CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe (400 мг) растворяли в техническом метилированном спирте (20 мл) и ТГФ (10 мл) и нагревали раствор до 60^oC.

B) Добавляли горячий раствор самикарбазон гидрохлорида (600 мг) в воде (5 мл) к горячему раствору KHCO₃ (500 мг) в воде (5 мл).

C) Раствор В добавляли к раствору А и перемешивали смесь при 60^oC в течение 2 ч, после чего растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC и остаток резко охлаждали водой. Твердый материал отфильтровывали, промывали водой и техническим метилированным спиртом и высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phesc.

Стадия F.

CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phesc (770 мг) растворяли в сухом ТГФ (70 мл), раствор фильтровали и добавляли к фильтрату метанол (20 мл). Прибор с раствором семикарбазон продували азотом и загружали в него катализатор, 10-ный палладий на активированном угле (100 мг). В герметизированную систему в течение нескольких часов подавали водород, после чего катализатор отфильтровывали и растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате, получая в результате L-тирозинил-L-фенилаланилсемикарбазон (L-Tyr-L-Phesc).

Пример 8. L-аланил-L-циклогексилаланил-семикарбазон.

Стадия A.

A) К сухому ДМФ (75 мл) добавляли при перемешивании O,N-диметилгидроксиламин гидрохлорид (8,51 г), а затем N-метилформолин (8,8 г) в течение 5 мин, поддерживая температуру ниже 30^oC. Выпадающий белый осадок и смесь охлаждали до 0^oC.

B) N-t-Boc-L-Cha (22,5 г) растворяли в сухом ТГФ (200 мл) и охлаждали раствор до -10^oC, после чего добавляли к нему изобутилхлорформиат (11,94 г) в течение 5 мин, поддерживая температуру равной -10^oC, а затем в течение 10 мин при той же температуре N-метилморфолин(8,8 г) и перемешивание продолжали в течение еще 10 мин.

C) Суспензию А добавляли к суспензии В в течение 15 мин при -10^oC, давали смеси нагреться до комнатной температуры и перемешивали ее в течение 4 ч. Затем ее охлаждали до 0^oC и добавляли 3-диметиламинопропиламин (8,6 г) в течение 5 мин и продолжали перемешивание в течение 5 мин, добавляли воды (200 мл) и этилацетат (100 мл), отделяли водный слой и проводили из него экстракцию этилацетатом (2 х 100 мл). Объединенные органические фазы последовательно промывали: а) водой (100 мл) и насыщенным раствором NaCl (20 мл); b) водным раствором KHCO₃ (5 100 мл); с) водным раствором HCl (0,5 н. 100 мл); d) водой (3 х 100 мл). Растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC, получая в результате N-t-Boc-L-Cha-O, N-диметилгидроксамат.

Стадия B.

Перемешивали в течение 5 мин при 0^oC смесь N-t-Boc-L-Cha-O,N-диметилгидроксамата (26 г) и трифторуксусной кислоты (65 мл), затем давали ей нагреться до комнатной температуры и продолжали перемешивание в течение 3 ч. Избыток трифторуксусной кислоты удаляли в ротационном выпарном аппарате в вакууме при температуре ниже 30^oC. К остатку добавляли диэтиловый эфир и из полученного раствора отгоняли эфир в вакууме. Эфирную обработку повторяли, получая в результате трифторуксусную кислую соль L-Ca-O,N-диметилгидроксамата в виде желтой маслянистой жидкости.

Стадия С.

A) Трифторацетатную соль L-Ca-O,N-диметилгидроксамата (17 г) растворяли в сухом ТГФ (50 мл), добавляли к полученному раствору N-метилморфолин (3,95 г) в течение 5 мин, поддерживая температуру ниже 30^oC, и охлаждали затем смесь до 0^oC.

B) CBZ-L-Ala (9,25 г) растворяли в сухом ТГФ (100 мл) при перемешивании и охлаждали раствор до -10^oC, после чего добавляли к нему изобутилхлорформиат (5,85 г) в течение 5 мин при -10^oC, N-метилморфолин (3,95 г) в течение 10 мин и перемешивали реакционную смесь при -10^oC в течение еще 10 мин.

C) Раствор А добавляли к раствору В в течение 15 мин при -10^oC, давали смеси нагреться до комнатной температуры и продолжали перемешивание в течение 3 ч. Смесь затем охлаждали до 0^oC, добавляли к ней 3-диметиламинопропиламин (3/98 г) в течение 5 мин и продолжали перемешивание в течение еще 5 мин. Затем добавляли воду (150 мл) и этилацетат (150 мл), отделяли водную фазу и проводили из нее экстракцию этилацетатом (2 х 75 мл). Объединенные органические фазы промывали последовательно: а) водой (125 мл); b) водным раствором KHCO₃ (5 125 мл); с) водным раствором HCl (0,5 н, 125 мл); d) водой (3 х 125 мл). Растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате при температуре ниже 30^oC. Добавляли свежий этилацетат и затем отгоняли его, получая в результате СBZ-L-Ala-L-Cha-O,N-диметилгидроксамата.

Стадия D.

СBZ-L-Ala-L-Cha-O, N-диметилгидроксамат (7,22 г) растворяли в сухом ТГФ (160 мл) и охлаждали раствор до -70^oC в атмосфере азота, после чего добавляли к нему раствор гидрида диизобутилалюминия в ТГФ (1 М, 86 мл) в атмосфере азота в течение 20 мин при -70^oC и продолжали перемешивание в течение еще 20 мин.

Реакцию прекращали, выливая реакционную смесь в раствор соли Rochell'a (400 мл) при перемешивании, при 0^oC, в атмосфере азота и давали ей нагреться до комнатной температуры. Затем добавляли к ней этилацетат (150 мл) и перемешивали в течение 5 мин, фильтровали, отделяли органический слой и из водной фазы проводили экстракцию этилацетатом (2 х 50 мл). Объединенные органические фазы промывали водой (3 х 200 мл) с насыщенным водным раствором NaCl, который добавляли к последней промывке. Растворитель удаляли в ротационном аппарате при температуре ниже 30^oC, получая в результате альдегид СBZ-L-Ala-L-Cha.

Стадия E.

A) Альдегид CBZ-L-Ala-L-Cha (8 г) растворяли в техническом метилированном спирте (50 мл) и нагревали раствор до 50^oC.

B) К горячему раствору KHCO₃ (2,67 г) в воде (25 мл) добавляли горячий раствор семикарбазид гидрохлорида (3,0 г).

C) Раствор добавляли к раствору А и перемешивали смесь при 50^oC в течение 3 ч, затем ей давали остыть и оставляли стоять на ночь при 4^oC. Большую часть технического метилированного спирта удаляли в ротационном выпарном аппарате при температуре ниже 30^oC и к остатку добавляли этилацетат (50 мл). Органическую фазу отделяли и промывали ее последовательно: а) водой (30 мл); b) водным раствором KHCO₃ (5 30 мл); с) водным раствором HCl (0,5 н. 30 мл); d) водой (2 х 50 мл), с насыщенным водным раствором NaCl, добавляемым при необходимости для облегчения разделения. Растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате при температуре ниже 30^oC. Твердый остаток перекристаллизовывали из изопропанола, получая в результате СBZ-L-Ala-L-Chasc.

Стадия F.

СBZ-L-Ala-L-Chasc (900 мг) растворяли в метаноле (30 мл) и добавляли к раствору катализатор, 10-ный палладий на активированном угле (100 мг), в атмосфере азота. В герметизированную систему в течение 6 ч подавали водород, после чего катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате при температуре ниже 30^oC, а твердый остаток промывали эфиром и высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате L-аланил-L-циклогексилаланилсемикарбазон (L-Ala-L-Chasc).

Пример 9. L-аланил-L-лейцинилсемикарбазон.

Стадия A.

A) 0, N-диметилгидроксиламин гидрохлорида (9,17 г) добавляли при перемешивании при комнатной температуре к сухому ДМФ (110 мл), после чего добавляли к смеси N-метилморфолин (9,51 г) в течение 5 мин, поддерживая температуру ниже 30^oC. Выпадающий осадок и смесь охлаждали до 0^oC.

B) N-t-Boc-t-Leu (23,3 г) растворяли в сухом ТГФ (220 мл) и охлаждали раствор до -10^oC, после чего добавляли к нему изобутилхлорформиат (12,90 г) в течение 5 мин, поддерживая температуру равной -10^oC. Затем к ней добавляли N-метилморфолин в течение 10 мин, поддерживая температуру равной -10^oC и перемешивание продолжали в течение еще 10 мин.

C) Суспензию А добавляли к суспензии В в течение 15 мин при -10^oC. Смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали ее в течение 3 ч, после чего охлаждали до 0^oC и добавляли к ней 3-диметиламинопропиламин (9,13 г) в течение 5 мин и продолжали перемешивание в течение еще 5 мин. Затем к смеси добавляли этилацетат (110 мл) и воду (110 мл), органический слой отделяли и промывали последовательно: а) водой (2 х 100 мл); b) водяным раствором KHCO₃ (5 100 мл); с) водным раствором HCl (0,5 н. 100 мл); d) водой (3 х 100 мл). Растворитель удаляли в ротационном выпарном аппарате при температуре ниже 30^oC, получая в результате N-t-Boc-L-Leu-O,N-диметилгидроксамат.

Стадия В.

Смесь N-t-Boc-L-Leu-O, N-диметилгидроксамата (23,4 г) и трифторуксусной кислоты (165 мл, охлажденной до 0^oC) перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Избыток трифторуксусной кислоты удаляли затем в ротационном выпарном аппарате при температуре ниже 30^oC, к остатку добавляли диэтиловый эфир и удаляли из полученного раствора эфир в вакууме. Эту операцию повторяли до тех пор, пока не начиналась кристаллизация при 4^oC. В результате получали трифторацетатную соль L-Leu-O,N-диметилгидроксамата.

Стадия С.

A) Трифторацетатную соль L-Leu-O,N-диметилгидроксаматa (1,8 г) растворяли в сухом ТГФ (10 мл) при перемешивании при комнатной температуре. Смесь затем охлаждали до 0^oC и добавляли к ней N-метилморфолин (0,695 г) в течение 5 мин.

B) CBZ-L-Ala (1,40 г) растворяли в сухом ТГФ (20 мл) и охлаждали полученный раствор до -10^oC, после чего добавляли к нему изобутилхлорформиат (0,869 г) в течение 5 мин при этой же температуре, N-метилморфолин (0,635 г) в течение 10 мин и перемешивали смесь при этой же температуре в течение еще 10 мин.

C) Раствор А добавляли в течение 15 мин при -10^oC к раствору В, после чего давали смеси нагреться до комнатной температуры и продолжали перемешивание в течение 18 ч. Смесь затем охлаждали до 0^oC, добавляли к ней 3-диметиламинопропиламин (0,64 г) и прекращали реакцию путем добавления воды (25 мл) и этилацетата (25 мл). Водную фазу отделяли и подвергали ее экстракции этилацетатом (2 х 25 мл). Объединенные органические фазы промывали последовательно: а) водой (50 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (для облегчения разделения); b) водным раствором KHCO₃ (5 30 мл); с) водным раствором HCl (0,5 н. 30 мл); d) водой (3 х 30 мл). Растворитель удаляли затем в ротационном выпарном аппарате при температуре ниже 30^oC и твердый остаток высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате CBZ-L-Ala-L-Leu-O,N-диметилгидроксамат.

Стадия D.

CBZ-L-Ala-L-Leu-O, N-диметилгидроксамат (1,9 г) растворяли в сухом ТГФ (40 мл) и охлаждали полученный раствор до -70^oC в атмосфере азота, после чего добавляли к нему, также в атмосфере азота, гидрид диизобутилалюминия в ТГФ (1 М, 29,5 мл) в течение 10 мин при -70^oC и продолжали перемешивание в течение еще 10 мин.

Реакцию прекращали затем путем добавления метанола (50 мл) и раствора соли Rochell'a (50 мл) при перемешивании при -60^oC в атмосфере азота, давали смеси нагреться до комнатной температуры, добавляли к ней воду (50 мл) и этилацетат (50 мл), фильтровали, отделяли водный слой и подвергали его экстракции этилацетатом (2 х 50 мл). Объединенные органические фазы промывали водой (3 х 100 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (для облегчения отделения). Растворитель удаляли затем в ротационном выпарном аппарате при температуре ниже 30^oC, добавляли свежий этилацетат и удаляли его в ротационном выпарном аппарате, получая в результате альдегид CBZ-L-Ala-L-Leu.

Стадия E.

A) Альдегид CBZ-L-Ala-L-Leu (6,7 г) растворяли в техническом метилированном спирте (50 мл) и нагревали полученный раствор до 50^oC.

B) К горячему раствору семикарбазид гидрохлорида (10,8 г) в воде (30 мл) добавляли горячий раствор KHCO₃ (9 г).

C) Раствор В добавляли к раствору А и смесь перемешивали при 50^oC в течение 3 ч, после чего оставляли стоять на ночь при комнатной температуре. Выпадающий твердый осадок затем отфильтровывали, промывали техническим метилированным спиртом в смеси с водой (1 1, 20 мл) и высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате CBZ-L-Ala-L-Leusc.

Cтадия F.

CBZ-L-Ala-L-LeuSc (950 г) растворяли в метаноле и нерастворимый остаток отфильтровывали. К раствору добавляли еще 50 мл метанола и продували прибор азотом, после чего добавляли в него катализатор, 10-ный палладий на активированном угле (100 мг), в атмосфере азота и в герметизированную систему подавали в течение 135 мин водород. Катализатор затем отфильтровывали и удаляли растворитель в ротационном выпарном аппарате при температуре ниже 30^oC. Твердый остаток высушивали в вакууме над P₂O₅, получая в результате L-аланил-L-лейкинилсемикарбазон (L-Ala-L-Leusc).

Пример 10. Получение матрицы аффинной хроматографии ЕСН-сефарозы с активными центрами 4В L-Alal-L-Phesc.

ECH-сефарозу^R 4B (3 г, влажный вес) промывали на спеченном стеклянном фильтре водным раствором NaCl (0,5 M, 240 мл) и затем водой (120 мл). Готовили 0,1 М раствор N-этил-N-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид гидрохлорида (EDC) в воде и устанавливали рН полученного раствора равным 4,5 путем добавления к нему соляной кислоты или твердого ацетата натрия. L-Alal-L-Phesc. (10 мг), полученный как это описано в примере 1, растворяли в метаноле (400 мкл) и добавляли приготовленный раствор вместе с водным раствором EDC (0,1 M, 2,4 мл) к промытому гелю. Смесь осторожно перемешивали в течение часа при 20^oC, при необходимости корректировали рН до вышеуказанной величины и продолжали перемешивание при 20^oC в течение 23 ч. Затем к ней добавляли L-глицин до конечной концентрации 1 M и продолжали перемешивание в течение еще 3 ч. Полученный гель для аффинной хроматографии промывали последовательно водным раствором метанола (50 60 мл), водой (60 мл) и рабочим буфером (60 мл) и хранили до использования при 4^oC.

Примеры 11 18. Получение матриц аффинной хроматографии.

Каждое из дипептидных производных, полученных в соответствии с примерами 2 9, сочетали с гелевой матрицей таким же образом, как это описано в примере 10, получая в результате гели для аффинной хроматографии (примеры 11 18, соответственно).

Пример 19. Аффинная хроматография.

Высушенный в распылительной сушилке латекс папайи (0,03 г белка) фирмы Powell Scholefield Великобритания, в "рабочем" буфере (фосфат натрия, 50 ммоль); ЭДТА (1 ммоль); этандиол (33) рН 6,8, с добавкой дитиотреитола (2 ммоль) или цистеина (4 ммоль, 1,5 мл) пропускали через колонки с матрицами аффинной хроматографии (1 мл) в соответствии с примерами 10 18. Использовали по меньшей мере один из следующих пяти элюентов:
Элюент А-оксиэтилдисульфид (100 ммоль) в водном растворе этандиола (33), содержащем цитрат натрия (50 ммоль) и ЭДТА (1 ммоль), рН 4,5; в течение ночи перед элюированием колонку приводили в равновесное состояние;
Элюент В 2,2-дипиридилдисульфид (30 ммоль) в водном этандиоле (33), содержащем цитрат натрия (50 ммоль) и ЭДТА (1 ммоль), рН 4,5; перед элюированием колонку в течение ночи приводили в равновесное состояние;
Элюент С метилпиридилдисульфид (30 ммоль) в водном этандиоле (33), содержащем цитрат натрия (50 ммоль) и ЭДТА (1 ммоль), рН 4,5; перед элюированием колонку в течение ночи приводили в равновесное состояние;
Элюент D мерсалиловая кислота (10 ммоль) в водном этандиоле (33%) содержащем гидроксид натрия (50 ммоль) и ЭДТА (25 ммоль), рН, доведенным до 4,5 с помощью уксусной кислоты; непрерывное элюирование;
Элюент Е HgCl₂ (10 ммоль) в водном этандиоле (33) содержащем ацетат натрия (50 ммоль), рН 4,5; непрерывное элюирование.

Элюирование каждым из элюентов контролировали путем определения следов A₂₈₀ в элюате после стандартной моно-S (Pharmacia) хроматографии. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Пример 20. Очистка химопапаина.

I) Торговый высушенный в распылительной сушилке латекс Carica Papaya, выпускаемый фирмой Powell Scholefield, Великобритания, перемешивали в течение часа с дистиллированной водой (5 мл). Нерастворимый остаток отделяли путем центрифугирования при 9000 х g в течение 30 мин при 4^oC и отбрасывали, рН надосадочной жидкости устанавливали равным 1,8 путем добавления соляной кислоты (1 М) в течение 20 мин. Перемешивание продолжали при 4^oC в течение 60 мин и при необходимости корректировали рН до указанной величины.

II) Смесь центрифугировали при 9000 х g в течение 30 мин при 40^oC и гранулы отбрасывали.

III) a) pH надосадочной жидкости устанавливали равным 6,8, добавляя к ней по каплям NaOH (5 M) в течение 10 мин. При этом раствор окрашивался в фиолетово-синий цвет.

b) Полученный фиолетово-синий раствор подвергали диализу в 10 объемов "рабочего" буфера (фосфат натрия, 50 ммоль); ЭДТА (1 ммоль); этандиол (33), рН 6,8, трижды меняя буферный раствор. Диализат центрифугировали при 4000 х g в течение 10 мин и устанавливали содержание белка в надосадочной жидкости после декантации, содержащей химопапаин, равным примерно 30 мг/л. Раствор химопапаина активировали путем добавления к нему цистеина до конечной концентрации 4 ммоль и оставляли стоять на 15 мин при 0^oC.

IV) Активированный раствор химопапаина пропускали через колонку с 8 мл ЕСН-сефарозы^R, связанной с L-Ala-L-Phesc (полученной таким образом, как это описано в примере 10), предварительно переведенной в равновесное состояние с помощью рабочего буфера, со скоростью 96 мл/cм²/ч. Колонку затем промывали последовательно рабочим буфером (взятом в количестве, равном двойному объему геля в колонке), водным раствором цитрата натрия (50 ммоль) в этандиоле (33 ), рН 4,5 (взятый в количестве, равном двойному объему геля в колонке) и водным раствором ацетата натрия (50 ммоль); ЭДТА (25 ммоль); мерсалил (10 ммоль) в этандиоле (33), рН 4,5 (взятом в количестве, равном двойному объему геля в колонке) и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч.

V) Химопапаин элюировали водным раствором ацетата натрия (50 ммоль), содержащим мерсалил (10 ммоль) (взятым в количестве, равном тройному объему геля в колонке), отбирая фракции по 4 мл, ферментную активность в отобранных фракциях элюата определяли, измеряя его удельную активность по отношению к BAPNA вышеописанным образом.

Активные фракции объединяли и подвергали дальнейшей очистке с помощью катионообменной хроматографии на колонке, заполненной моно-SHR^R 10/10 (Pharmacia), осуществляя элюирование "начальным" фосфатным буфером с содержанием Na⁺ (50 ммоль); ЭДТА (1 ммоль), Na₃ (0,01%) и рН 7,2 и "конечным" фосфатным буфером с содержанием Na⁺ (800 ммоль); ЭДТА (1 ммоль); NaN₃ (0,001) и рН 7,2. Элюирование проводили при градиенте соли 2,7 ммоль/мл и скорости протока 2 мл/мин. Отбирали фракции по 4 мл и определяли в них концентрацию белка по поглощению при 280 нм и ферментную активность по гидролизу BAPNA.

Фракции, содержащие химопапаин, объединяли и подвергали их диализу в дистиллированную и деионизированную воду или в водный раствор ЭДТА (1 ммоль), а затем сублимационной сушке для хранения в таком виде.

Пример 21. Очистка химопапаина. Результаты анализа BAPNA.

I) Торговый латекс высушенной в распылительной сушилке Carica Papaya (1 г), выпускаемый Powell Scholefield, Великобритания, перемешивали в воде (5 мл) в течение 60 мин при 20^oC. Нерастворимый остаток отделяли путем центрифугирования при 9000 x g в течение 30 мин при 4^oC и отбрасывали, рН надосадочной жидкости устанавливали равным 1,8, добавляя к ней по каплям соляную кислоту (1 М) в течение 20 мин. Смесь перемешивали в течение 15 мин при 4^oC, контролировали через 5 мин его величину и при необходимости корректировали.

II) Выпадающий осадок отделяли путем центрифугирования при 9000 х g в течение 30 мин при 4^oC.

III) a) pH надосадочной жидкости устанавливали равным 7,0 путем добавления по каплям при перемешивании водного раствора гидроксида натрия (5 М). Выпадающий осадок отделяли путем центрифугирования при 9000 х g в течение 30 мин при 4^oC.

b) Надосадочную жидкость пропускали через колонку, заполненную катионообменной смолой моно-SHR 10/10 (Pharmacia), предварительно переведенную в равновесное состояние водным раствором Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (50 ммоль Na⁺), содержащим ЦДТА (1 ммоль) и имеющим рН 7,2 (буфер А). После этого колонку промывали буфером А (скорость пропускания 2 мл/мин) до тех пор, пока величина А₂₈₀ снова не становилась равной 0. Затем через нее пропускали Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ с градиентом от 2,7 ммоль Na⁺/мл до 0,80 М Na⁺, отбирая фракции по 4 мл. Фракции, активные по отношению к BAPNA, объединяли и добавляли к ним этандиол в таком количестве, чтобы концентрация его в конечном счете равнялась 33 об. Все остальные фракции, включая и активные по отношению к BAPNA, которые собирались на последней стадии элюирования (0,47 0,59 MNa⁺) c пиком протеиназы III папайи, отбрасывали.

IV) Колонку, заполненную ЕСН-сефаразой^R, связанной с L-Ala-L-Phesc (объем слоя 15 мл), полученной, как это описано в примере 10, промывали водным раствором NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (50 ммоль Na⁺), содержащим ЭДТА (1 ммоль) в этандиоле (33 об. ), рН 6,8 (рабочий буфер) при скорости пропускания 39 мл/ч/см²). Объединенные фракции, содержащие химопапаин (см. выше), активировали путем добавления цистеина в виде свободного основания (конечная концентрация 4 мМ) и оставляли стоять на 15 мин при 0^oC, после чего пропускали их через колонку, через которую затем пропускали 60 мл рабочего буфера.

V) После этого через колонку пропускали ацетатно натриевый буфер (50 ммоль) рН 4,5, содержащий HgCl (10 ммоль, 45 мл), отбирая фракции по 5 мл. В отобранных фракциях определяли активность по отношению к BAPNA.

Фракции с пиком активности, удерживающиеся в колонке и элюируемые буфером, содержащим HgCl, объединяли и снова пропускали через колонку, заполненную моно-S. Колонку затем промывали буфером А, после чего пропускали через нее буфер А, содержащий цистеин в виде свободного основания (4 ммоль) в количестве, равном семикратному объему слоя смолы. Пропускание прерывали на 30 мин, чтобы обеспечить возможность вытеснения ртути из фермента, после чего снова возобновляли и еще раз промывали буфером А перед пропусканием через колонку NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ c градиентом Na⁺ до 0,80 М вышеописанным образом. Фракции, активные по отношению к BAPNA, объединяли, добавляли к ним цистеин в виде свободного основания (конечная концентрация 4 ммоль) и оставляли стоять на 15 мин при 0^oC.

В колонку загружали смолу Chelex (Bio-Rad, Великобритания, 0,5 м) и промывали ее буфером А. Объединенные фракции, содержащие химопапаин, пропускали через заполненную Chelex'ом колонку и выходящий из нее раствор подвергали диализу в водный раствор ФЭДТА (1 ммоль), а затем высушивали методом сублимационной сушки.

Эффективность очистки химопапаина иллюстрируется данными табл. 2.

Пример 22. Получение специфических к химопапаину ИгГ антител, инициированных у кроликов.

Чистый химопапаин, полученный как это описано в примере 21, перед использованием по методу, описанному Zucker'ом и др. (1985) (см. цитированную выше работу), карбоксиметилировали в мягких условиях. Антисыворотку по отношению к химопапаину инициировали у кролика путем внутримышечного введения 360 мкг карбоксиметилированного белка в полном адъюванте Фройнда, через две недели после подкожного введения 100 мкг в неполном адъюванте. ИгГ подвергали частичной очистке от сыворотки путем фракционирования с помощью сульфата аммольония, описанного Heide и Schwick (1978) (см. цитированную выше работу), после чего проводили диализ в водный раствор фосфата натрия (10 ммоль), содержащий NaC (0,14 M), pH 7,3.

Пример 23. Очистка химопапаина и иммольунологический количественный анализ химопапаина и PPIV.

I III) Торговый высушенный в распылительной сушилке латекс Carica papaya (1 г), выпускаемый фирмой Powell Scholefield, Великобритания, обрабатывали и подвергали обработке при рН 1,8, как это описано в примере 21 (I IIIa).

IV) Колонку, заполненную (объем слоя 15 мл) ЕСН-сефарозой^R, связанной с L-Ala-L-Phesc (приготовленной по методике, описанной в примере 10), промывали, как это описано в примере 21 (IV). Полученную в конечном счете после обработки при рН 1,8 надосадочную жидкость подвергали диализу в водный раствор NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (50 ммоль Na⁺), содержащий ЭДТА (1 ммоль) в этандиоле (33 об.) рН 6,8 (рабочий буфер), центрифугировали при 4000 х g в течение 10 мин и активировали путем добавления дитиотреитола (конечная концентрация 2 ммоль) в течение 20 мин при 20^oC. Затем ее пропускали через колонку аффинной хроматографии (39 мл/c/см²), после чего через колонку пропускали 60 мл рабочего буфера. После этого через колонку пропускали цитратно натриевый буфер (50 ммоль), рН 4,5, содержащий ЭДТА (1 ммоль) и метилпиридилдисульфид (30 ммоль, 15 мл) (полученный по методике, описанный Jalih и др. Biochem. J. 1987, 247, 181 193). Пропускание прекращали и содержащий дисульфид буфер оставляли в колонке на ночь (18 ч) при 20^oC.

V) Проток через колонку возобновляли, пропуская через нее 45 мл того же буфера, содержащего метилпиридилсульфид, а затем 30 мл рабочего буфера и отбирали фракции по 5 мл.

Отобранные фракции анализировали на активность по отношению к BAPNA. Фракции с пиком активности, удерживающиеся в колонке и элюирующиеся содержащим метилпиридилдисульфид буфером, объединяли и пропускали через колонку, заполненную сефадексом^R LH-20 (Pharmacia) (объем слоя смолы 80 мл) (40 мл/ч/cм²), предварительно переведенным в равновесное состояние с помощью водного раствора ЭДТА (1 ммоль) в этандиоле(33 об.). Хроматографическое разделение продолжали, пропуская через колонку 300 мл того же буфера и отбирая фракции по 8 мл, которые контролировали с помощью DA₂₇₁ и определяли в них активность по отношению к BAPNA.

Фракции, обнаруживающие пик активности по отношению к BAPNA (за которым следует еще один пик с A₂₇₁), объединяли и пропускали их через катионообменную колонку, заполненную смолой моно-SHR 10/10, проводя дальнейшую обработку таким же образом, как это описано в примере 21 (IIIb). Фракции, обнаруживающие активность по отношению к BAPNA, объединяли.

Высушенный в распылительной сушилке латекс и материал, полученный после обработки при рН 1,8, аффинной и катионообменной хроматографии, анализировали на наличие PPIV методом простой радиальной иммунодиффузии (см. выше). Этот же метод использовали для определения химопапаина в моноспецифических по отношению к химопапаину антителах, инициированных у кроликов, полученных по методике, описанной в примере 22. Для построения калибровочной кривой использовали химопапаин, очищенный с помощью вышеописанных методов и не содержащий (по данным простой радиальной иммунодиффузии) PPIV и PPIII. Полученные результаты приведены в табл. 3.

Пример 24. Испытание химопапаина на аллергию.

Было приобретено 40 образцов человеческой сыворотки у ЗМ Diagnostica Systems США, уже подвергнутых коммерческим испытаниям, известным под названием "химофаст", для ИгГ против выпускаемой торговой фирмы химопапаина химодиактин^R. 20 из этих сорока образцов по данным испытаний указанным методом были положительными, а 20 отрицательным. Все указанные образцы были получены "слепыми" и были испытаны на естественно приобретенные ИгГ антитела против химодиактина^R, PPIII и PPIV и очищенного химопапаина (очищенного редлагаемым способом и не содержащего по данным простой радиальной иммунодиффузии PPIV и PIII) методом модифицированного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) c использованием биотинавидиновой системы по следующей схеме:
Тетрационные микропланшеты с покрытием из:
Испытываемых антигенов

Испытываемой сыворотки

Моноклонального античеловеческого ИгЕ

Биотинилированного кроличьего

Антимышинного Иг

Авидин-пероксидазного комплекса

Субстрата (АВТ)

Прекращение и измерение А₄₁₀
Использовали химодиактин^R с неистекшим сроком годности, PPIV очищали описанным в настоящем заявке методом, a PPIII методом, описанным Buttle и Barret (1984) (см. цитированную выше работу). Все антигены перед использованием инактивировали путем мягкого карбоксиметилирования иодуксусной кислотой (10 ммоль) по методу, описанному Buttle и Barret (1984) (см. цитированную выше работу).

На лунки титрационного микропланшета наносили покрытие из испытываемого антигена путем инкубации каждой лунки со 100 мкл антигена (10 мг/мл) в карбонатно-натриевом буфере (0,05 М, рН 9,6). Для снижения неспецифического связывания на последующих стадиях использовали донорную лошадиную сыворотку (4%). После инкубации с испытываемой сывороткой (разбавление 1/20 в PBS (0,1 Tween, 2 лошадиная сыворотка, 10 ммоль ЭДТА, 50 мкг/мл гепарин; рН 7,2 (100 мкл/лунку) при 37^oC в течение 4 ч лунки выдерживали в течение 3 ч при 37^oC с моноклональным античеловеческим ИгЕ (полученным по методике, описанной Kemeny Pichard в J. Immunol. Methods (1988), 108, 105; 1 мкг/мл, 100 мкг/лунку и затем в течение ночи при комнатной температуре с биотинилированным кроличьим антимышинным иммуноглобулином (выпускаемым фирмой Dakopatts, Дания; 1 мкг/мл, 100 мкл/лунку). После этого лунки инкубировали в течение 30 мин при 37^oC с авидинпероксидазой (10 мкг/мл, 100 мкг/лунку), добавляли субстрат [2,2-азинобис(3-этилбензтиазолинсульфоновая кислота), ABTS, 0,5 мг/мл] в буфере (100 ммоль лимонная кислота, 200 ммоль Na₂HPO₄, pH 4,2, активация 1 мкл/мл H₂O₂) и выдерживали их при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращали путем добавления 100 мкл/лунку, 100 ммоль лимонной кислоты, 0,01 NaNO₃ и измеряли абсорбцию для каждой лунки при 410 нм с помощью планшет-ридера Micro Elisa (Dynaatech). Одновременно анализировали стандарты ИгЕ в интервале концентраций 0,075 4,8 нг/мл (2,4 нг ИгЕ эквивалентен одной международной единице ИгЕ). Для расчета концентраций ИгЕ против каждой из четырех антигенных композиций: химодиактина^R, PPIII, PPIV и химопапаина, полученного по способу в соответствии с примером 23, использовали программу Enzfitter (Leatherbarrow, R.I. 1985, Enzfitter для IBM PC, Elsevur Biosoft, 68 H//s Road Кэмбридж СВ2 1 А, Великобритания).

26 из 40 испытанных образцов сыворотки содержали ИгЕ антитела против химодиактина. Значения, полученные для PPIII, PPIV и химопапаина для 12 образцов, обладающих наибольшей активностью по отношению к химодиактину^R, приведены в табл. 4. Средние значения и стандартные ошибки рассчитаны из 9 определений.

Из приведенных данных видно, что лишь в двух из этих двенадцати образцов сыворотки, содержащих антитела против химодиактина, антихимопапаин дает основную ИгЕ реакцию, и антитела против PPIII и PPIV ответственны за примерно 75 обнаруженного ИгЕ.

Пример 25. Ингибирование смесей химопапаина и PPIV куриным дистатином.

Химопапаин очищали таким образом, как это описано в примере 23, и стандартизировали путем титрования активных центров реагентом Е-64, используя BAPNA в качестве субстрата (Zucker и др. 1985, Biochem. Biophys. Acta, 828, 196 204). PPIV, очищенный вышеописанным способом, также титровали реагентом Е-64 (по модифицированной методике с использованием азоказеина в качестве субстрата).

Куриный цистатин в виде формы 2 очищали по методике, описанной Anastasi и др. Biochem J. 1983, 211, 129 138, и стандартизировали путем титрования папаином, предварительно оттитрованным реагентом Е-64.

Анализ на гидролиз азоказеина проводили по методу Rowan'a и др. 1988 (см. цитированную выше работу), с той разницей, что перед добавлением субстрата ферменты и ингибитор выдерживали в течение 15 мин при 40^oC.

Брали две партии пробирок по 9 штук в партии в каждую пробирку помещали по 125 мкл 0,40 М фосфатного буфера, содержащего 4 ммоль ЭДТА и 16 ммоль цистеина в виде свободного основания, рН 6,8. После этого в пробирки добавляли химопапаин и PPIV в различных соотношениях в таком количестве, чтобы концентрация протеиназы в конечном счете составляли 100 нМ. В пробирки из одной партии добавляли куриный цистеин до конечной концентрации 1 мкМ, а в пробирки другой партии такой же объем воды. Пробирки затем подвергали проинкубации и анализировали их содержимое на гидролиз азоказеина.

Влияние куриного цистатина на гидролиз азоказеина, вызываемой смесями указанных ферментов, выражали в процентах ингибирования активности, обусловленной теми же смесями ферментов, но в отсутствии цистатина. Полученные результаты приведены в табл. 5.

Из приведенных результатов видно, что степень ингибирования куриным цистатином обратно пропорциональна концентрации PPIV.

Пример 26. Очистка химопапаина путем кислотного осаждения при рН 2,2 - 1,2.

I) Коммерческий высушенный методом распылительной сушки латекс Carica papaya, выпускаемый фирмой Powell Scholefield, Великобритания, разводили дистиллированной водой до концентрации 20 мас. и перемешивали в течение часа. Нерастворимый остаток удаляли путем центрифугирования при 9000 х g в течение 30 мин при 4^oC и отбрасывали, а рН надосадочной жидкости снижали путем добавления по каплям при перемешивании при 4^oC соляной кислоты (1 М) со скоростью 40 мкл/мин/мл рН смеси непрерывно контролировали с помощью комбинированного электрода (Туре GK 240IC), откалиброванного по стандартным буферным растворам с рН 4,01 и 1,09 (Radiometer, 25^oC). При рН 2,2 и с интервалами 0,2 единицы рН ниже этой величины до рН 1,2 добавление кислоты прекращали и поддерживали соответствующее рН постоянным при 4^oC, продолжая перемешивание. Аликвотную часть (эквивалентную 10 мл исходного раствора) раствора отбирали и хранили, а к оставшемуся раствору продолжали добавлять кислоту до снижения следующего значения рН.

II) Все отобранные пробы подвергали центрифугированию при 9000 х g в течение 30 мин при 4^oC и нерастворимый остаток отбрасывали.

III) pH надосадочной жидкости всех проб устанавливали равным 6,8, добавляя к ним по каплям (400 мкл/мин) раствор NaOH (1 M). Все пробы еще раз центрифугировали при 9000 х g в течение 30 мин для удаления выпадающего осадка.

В следующем опыте кислотное осаждение при рН 1,8 проводили при 25^oC.

Полученные в конечном счете пробы надосадочной жидкости анализировали на активность по отношению к BAPNA и на содержание PPIV и химопапаина в соответствии с изобретением методом вышеописанной простой радиальной иммунодиффузии. Приведенные в табл. 6 результаты свидетельствуют о том, что кислотное осаждение при рН 1,8 при 4^oC позволяет снизить содержание PPIV до менее 0,1 от общего содержания белка, а осаждение при рН 1,8 при 25^oC до менее 0,5%
Пример 27. Получение моноспецифичных ИгГ антител, инициированных в овцах.

Чистый химопапаин, полученный по методу, описанному в примере 21, перед использованием карбоксиметилировали в мягких условиях по методу, описанному Zucker и др. 1985 (см. цитированную выше работу), и подвергали диализу в водный раствор фосфата натрия (10 ммоль), рН 7,3, содержащий NaCl (0,14 M). Антисыворотку против химопапаина инициировали в овце путем внутримышечной инъекции 100 мкг карбоксимаетилированного белка в полном адъюванте Фройнда и повторной инъекции через месяц таким же образом 50 мг. ИгГ подвергали частичной очистке путем фракционирования с помощью сульфата аммония, как это описано Heide и Schwiek (1978) (cм. цитированную выше работу), после чего проводили диализ в водный раствор фосфата натрия (10 ммоль), содержащий NaCl (0,14 M), pH 7,3.

Препараты ИгГ антител против папаина, протеиназы III папайи и протеиназы PPIV папайи готовили таким же образом.

Индивидуальные карбоксиметилированные антигены по отдельности иммобилизировали в соответствии с прилагаемыми инструкциями на колонках, выпускаемых под названием Zetaffinity фирмой Anachem, переведенных в равновесное состояние путем обработки водным раствором фосфата натрия (10 ммоль) рН 7,3, содержащим NaCl (0,14 М). Возможные загрязнения или антитела, дающие перекрестные реакции, отделяли из препаратов ИгГ путем абсорбции, для чего препараты пропускали через колонку. Полученные в результате препараты ИгГ давали реакцию осаждения со своим соответствующим антигеном и в то же время не давали перекрестной реакции осаждения с другими антигенами. Регенерацию колонки с осажденным на ней антигеном для повторного использования осуществляли с помощью водного раствора диэтиламина (0,05 М) рН 11,5, после чего ее сразу же переводили в равновесное состояние путем обработки фосфатным буфером.

В результате получали моноспецифичные препараты ИгГ антител против химопапаина, PPIII, PPIV и папаина, которые можно было использовать для количественного определения каждого из антигенов с помощью вышеописанного метода простой радиальной иммольунодиффузии.

Пример 28. Очистка химопапаина кислотным осаждением при рН 1,5.

I) Коммерческий высушенный методом распылительной сушки латекс Carica papaya (20 г), выпускаемый фирмой Siebels, США, перемешивали в течение 60 мин при 0^oC в деионизированной дистиллированной воде (предварительно охлажденной до 4^oC; 250 мл), рН смеси устанавливали равным 1,5 путем добавления HCl (1 н.) cо скоростью 1 мкл/мин/мл и непрерывно контролировали его величину с помощью комбинированного электрода Radiometer (тип GK 4201 C), откалиброванного по стандартным буферным растворам рН 4,01 и 1,9 (Radiometer, 25^oC). После достижения рН 1,5 раствор выдерживали в течение 10 мин для стабилизации рН, корректируя при необходимости его величину.

II) Смесь центрифугировали при 12000 х g в течение 30 мин при 4^oC и осадок отбрасывали,
III) a) pH надосадочной жидкости устанавливали равным 7,0 путем добавления к ней раствора NaOH (1 M) со скоростью 10 мкл/мин/мл непрерывно, контролируя при этом его величину с помощью электрода Radiometer, откалиброванного по стандартному буферу рН 7,0 (Radiometer, 25^oC). После достижения рН 7,0 раствор выдерживали в течение 10 мин для стабилизации рН, корректируя при необходимости его величину. Смесь затем центрифугировали при 12000 х g в течение 30 мин при 4^oC и осадок отбрасывали.

b) Надосадочную жидкость подвергали диализу при 4^oC в 30 об. деионизированной и дистиллированной воды, которую дважды сменяли с интервалами 12 ч.

Диализат подвергали очистке с помощью катионообменной хроматографии на S-сефарозе высокого разрешения в колонке 35/100 (Pharmacia). B один прием использовали не более 3 г белка (анализ по А₂₈₀). Колонку предварительно переводили в равновесное состояние с помощью водного раствора ЭДТА (1 ммоль) при 4^oC. После пропускания через колонку пробы ее промывали водным раствором ЭДТА (1 ммоль) до тех пор, пока А₂₈₀ вновь не принимало значение, равное нулю.

После этого через колонку пропускали раствор с градиентом К⁺ от 0,175 мМ до 0,5 М, отбирая фракции по 25 мл Фракции с пиком поглощения анализировали на активность по отношению к BAPNA.

Фракции, содержащие химопапаин с максимальной удельной активностью по отношению к BAPNA (элюировавшиеся при концентрации К⁺ 0,17 0,22 М) объединяли. Объединяли фракции подвергали диализу при 4^oC в 30 об. деионизированной и дистиллированной воды, которую сменяли 5 раз с интервалами 12 ч. Диализат высушивали методом сублимационной сушки и хранили при -20^oC.

Описанную процедуру очистки повторяли несколько раз. Содержание химопапаина в соответствии с изобретением, папаина, PPIII, PPIV определяли с помощью вышеописанной методики простой радиальной иммольунодиффузии и антител, продуцированных в овце, как это описано в примере 27. Определение активности по отношению к BAPNA и титрование активных центров иодуксусной кислотой осуществляли с помощью BAPNA по вышеописанной методике N 1. Эффективность очистки иллюстрируется средними значениями, приведенными в табл. 7.

Пример 29. Очистка химопапаина методами кислотного окисления при рН 1,5 и аффинной хроматографии.

I III) Коммерческий высушенный методом распылительной сушки латекс Carica papaya (50 г), выпускаемый фирмой Siebels, США, препарировали и подвергали кислотной обработке при рН 1,5 таким же образом, как это описано в примере 28 (I III). Надосадочную жидкость подвергали диализу при 4^oC в 30 объемов деионизированной и дистиллированной воды, которую дважды сменяли с интервалами 12 ч.

IV) Колонку, заполненную ЕСН-сефарозой^R, связанной с L-Ala-L-Phesc (объем слоя 350 мл; получение сефарозы осуществлялось таким же образом, как это описано в примере 10), переводили в равновесное состояние путем обработки в течение ночи водным раствором этандиола (33 объемн.), содержащим ацетат натрия (50 мМ), с рН 4,5 и затем водным раствором NaH₂PO₄/Na₂HPO₄ (50 мM Na⁺), содержащим ЭДТА (1 мМ), в этандиоле (33 объемн.) с рН 6,8 (рабочий буфер).

Полученный после диализ надосадочной жидкости диализат (см. выше) фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и добавляли к фильтрату этандиол до концентрации 33 объемн. Проверяли рН раствора и при необходимости устанавливали его равным 7,0. Затем добавляли к нему свежеприготовленный раствор L-цистеина (200 мМ) до концентрации 4 мМ, хорошенько перемешивали, выдерживали в течение 15 минут при 4^oC и пропускали через колонку аффинной хроматографии при 4^oC со скоростью до 40 мл/ч/см². Колонку промывали рабочим буфером, взятым в количестве, равном 10 объемам слоя адсорбента.

V) Химопапаин элюировали водным раствором HgCl₂ (10 мМ) в этандиоле (33 объемн. ) содержащим ацетат натрия (50 мМ), с рН 4, взятым в количестве, равном трехкратному объему слоя адсорбента, и собирали фракции по 25 мл, фракции, проявляющие активность по отношению к BAPNA, объединяли и подвергали дальнейшей очистке с помощью катионообменной хроматографии на колонке 35/100, заполненной S-сефарозой высокого разрешения (Pharmacia).

Колонку предварительно обрабатывали водным раствором ЭДТА (1 мМ) при 4^oC, после чего пропускали через нее исследуемую пробу и промывали водным раствором ЭДТА (1 мМ) со скоростью 10 мл/мин до тех пор, пока А₂₈₀ снова не принимал значение, равное нулю. После этого через колонку пропускали водный раствор K₂HPO₄/KH₂PO₄ (50 мМ К⁺) c pH 7,2, содержащий ЭДТА (1 мМ) и L-цистеин (500 мМ), взятый в количестве, равном трехкратному объему слоя адсорбента. Пропускание раствора прекращали на 30 минут, после чего через колонку пропускали еще такое же количество свежеприготовленного цистеинового буфера и прекращали пропускание на 30 минут. Колонку затем промывали цистеиновым буфером, взятым в количестве, равном шести объемам слоя адсорбента, после чего переводили в равновесное состояние путем обработки водным раствором K₂HPO₄/KH₂PO₄ (50 мМ К⁺), содержащим ЭДТА (1 мМ), с рН 7,2.

Затем через колонку пропускали раствор с концентрацией К⁺, изменяющейся от 0/175 мМ до 0,5 М, собирая фракции по 25 мл. Фракции с хроматографическим пиком анализировали на активность по отношению к BAPNA. Первый пик, появляющийся при концентрации К⁺ в элюенте 0,2 0,25 М, отвечал химопапаину. Второй пик, появляющийся при концентрации К⁺ в элюенте примерно 0,45 М, отвечал протеиназе III папайи.

Фракции, содержащие химопапаин с максимальной удельной активностью объединяли и подвергали диализу при 4^oC в 30 объемов деионизированной и дистиллированной воды, которую сменили пять раз с интервалами в 12 часов.

Химопапаин, элюированный из катионообменной колонки, активировался цистеиновым буфером и по тому, становился чувствительным к инактивации за счет окисления. Для предотвращения или уменьшения вероятности инактивации активного фермента за счет окисления содержащие его фракции заливали в пробирки с суспензией тетратионата натрия (200 мМ) таким образом, чтобы конечная концентрация NaS₄O₆ в каждой фракции равнялась 5 мМ. По другому варианту объединенные фракции, содержащие химопапаин, подвергали диализу в атмосфере азота в воду, очищенную от кислорода путем пропускания через нее в течение 30 минут азота со скоростью 0,1 л/мин.

Полученный диализат подвергали сублимационной сушке и хранили при -20^oC.

Описанную процедуру очистки повторяли несколько раз. Эффективность очистки, контролировавшаяся с помощью анализа, проводившегося, как это описано в примере 28, иллюстрируется средними значениями, приведенными в таблице 8.

ПРИМЕР 30.

Очистка химопапаина путем кислотного осаждения при рН 1,5 и аффинной хроматографии
I III) Коммерческий высушенный методом распылительной сушки латекс Carica papaya, выпускаемый фирмой Siebels, США, препарировали и подвергали кислотной обработке при рН 1,5, диализу и катионообменной хроматографии на S-сефарозе^R таким же образом, как это описано в примере 28.

IV) Фракции, содержащие химопапаин с максимальной удельной активностью по отношению к BAPNA, объединяли и добавляли этандиол до концентрации 33 объемн. После этого к объединенным фракциям добавляли свежеприготовленный водный раствор L-цистеина (200 мМ) до концентрации 4 мМ пропускали их через колонку, заполненную ЕСН-сефарозой^R, связанной с L-Ala-L-Phesc, как это описано в примере 29 (IV).

V) Химопапаин элюировали водным раствором HgCl₂ (10 мМ) в этандиоле (33 объемн. ), содержащем ацетат натрия (50 мМ), с рН 4,5; взятым в количестве, равном 3 объемам слоя адсорбента, и собирали фракции по 25 мл. Фракции, проявляющие активность по отношению к BAPNA, объединяли и подвергали диализу при 4^oC в 30 объемов деионизированной и дистиллированной воды, которую сменяли 5 раз с интервалом в 12 часов. Диализат подвергали сублимационной сушке и хранили при -20^oC.

Эффективность очистки (контролировавшаяся как это описано в примере 28) иллюстрируется данными таблицы 9.

ПРИМЕР 31.

Два препарата химопапаина в соответствии с настоящим изобретением анализировали в один и тот же день с помощью анализа BAPNA по методикам NN 1 и 2. Содержание белка определяли по общему сухому весу проб. Препарат химопапаина А был получен в результате очистки по методике в соответствии с примером 28. Препарат химопапаина В был получен в результате очистки по методике в соответствии с примером 29 (последние фракции, собранные в тетратионате натрия). Каждое определение повторяли трижды. Полученные результаты приведены в таблице 10.

ПРИМЕР 32
Химопапаин, очищенный, как это описано в примере 29 и подвергнутый диализу в атмосфере азота вышеописанным образом, высушивали методом сублимационной сушки и хранили при -20^oC. Приготовленный таким образом химопапаин имел удельную активность по отношению к BAPNA (1 мМ) при 37^oC и рН 6,0, равную 1345 единицам на мг.

Для приготовления 100 пузырьков с композицией, содержащей химопапаин, готовили 43,75 г исходного раствора нижеописанным образом. Температуру этого раствора в процессе работы с ним поддерживали равной 4 12^oC.

Моногидрат L-(+)-цистеин гидрохлорида (166 мг) добавляли к примерно 30 г воды для инъекций с таким расчетом, чтобы в итоге получить концентрацию 22 мМ. рН раствора с помощью NaOH (1 M) или HCl (0,1 M) устанавливали равным 5,0 5,5. Приготовленный раствор цистеина добавляли к очищенному химопапаину (358 мг) таким образом, чтобы в конечном счете получить концентрацию 10000 ед./мл рН перемешиваемого раствора с помощью NaOH (1 M) или HCl (0,1 М) устанавливали равным 5,9 6,1 и доводили водой для инъекций до общего количества 43,75 г. Приготовленный раствор стерилизовали, пропуская его последовательно через два фильтра с диаметром пор 0,2 мкм. По 0,4 г раствора заливали в 100 стеклянных пузырьков емкостью по 5 мл. Пузырьки закупоривали пробкой, воду удаляли путем сублимационной сушки при пониженном давлении и пузырьки с лиофилизированным продуктом герметизировали в вакууме.

В каждом пузырьке находился белый аморфный порошок, содержавший 3,27 мг химопапаина и 1,52 мг цистеинат натрия гидрохлорида (номинальная активность 4000 единиц, 8 мкмолей соответственно, при допустимом избытке 10%). Композицию восстанавливали непосредственно перед использованием путем добавления к содержимому пузырька 2 мл воды для инъекций. В результате получали готовый для инъекций раствор, номинально содержащий 4000 единиц химопапаина и 4 мМ L-цистеина.

Формула изобретения

1. Способ доочистки химопапаина, заключающийся в приготовлении исходного раствора химопалаина и пропускании неочищенного раствора через колонку с матрицей аффинной хроматографией, направленной на его активный центр, включающей подложку, ковалентно связанную через спейсорную группу с N-концом обратимого химопапаинингибиторного пептида, у которого С-концевая аминокислота является производной фенилаланина, аланина, циклогексиаланина или лейцина, и связанного с активным сайтом химопапаина более прочно, чем с активным сайтом РРIV, причем указанный пептид присоединен к активному центру молекулы химопапаина, и элюировании подходящим элюентом или сначала осуществляют кислотное осаждение химопапаина при рН 1,2 1,8 из исходного раствора его, отделение примесных ферментов, нейтрализацию полученного раствора и обессоливание его при необходимости диализом, а затем пропускание через колонку с указанной матрицей аффинной хроматографии, элюирование химопапаина подходящим элюентом, объеднение активных фракций, диализ и сушку замораживанием.

2. Способ по п.1, заключающийся в том, что указанной С-концевой аминокислотой является D- или L-фенилаланин-семикарбазон, D- или L-фенилаланин-метоксиимин, D- или L-фенилаланин-оксим, D- или L-аланин-семикарбазон, D- или L-циклогексиаланин-семикарбазон или D- или L-лейцин-семикарбазон.

3. Способ по п.1, заключающийся в том, что обратимый химопапаинингибиторный пептид выбран из L Ala L РheSc, L Аla D - РheSc, L Phe D РheSc, L Рhе L РhеМо, L Рhе L РheOx, L Туr L РhеSc, L Аlа L СhaSc и L Аlа L leuSc.

4. Способ по п.1, заключающийся в том, что при доочистке химопапаина из кислотно-осажденного раствора его проводят по меньшей мере в одну стадию катионообменной хроматографии.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9