Штамм aspergillus fumigatus fresenius 4238 - продуцент фумагиллина

 

Штамм Aspergillus fumigatus Fresenius 4238 - продуцент фумагиллина. Область применения: биотехнологическая промышленность.Сущность: штамм-продуцент антибиотика фумагиллина, применяемого для профилактики и лечения нозематоза пчел и амебиаза плотоядных. Штамм хранится в Коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра по антибиотикам под номером ГНЦА 345 А. 1 табл.

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно к производству антибиотиков, и может быть использовано при производстве антибиотика фумагиллина, являющегося продуктом биосинтеза культуры Aspergillus fumigatus Fresenius и применяемого для профилактики и лечения нозематоза пчел и амебиаза плотоядных.

Известен ряд штаммов Aspergillus fumigatus Fresenius продуцентов фумагиллина. В частности, известен штамм Н-3 (NRRL-2319) [1] с уровнем синтеза фумагиллина 170 мкг/мл среды и штамм (NRRL-2436) [2] с уровнем синтеза фумагиллина 157 420 мкг/мл. Недостатком этих штаммов является низкий уровень накопления целевого продукта и одновременное с синтезом фумагиллина образование культурой целого ряда побочных соединений глиотоксина, хинонов и других продуктов.

Наиболее продуктивным из известных штаммов продуцентов фумагиллина является штамм Aspergillus fumigatus Fres 4/3 [3] позволяющий достигать накопления фумагиллина в культуральной жидкости на уровне 256 512 мкг/мл и не синтезирующий одно из побочных соединений токсичный антибиотик глиотоксин.

Характеристика известных штаммов продуцентов фумагиллина представлена в таблице Из этих штаммов в качестве прототипа рассматривается штамм 4/3 как наиболее продуктивный по фумагиллину и не образующий токсичного антибиотика глиотоксина. Однако этот штамм в жидких питательных средах кроме фумагиллина синтезирует большие количества хинонов. Хиноны характеризуются близкой к фумагиллину растворимостью в воде и полярных растворителях и поэтому при переработке культуральной жидкости могут затруднять последующее получение фумагиллина. Кроме того, штамм 4/3 недостаточно продуктивен для рентабельного использования в промышленном производстве фумагиллина.

Сущность изобретения заключается в получении штамма Aspergillus fumigatus Fresenius, отличающегося от штамма-прототипа следующими признаками: во-первых, повышенной продуктивностью по фумагиллину, и во-вторых, неспособностью к синтезу хинонов.

Предлагаемый штамм Aspergillus fumigatus Fresenius 4238 получен путем воздействия мутагенами на конидии штамма 4/3 с последующим поэтапным отбором вариантов, наиболее продуктивных по фумагиллину и характеризующихся сниженным синтезом или отсутствием хинонов. Продуктивность культуры оценивалась по накоплению фумагиллина в культуральной жидкости спектрофотометрическим методом. Наличие хинонов в культуральной жидкости определялось методом тонкослойной хроматографии.

Штамм Aspergillus fumigatus Fresenius 4238 характеризуется более высокой по сравнению со штаммом-прототипом продуктивностью по фумагиллину до 1250 мкг/мл и отсутствием синтеза хинонов.

Штамм Aspergillus fumigatus Fresenius 4238 хранится в Коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра по антибиотикам под регистрационным номером 345А и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологическая характеристика.

На агаризованной среде Чапека культура растет в виде плоской колонии сначала белого, затем темно-оливково-серого цвета с поверхностью от бархатистой до порошистой. Цвет субстрата серо-зеленый. Созревание конидий происходит на 6 9 сутки после посева. Конидиеносцы отходят от погруженных гиф или образуются как очень коротенькие веточки на воздушных гифах. Длина конидиеносцев 300 450 мкм, диаметр 5 8 мкм, конидиеносцы гладкие от бесцветных до нежно-зеленых, постепенно расширяющиеся к верхушке. Головки конидиеносцев обильные, имеют форму колонки длиной 100 400 мкм, от тускло-зеленых до оливково-серых.

Везикулы бутылочной формы, 18 25 мкм в диаметре.

Конидии шаровидные, шероховатые, диаметром 2,5 3,5 мкм.

Стеригмы одноярусные, формируются только в центре апикальной части, занимая не более 2/3 ее, скрученные, располагаются по оси, параллельной оси конидиеносца, длиной 5,5 7,5 мкм, диаметром 2,5 3,0 мкм.

Физиолого-биохимическая характеристика.

Культура утилизирует глюкозу, мальтозу, ксилозу, сахарозу, лактозу, маннит, глицерин, гидролизует крахмал. В качестве азотного питания использует аммиак, азот аминокислот, нитраты, утилизирует азот мочевины. Обладает протеолитической активностью.

Растет в диапазоне рН от 3,0 до 9,0. Оптимальный рН для биосинтеза фумагиллина 6,5 7,0.

Оптимальная температура биосинтеза 271oС.

Для роста требует кислород воздуха.

Продуцирует фумагиллин. Хиноны не продуцирует. Глиотоксин не образует.

Маркерная характеристика.

При тонкослойной хроматографии спиртового экстракта культуральной жидкости штамма в системе толуол, бутилацетат, этиловый спирт (1:1:0,1) после проявления хроматограммы парами иода хиноны не обнаруживаются.

Биотехнологическая характеристика.

В качестве целевого продукта штамм продуцирует фумагиллин. При культивировании на питательной среде состава (%): крахмал 2,0; кукурузный экстракт 2,0; кальций углекислый 0,2, в условиях непрерывного перемешивания и аэрации, соответствующей сульфитному показателю 0,7 0,8 ммоль O2/л.мин, накопление фумагиллина через 120 часов ферментации составляет 780 мкг/мл. При культивировании на питательной среде состава (%): меласса 4,0; соевая мука 2,0; кукурузный экстракт 0,5; натрий азотнокислый 0,5, в условиях непрерывного перемешивания и аэрации, соответствующей сульфитному показателю 0,8 ммоль O2/л.мин, накопление фумагиллина через 120 часов ферментации составляет 1250 мкг/мл.

При более длительном культивировании, сопровождающемся повышением рН до 8,5 9,9, наблюдается снижение содержания фумагиллина в среде.

Хранение штамма.

Хранить штамм рекомендуется в виде лиофильно высушенной культуры в стеклянных запаянных ампулах или в пробирках на скошенном агаре Чапека с периодическими пересевами.

Промышленная применимость штамма Aspergillus fumigatus Fres 4238 при биосинтезе антибиотика фумагиллина иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуру штамма 4238 хранят в лиофизилированном состоянии в запаянных ампулах при температуре 2 4oС. Защитной средой для лиофилизации служит сыворотка бычьей крови. С целью оживления культуры в ампулу заливают 1 мл стерильной воды, производят посев полученной суспензии на скошенный в пробирках агар Чапека и термостатируют их в течение 7 -10 суток при температуре 251oС.

Для приготовления посевного материала культуру, выращенную на агаре Чапека, переносят в колбы с посевной средой следующего состава (%): крахмал - 2,0; кукурузный экстракт 2,0; вода водопроводная остальное; рН 6,3 6,4. Колбы со стерильной посевной средой засевают суспензией конидий штамма 4238, смытых с агара Чапека стерильной водопроводной водой, и выращивают на качалке с 220 240 об/мин при температуре (271)oС в течение 48 часов.

Полученный посевной материал в количестве 4,0% используют для засева ферментационной среды следующего состава (%): крахмал 2,0; кукурузный экстракт 2,0; кальций углекислый 0,2; вода водопроводная остальное; рН 6,2 6,4. Культивирование осуществляют при температуре (271)oС, постоянном перемешивании и аэрации среды, достаточной для достижения сульфитного показателя на уровне 0,8 ммоль O2/л.мин. Длительность культивирования 120 часов. Содержание фумагиллина в культуральной жидкости, определенное спектрофотометрическим способом, составляет 780 мкг/мл.

Результаты тонкослойной хроматографии спиртового экстракта культуральной жидкости в системе толуол, бутилацетат, этиловый спирт в соотношении 1:1:0,1 после проявления хроматограммы парами иода показывают отсутствие хинонов в культуральной жидкости.

Пример 2. Культивирование штамма прототипа Aspergillus fumigatus 4/3 на посевной и ферментационной средах осуществляют согласно изложенному в примере 1. Содержание фумагиллина в культуральной жидкости по окончании ферментации составляет 340 мкг/мл.

Результаты тонкослойной хроматографии спиртового экстракта культуральной жидкости, выполненной аналогично изложенному в примере 1, показывают наличие в культуральной жидкости заметных количеств хинонов.

Пример 3. Хранение культуры штамма 4238, подготовка посевной среды, а также условия и способ выращивания посевного материала с целью засева ферментационной среды аналогичны изложенным в примере 1.

Полученный посевной материал в количестве 4,0% используют для засева ферментационной среды следующего состава (%): меласса 4,0; соевая мука - 2,0; кукурузный экстракт 0,5; натрий азотнокислый 0,5; вода водопроводная остальное; рН 6,2 6,4. Ферментацию осуществляют при температуре (271)oС, постоянном перемешивании и аэрации, достаточной для достижения сульфитного показателя на уровне 0,8 ммоль O2/л.мин. Длительность ферментации 120 час. Содержание фумагиллина в культуральной жидкости, определенное спектрофотометрическим методом, составляет 1250 мкг/мл.

Результаты тонкослойной хроматографии спиртового экстракта культуральной жидкости в системе толуол, бутилацетат, этиловый спирт в соотношении 1:1:0,1 после проявления хроматограммы парами иода показывают отсутствие хинонов в культуральной жидкости.

Пример 4. Культивирование штамма прототипа 4/3 на посевной и ферментационной средах осуществляют согласно изложенному в примере 3.

Содержание фумагиллина в культуральной жидкости по окончании ферментации составляет 490 мкг/мл.

Результаты тонкослойной хроматографии спиртового экстракта культуральной жидкости, выполненной аналогично изложенному в примерах 1 и 3, показывают наличие в культуральной жидкости больших количеств хинонов.

Приведенные данные подтверждают следующие преимущества штамма 4238 перед штаммом прототипом 4/3: повышенную в 2,3 2,5 раза продуктивность по фумагиллину и отсутствие хинонов в культуральной жидкости, отвечая критерию "изобретательский уровень" а также подтверждают, что предложение "промышленно осуществимо".

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения поставленной задачи аналогично заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию "новизна".

Формула изобретения

1 Штамм Aspergillus fumigatus Fresenius 4238. ГНЦА 345 А - продуцент фумагиллина.

РИСУНКИ

Рисунок 1



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается питательной среды для культивирования продуцента цитолитических и пектолитических ферментов, например гриба Aspergillus niger "П"

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству ферментов, и может быть использовано для получения высокоактивной щелочной фосфатазы, применяемой в медицине, генной инженерии, молекулярной биологии

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и касается получения менингококкового адгезина препарата бактериального происхождения, используемого, например, для определения степени адгезии менингококков при их взаимодействии с клетками макроорганизма

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике гонореи
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для накопления клеточной массы с высоким содержанием капсульного вещества при выращивании вакцинных штаммов и при диагностике гемофилезной плевропневмонии свиней

Изобретение относится к микробилогии и может быть использовано для производства бактерийных препаратов из бактерий рода Bacillus, применяющихся в ветеринарии и медицине для профилактики и лечения диарей, дисбактериозов, гнойно-воспалительных и аллергических процессов, а также иных целей, везде где применяются бактерии рода Bacillus

Изобретение относится к микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, пригодного для очистки почвы, пресной и морской воды от нефти и нефтепродуктов в течение 7-14 суток, в широком диапазоне температур 12-30oC

Изобретение относится к медицинской микробиологии и иммунологии, в частности, к разработке, производству и контролю качества живых сибиреязвенных вакцин

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для экспрессной индикации бактериальных средств при возникновении чрезвычайных ситуаций
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, используемых для биологической утилизации формальдегида, а также сопутствующих ему метанола и формиата в сточных водах химических производств (нефтехимзаводы, производства карбамидных смол, пластмасс и т.д.)

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и касается штамма бактерий спорообразующего микроорганизма для контроля эффективности стерилизации изделий медицинского и ветеринарного назначения термическим методом, а именно стерилизации водяным паром

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть, в частности, использовано для моделирования лепрозной инфекции на лабораторных животных
Наверх