Штамм бактерий arthrobacter globiformis - продуцент копропорфирина iii и способ получения копропорфирина iii

 

Использование: биотехнология, микробиологическая промышленность, медицина. Сущность изобретения: предлагается новый штамм бактерий Arthrobacter globiformis ВНИИСХМ-479 - продуцент копропорфирина III и способ получения копропорфирина III, основанный на применении этого штамма, который заключается в том, что указанный штамм культивируют на среде, содержащей глюкозу, двузамещенный фосфорнокислый аммоний, кукурузный экстракт и смесь аминокислот гидролизатных, при 32 - 36^oC и pH 6,8 - 7,2. Для выделения целевого продукта в водорастворимой форме осуществляют последовательное переосаждение копропорфирина III из нативного раствора 5 - 7% и 2,0 - 3,5%-ными растворами соляной кислоты с последующей хроматографией на макропористом анионите с десорбцией раствором аммиака, осаждением копропорфирина III из элюата при подкислении и переводом его в водорастворимую форму экстракцией водой при подщелачивании. Способ основан на применении нового высокопродуктивного штамма и при подобранной совокупности технологических приемов позволяет получать высокоочищенный препарат водорастворимой соли копропорфирина III с чистотой 90 - 96%. 2 с. и 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности и, в частности к технологии получения копропорфирина III.

Задачей данного технического решения явилось получение копропорфирина III в водорастворимой форме, которая может быть использована в медицине для диагностики и лечения рака более эффективно и с меньшими побочными явлениями, чем известные водонерастворимые формы.

В ходе решения поставленной задачи был отобран продуцент, обладающий высокой способностью синтезировать копропорфирин III.

Известен ряд микроорганизмов, способных синтезировать в процессе жизнедеятельности порфирины и, в частности копропорфирин III (патент ФРГ N 2809093, патент США N 4436663). Однако продуктивность их в отношении синтеза копропорфирина III не превышает 100 мг/л.

Наиболее высоким по производительности является штамм Arthrobacter globiformis B-658, который выбран за прототип (авт. св. СССР N 1482946). Штамм образует до 240 мг/л копропорфирина III. Однако продуктивность штамма очень варьирует и может опускаться до 60 мг копропорфирина III в 1 л культуральной жидкости.

Предлагаемый штамм A. globiformis ИНБИ-121 является более продуктивным в отношении синтеза копропорфирина III, и уровень продуктивности, в отличие от прототипа, не подвержен широким колебаниям. Штамм по изобретению получен из штамма B-658 селекционным путем методом ступенчатого отбора по признаку устойчивости к копропорфирину и последующей селекцией на подобранных средах. Штамм по изобретению хранится во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии под N 479 в группе эпифитных микроорганизмов.

СУЩЕСТВЕННЫЕ ПРИЗНАКИ ЗАЯВЛЯЕМОГО ШТАММА ARTHROBACTER GLOBIFORMIS ИНБИ-121, общие с прототипом. Предлагаемый штамм и прототип на плотной питательной среде образуют круглые бесцветные колонии, гладкие с ровным краем, диаметром 1,5 2,0 мм. На сложных средах образуют красный пигмент (копропорфирин III), диффундирующий в агар. Характерен жизненный цикл кокк-палочка-кокк. Строгие аэробы, хемоорганотрофы, используют неорганический азот в качестве единственного источника азота. Восстанавливают нитраты. Не расщепляют целлюлозу. Гидролизуют желатину.

При глубинной ферментации накапливают в культуральной жидкости копропорфирин III.

ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ ПРЕДЛАГАЕМОГО ШТАММА ОТ ИЗВЕСТНОГО (ПРОТОТИПА). Заявляемый штамм отличается от прототипа устойчивостью к копропорфирину III в среде в концентрации 500 800 мг/л. Заявляемый штамм на 10 20% превосходит по уровню биосинтеза копропорфирина III прототип (заявляемый штамм 170 270 мг/л, прототип 60 240 мг/л).

МОРФОЛОГО-КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ. Заявляемый штамм образует на плотной питательной среде бесцветные круглые колонии, гладкие с ровным краем, диаметром 1,5 2,0 мм. На сложных средах образует красный пигмент (копропорфирин III), диффундирующий в агар.

Клетки штамма A. globiformis претерпевают изменения в форме на протяжении ростового цикла, причем изменения эти весьма заметны. Культуры в стационарной фазе (2 7 дней) полностью состоят из кокковидных клеток. В культуре могут встречаться крупные кокковидные клетки, в 2 4 раза больше остальных; в определенных условиях культивирования они могут преобладать. При пересевах на свежую сложную среду рост происходит путем увеличения кокковидных клеток, после чего один или оба конца клетки удлиняются, в результате образуются палочки, толщина которых меньше диаметра кокковидной клетки. Последующий рост и деление ведут к образованию палочек неправильной формы, которые варьируют по величине и могут быть прямыми, изогнутыми, клиновидными и булавовидными, образовывать различные сочетания (V-, T-, L-видные). Истинный мицелий не образуется. По мере прохождения экспоненциальной фазы палочки укорачиваются и в конце концов заменяются кокковидными клетками, которые характерны для стационарной фазы культуры. Эндоспор не образует.

ФИЗИКО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Клетки кокковидной формы штамма по изобретению грамположительны. Однако палочки могут легко обесцвечиваться (грамвариабельны), и грамположительными остаются только гранулы. Некислотоустойчивы. Строгий аэроб, хемоорганотроф, метаболизм дыхательный, никогда не бродильный. Имеет потребность в биотине (5 10 мкг/мл). Использует неорганический азот в качестве единственного источника азота. Восстанавливает нитраты. Не расщепляет целлюлозу. Гидролизует желатину.

Температурный оптимум для роста и развития 30^oC, минимальная температура роста 15 20^oC, выдерживает максимальную температуру 37 - 40^oC.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ ЗАЯВЛЯЕМОГО ШТАММА. Штамм хранится на мясо-пептонном агаре при +4^oC в течение 1 месяца. В виде лиофильно-высушенной культуры и в жидком азоте (-196^oC) с использованием в качестве криопротектора 2,5%-ного раствора желатины с глюкозой, срок хранения штамма до 3 лет.

АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Антагонистических свойств в отношении других микроорганизмов не наблюдали.

Заявляемый штамм не токсичен и не относится к микроорганизмам, обладающим патогенными свойствами.

При глубинной ферментации заявляемый штамм накапливает в культуральной жидкости копропорфирин III.

УСЛОВИЯ ОБРАЗОВАНИЯ КОПРОПОРФИРИНА III. Для получения копропорфирина III штамм культивируют при (29±1^oC) на качалке (180 об/мин) в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава, мас. глюкоза 1,0; кукурузный экстракт 6 8; (NH₄)₂SO₄ 0,1 и вода, pH 7,2. Колбы инокулируют по 5 мл посевного материала, полученного двухступенчатым культивированием в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл (29±1^oC, 180 об/мин), содержащих 100 мл мясо-пептонного бульона.

Для приготовления посевного материала использовали косяки с мясо-пептонным агаром, содержащим биотин в концентрации 5 10 мг/мл. Косяки инокулировали двое суток при (29±1^oC).

В процессе биосинтеза копропорфирина III ежесуточно дозировали глюкозу в количестве 1% на объем культуральной жидкости, а также доводили pH среды до 7,0 7,2 раствором NaHCO₃. Продолжительность культивирования 12 суток. Содержание копропорфирина III 170 270 мг/л (спектрофтометрический метод определения по Falk J. in ("Porphyrins and Metalloporhyrins. Amsterdam Elsevier Co. 1964).

В ходе дальнейшего решения поставленной задачи возникла необходимость разработки оптимальных условий биосинтеза копропорфирина III новым продуцентом.

Наиболее близким по технической сущности является способ биосинтеза порфиринов по авт. св. СССР N 1482946. В указанном изобретении биосинтез копропорфиринов осуществляют культивированием Arthrobacter globiformis ВКМ B-658 на среде, содержащей, мас. глюкоза 0,5 1,5; (NH₄)₂SO - 0,05 0,15; кукурузный экстракт 5 6 или смесь кукурузного экстракта (1 - 6) с молочной сывороткой или гидролизатом оболочек белково-витаминного концентрата (1 3). Культивирование осуществляют при 28 30^oC на качалке при 180 об/мин. Через 48 ч ферментации в колбы ежедневно вносят глюкозу в виде 50%-ного стерильного водного раствора из расчета 1% глюкозы на объем культуральной жидкости, а также доводят pH среды до 7,0 7,2 10%-ным раствором соды. Максимальный выход копропорфиринов составляет при этом 240 мг/л культуральной жидкости. Продолжительность ферментации 12 сут; производительность 5 20 мг/сут.

Недостатком прототипа является нестабильный уровень синтеза копропорфирина III, который может варьировать от 60 до 240 мг в 1 л культуральной жидкости к концу ферментации. Кроме того, в способе биосинтеза по прототипу необходима ежесуточная дозация глюкозы и соды для поддержания оптимальных условий биосинтеза целевого продукта. Предлагаемый способ позволяет повысить производительность процесса биосинтеза и обеспечивает направленный синтез копропорфирина III в условиях стабильного pH без вмешательства извне.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

В качестве продуцента используют штамм Arthrobacter globiformis ИНБИ-121. Для получения копропорфирина III продуцент культивируют на среде следующего состава, мас. глюкоза 8,0; кукурузный экстракт 3,0; (NH₄)₂HPO₄ 0,05 2,0; смесь аминокислот гидролизатных (САГ) 0,2 0,5; вода остальное; pH 6,8 7,2.

Культивирование Arthrobacter globiformis штамм ИНБИ-121 осуществляют в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл при температуре 32 36^oC в аэробных условиях на качалках 180 об/мин в течение 8 10 сут. По окончании ферментации концентрация копропорфирина III составляет 200 300 мг/л культуральной жидкости. Причем на его долю приходится не менее 70% от общего содержания порфиринов в культуральной жидкости.

Таким образом, в состав среды наряду с обычно используемым кукурузным экстрактом вводят смесь аминокислот гидролизатных (САГ) в концентрации 0,2 - 0,5 мас. и двузамещенную аммонийную соль фосфорной кислоты в концентрации 0,05 0,2 мас. Глюкозы вводят в среду перед посевом в концентрации 8% Такой состав ферментационной среды обеспечивает оптимальный для биосинтеза копропорфирина III уровень глюкозы и pH. Это позволяет не проводить дозирования в течение первых 8 сут, которых в условиях используемого температурного режима (32 36^oC), в большинстве случаев, достаточно для достижения максимального уровня синтеза копропорфирина III.

При проведении биосинтеза свыше 8 сут в ферментационную среду вводят глюкозу в виде 50%-ного раствора до концентрации по редуцирующим веществам 2% и при необходимости добавляют 10%-ный раствор соды, до pH 6,8 7,2.

Осуществимость предлагаемого способа биосинтеза копропорфирина III подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Посевной материал Arthrobacter globiformis ИНБИ-121 выращивают в течение двух суток при (29±1^oC) на качалках (180 об/мин) в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащих 100 мл мясо-пептонного бульона.

Для приготовления посевного материала используют косяки с МПА с биотином в концентрации 5 10 мкг/мл. Культуру выращивают двое суток при (29±1)^oC.

Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл в питательной среде (100 мл) следующего состава, мас. глюкоза (по редуцирующим веществам) 8,0; кукурузный экстракт 3,0; (NH₄)₂SO₄ 0,1; САГ - 0,4; вода; pH среды 7,1±0,1.

Длительность ферментации 8 сут при 34^oC на качалке (180 об/ мин). По окончании ферментации содержание копропорфирина III, в культуральной жидкости 260 мг/л; производительность процесса 33 мг/ сутки.

Пример 2. Посевной материал выращивают аналогично примеру 1. Культивирование продуцента осуществляют в колбах вместимостью 750 мл, используя 100 мл питательной среды следующего состава: мас/: глюкоза 8,0; кукурузный экстракт 3,0; (NH₄)₂HPO₄ 0,2; САГ 0,5; вода; pH 6,9±0,1. Культивирование осуществляют при 36^oC, длительность 8 сут.

Содержание копропорфирина в культуральной жидкости на 8 сут составляет 200 мг/л. Производительность процесса 25 мг/сут.

Пример 3. Посевной материал выращивают аналогично примеру 1. В колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл вносят 100 мл питательной среды следующего состава, мас. глюкоза 8,0; кукурузный экстракт 3,0; (NH₄)₂HPO₄ 0,05; смесь аминокислот гидрализатных 0,2; вода; pH 7,0 ±0,1. Культивирование осуществляют при 32^oC на качалках 180 об/мин в течение 10 сут. Через 8 сут культивирования в среду вносят 50%-ный раствор глюкозы до концентрации 2% и подтитровывают pH до 7,0±1,10% -ным раствором соды. Содержание копропорфирина в культуральной жидкости на 10-е сутки составляет 300 мг/л; производительность процесса 30 мг/сут.

Таким образом, предлагаемый способ биосинтеза обеспечивает получение 200 300 мг копропорфирина III в литре культуральной жидкости через 8 10 сут культивирования. Производительность процесса 20 30 мг/сутки.

По окончании культивирования биомассу клеток отделяют центрифугированием и из нативного раствора выделяют копропорфирин III.

Анализ патентной и научно-технической литературы свидетельствует о том, что традиционные методы очистки копропорфирина включают стадию этирификации и порфиринов и разделение их эфирных производных на оксиде алюминия. Это обусловлено общепринятым мнением, что различные формы порфиринов могут быть эффективно разделены в виде эфирных производных. Таким образом получают высокоочищенные нерастворимые в воде формы копропорфирина III (пат. США N 4347184, 4436663; авт.св. СССР N 1482946). Способы получения водорастворимых форм, согласно обнаруженным источникам, связаны с получением водонерастворимых эфиров порфиринов, их разделением и дальнейшем их преобразованием в водорастворимые формы. Так, наиболее близким аналогом (прототипом) получения водорастворимых копропорфиринов является патент ФРГ N 2809093, согласно которому очистку копропорфирина III осуществляют путем кислотного осаждения порфиринов из нативного раствора, переводом порфиринов в водонерастворимую форму метиловый эфир (методом этерификации смесью метанола с серной кислотой), хромат графической очисткой на оксиде алюминия и переводом очищенной водонерастворимой формы в водорастворимую (методом обработки щелочью в органической среде). Oписанный способ является трудоемким, осуществляется с использованием большого количества экологически- и взрывоопасных органических растворителей, малопроизводителен: 2,0 15,0 мг/сутки.

Предлагаемый способ базируется на принципиально ином подходе к проблеме очистки копропорфирина III. Он основан на различной растворимости форм порфиринов, продуктов их расщепления и пигментов в растворах кислот разной концентрации (Досон Р. Элион Д. Джонс К. Справочник биохимика М. Мир, с. 174 187). Сочетание приемов переосаждения, проводимых в специально подобранном режиме, с сорбционной хроматографией дает возможность получать высокоочищенную водорастворимую форму копропорфирина III непосредственно из нативного раствора Arthrobacter globiformis ИНБИ-121, минуя стадию этирификации и разделения эфиров порфиринов на оксиде алюминия.

Предлагаемый способ получения водорастворимой формы копропорфирина III осуществляют следующим образом.

После отделения клеточной массы методом центрифугирования порфирина осаждают из нативного раствора, подкисляя его до pH 3,7 ±0,1 раствором соляной кислоты. Осадок отделяют центрифугированием, тщательно промывают водой. В нем содержится 10 15% копропорфирина III. Остальную часть составляют промежуточные продукты биосинтеза, близкие по физико-химической свойствам копропорфирину III: другие формы порфиринов, продукты их расщепления, пигменты, белки.

Для выделения копропорфирина III из этой смеси осуществляют двухстадийное переосаждение из растворов соляной кислоты разной концентрации.

На первой стадии этого этапа отделяют примеси, нерастворимые в относительно концентрированных растворах кислот. Для этого осадок с содержанием порфиринов 10 15% растворяют в 5 7%-ном растворе соляной кислоты. Нерастворившиеся примеси отделяют центрифугированием кислоты более 7% приводит к эмульгированию суспензии (за счет белковых примесей), плохому ее разделению, загрязнению экстракта. При концентрации кислоты ниже 5% увеличивается расход кислоты и длительность ее воздействия на порфиринсодержащий промежуточный полупродукт.

Копропорфирин III и неотделившиеся примеси осаждают из супернатанта, добавляя раствор щелочи до pH 3,2 3,4. Осадок отделяют центрифугированием, промывают водой, высушивают. Эта предварительная сушка продукта после первой перекристаллизации, как показали проведенные исследования, имеет принципиальное значение. Она предотвращает отрицательные эффекты длительного воздействия соляной кислоты на влажную пасту порфиринов. Наиболее существенным из этих отрицательных эффектов, влияющим на дальнейших ход очистки, является образование порфиринов, имеющих отличные от мономеров физико-химические характеристики. Высушивание проводят в сушильном шкафу при температуре 110 - 130^oС до влажности не более 10% Полученный таким образом продукт имеет степень чистоты 50 60% На второй стадии переосаждения отделяют копропорфирин III от порфиринов, близких по структуре и свойствам, но отличных от него по растворимости в слабых растворах кислот. Для этого высушенный продукт растворяют в 2,0 - 3,5% -ном растворе соляной кислоты. Выбранный интервал концентрации соляной кислоты установлен экспериментально и обеспечивает существенное повышение степени чистоты целевого продукта, низкое содержание минеральных солей при последующем его осаждении подщелачиванием и оптимальный объем рабочего раствора. Нерастворившиеся примеси удаляют центрифугирование. Двойное переосаждение обеспечивает получение продукта с чистотой 75 85% Большую часть оставшихся примесей составляют пигменты, для отделения которых проводят сорбционную очистку на макропористом сополимере стирола и дивинилбензола, содержанием в качестве ионогенных групп первичные и вторичные аминогруппы (например, АН 80 7п и АН-21). Выбор сорбента обусловлен высокой сорбционной емкостью по отношению к копропорфирину III, полнотой десорбции, а также условиями проведения процесса, обеспечивающими оптимальный технологический режим при его экологической безопасности. Процесс сорбции осуществляют на солевой форме сорбента из нейтральных растворов, а десорбцию осуществляют 1,0 2,5-ным раствором аммиака.

Из элюата копропорфирин III осаждают кислотой. Осадок, тщательно отмытый от минеральных солей, растворяют в воде, содержащей рассчитанное количество гидроксида калия, эквивалентное количеству карбоксильных групп полученного препарата копропорфирина III. Затем раствор высушивают лиофильно. Чистота полученного таким образом препарата составляет 90 96 Таким образом, предлагаемый способ биосинтеза и очистки копропорфирина III из культуральной жидкости Arthrobacter globiformis штамм ИНБИ-121 позволяет получить 200 300 мг копропорфирина III в виде тетракалиевой соли из 1 культуральной жидкости.

Осуществимость предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 4. Биосинтез осуществляют согласно примера 3. Культуральную жидкость 1100 мл центрифугируют при 6000 об/мин, получают 1000 мл нативного раствора с содержанием порфиринов 300 мг/л. Указанный объем нативного раствора подкисляют с помощью соляной кислоты до pH 3,7 ± 0,1. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием 10 мин при 1000 g, промывают дистиллированной водой до получения неокрашенных промывных вод. Затем полученный осадок в количестве 10 г растворяют в 150 мл 5%-ного раствора соляной кислоты. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием обычным образом. Супернатант подщелачивают 25%-ным водным раствором аммиака до pH 3,3 ± 0,1. Кристаллы копропорфирина III отделяют центрифугированием обычным образом, промывают дистиллированной водой трижды по 50 мл. Влажный осадок высушивают при температуре ≅130^oC. Получают 480 мг препарата копропорфирина III с чистотой 60% и растворяют в 50 мл 3%-ного раствора соляной кислоты. Нерастворившиеся примеси отделяют центрифугированием обычным образом, а копропорфирин III осаждают из супернатанта, приливая 25% раствора аммиака до pH 3,3 ± 0,1. Осадок отделяют, промывают дистиллированной водой, растворяют в 20 мл воды при подщелачивании 1 н. раствором гидроокиси калия до pH 6,0 8,0 и пропускают через колонку, заполненную 100 мл анионита АН-80-7п в Cl^- форме. По окончании сорбции колонку отмывают дистиллированной водой до получения неокрашенного фильтрата. Десорбцию осуществляют, пропуская водный раствор аммиака (2,5%-ного раствор) до полной десорбции копропорфирина III (о полноте сорбции судят по обесцвечиванию сорбента). Получают 100 мл интенсивно окрашенного раствора, из которого получают копропорфирин III, приливая водный раствор соляной кислоты до pH 3,5 ±0,1. Осадок отделяют центрифугированием обычным образом, тщательно отмывают дистиллированной водой, высушивают в вакууме при температуре (70 ±2/^oC). Получают 255 мг копропорфирина III с чистотой 95%). Полученный продукт тщательно растирают, добавляют 20 мл воды и расчетное количество гидроксида калия в виде 1 М раствора. Прозрачный раствор высушивают лиофильно. Получают 300 мг тетракалиевой соли копропорфирина III с чистотой 95% (в пересчете на свободный копропорфирин III).

Пример 5. Биосинтез осуществляют согласно примеру 1. Культуральную жидкость в количестве 3000 мл разделяют на центрифуге, получают 2850 мл нативного раствора с содержанием порфиринов 260 мг/л. После осаждения и промывки получают влажный осадок порфиринов в количестве 30 г. К осадку при перемешивании приливают 200 мг 7 раствора соляной кислоты. Перемешивание продолжают в течение 15 20 мин, осадок отделяют центрифугированием и проводят повторную экстракцию 100 мг 7%-ного раствора соляной кислоты. Экстракты объединяют, подщелачивают раствором аммиака (25%), кристаллы копропорфирина III отделяют центрифугированием, тщительно отмывают дистиллированной водой от минеральных солей; высушивают при температуре не выше 130^oC и получают 1320 мг копропорфирина III с чистотой 50 Полученные 1320 мг продукта растворяют в 250 мл 2,5%-ного раствора соляной кислоты при перемешивании, после чего осадок отделяют, копропорфирин III осаждают подщелачиванием раствором аммиака, отмывают дистиллированной водой от минеральных солей.

Полученный влажный осадок суспендируют в дистиллированной воде и подщелачивают раствором гидроксида калия в концентрации 1 до pH 6 8. Полученный раствор в количестве 90 мл пропускают через колонку со 150 мл сорбента АН-21 в солевой форме. По окончании сорбции колонку отмывают дистиллированной водой и десорбируют целевой продукт 1%-ным раствором аммиака. Элюат собирают, замеряют объем и концентрацию копропорфирина в нем, осаждают целевой продукт 2% -ным раствором соляной кислоты, осадок тщательно отмывают от минеральных солей дистиллированной водой, получают влажную пасту, которую растворяют в 40 мл дистиллированной воды, прибавляя расчетное количество 1 М раствора гидроксида калия.

Раствор высушивают лиофильно и получают 530 мг тетракалиевой соли копропорфирина III с чистотой 93% Пример 6. Биосинтез проводят согласно примера 1. Получают 1000 мл культуральной жидкости, содержащей копропорфирин III с концентрации 260 мг/л. Выделение осуществляют согласно примера 5. В качестве экстрагента на первом этапе используют 5%-ный раствор соляной кислоты. Получают 375 мг копропорфирина III с чистотой 62% После предварительной сушки, как описано в примерах 4 и 5, вторую обработку полупродукта проводят 2%-ным раствором соляной кислоты в соотношении 1:300 (масс объем кислоты). Для последующей очистки используют 100 мл сорбента АН-80-7п. Последующую очистку ведут как в примере 5.

После лиофильной сушки получают 200 мг тетракалиевой соли копропорфирина III с чистотой 96% Пример 7. Биосинтез проводят согласно примера 2. Получают культуральную жидкость в количестве 6000 мл с содержанием порфиринов 200 мг/л. Выделение ведут согласно примера 4 за исключением того, что первую перекристаллизацию ведут из 6%-ного раствора соляной кислоты (в соотношении масса порфиринсодержащего сырца к объему кислоты 1:120). После описанного в предыдущих примерах высушивания получают 2350 мг копропорфирина III с чистотой 55% Далее продукт растворяют в 200 мл 3,5%-ного раствора соляной кислоты, нерастворившийся осадок отбрасывают, целевой продукт осаждают подщелачиванием, отмывают от минеральных солей, влажный осадок растворяют при подщелачивании в дистиллированной воде и подают не ионообменную колонку с 200 мл сорбента АН-80-7п. Дальнейшая обработка ведет согласно примера 4. Получают 1200 мг тетракалиевой соли копропорфирина III с чистотой 92%

Формула изобретения

1. Штамм бактерий Arthrobacter globiformis ВНИИСХМ-479 продуцент копропорфирина III.

2. Способ получения копропорфирина III путем культивирования штамма-продуцента Arthrobacter globiformis на питательной среде, содержащей глюкозу, соль аммония, питательную основу и воду, с последующим выделением целевого продукта из нативного раствора, отличающийся тем, что культивируют штамм Arthrobacter globiformis ВНИИСХМ-479 на питательной среде, содержащей в качестве соли аммония двузамещенный фосфорнокислый аммоний, а в качестве питательной основы кукурузный экстракт со смесью аминокислот гидролизатных при следующем соотношении компонентов в среде, мас.

Глюкоза 8 Кукурузный экстракт 3 Смесь аминокислот гидролизатных 0,2 0,5 Двузамещенный фосфорнокислый аммоний 0,05 0,2 Вода Остальное
при pH 6,8-7,2.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивирование осуществляют при 32 36^oС.

4. Способ по пп.2 и 3, отличающийся тем, что выделение целевого продукта осуществляют путем последовательного переосаждения копропорфирина III из нативного раствора 5 7%-ным и 2 3,5%-ным растворами соляной кислоты с последующей сорбционной хроматографией на макропористом анионите с десорбцией 1 2,5%-ным раствором аммиака, осаждением копропорфирина III из элюата при подкислении и переводом целевого продукта в водорастворимую форму экстракцией его водой из осадка при подщелачивании.