Циклоспорины

 

Использование: микробиологическая промышленность, получение антибиотиков. Сущность изобретения: касается циклоспоринов формулы где W' - MeBmt или дигидро-MeBmt; X - αAbu, Val, Thr, Nva или MeOThr; R - Sar или (D)-MeAla; Y - MeLeu, g-гидрокси-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle или MeaThr; Z - Val, Leu, MeVal или MeLeu, при условии, что когда Y представляет MeLeu или MeAla, то Z является MeVal или MeLeu, и если W представляет MeBmt, R представляет Sar и Y представляет g-гидрокси-MeLeu, то Z другой, чем Val. 3 з. п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение касается новых циклоспоринов, которые могут использоваться в качестве фармацевтических средств.

Циклоспорины относятся к классу циклических поли-N-метилированных ундекапептидов особой структуры, обычно обладающих фармакологическим действием, обычно иммуносупрессивным, противовоспалительным и/или противопаразитарным.

Первым выделенным циклоспорином был грибковый метаболит Cyclosporine известный под названием циклоспорин A и производимый промышленностью с торговой маркой Сандиммун (Samdimmun). Это вещество представляет собой циклоспорин следующей формулы (А): где MeBmt является N-метил-(4R)-4-бут-2E-ен-1-ил-4-метил-(L)-треонильным остатком формулы (B)

где x-y- представляет собой -CH=CH- (trans).

Со времени открытия циклоспорина было выделено и идентифицировано обширное множество природных циклоспоринов, а также синтезированы многие циклоспорины, не встречающиеся в природе, посредством полностью синтетических или полу-синтетических технологий или посредством применения методов модифицирования культуры. Этот класс веществ теперь, таким образом, значителен и включает, например, природные циклоспорины от A до Z [Traber и др. 1, Helv. Chim. Acta, 60, 1247 1255 (1977); Traber и др. 2, Helv. Chim. Acta, 65, 165 1667 (1982); Kobel и др. Europ. J. Applid Microbiology and Biotechnology, 14, 273 -240, (1982); и von Wartburg и др. Progrees in Allergy, 38, 28 45, (1986)] а также разнообразные неприродные циклоспорины и искусственные или синтетические циклоспорины, включая дигидроциклоспорины, у которых группа -x-y- остатка MeBmt (см. формулу B выше) является насыщенной с получением -CH₂-CH₂-; модифицированные циклоспорины (например, такие, у которых 3'-O-атом остатка MeBmt ацилирован или еще один заместитель введен к α-углеродному этому остатка Sar (саркозил) в 3-позиции); циклоспорины, у которых остаток MeBmt присутствует в изомерной форме (например, такие, у которых конфигурация через позиции 6' и 7' остатка MeBmt является скорее цис, чем транс); и циклоспорины, у которых вариантные аминокислоты введены в специфических позициях внутри пептидной последовательности, например, те, в которых использован общий метод синтеза циклоспоринов по Венгеру (Wenger R.) [см. Traber и др. 1, Traber и др. 2, Kobel и др. те же ссылки, что и выше; патенты США NN 4 108985; 4 220 641; 4 288 431; 4 544 351; 4 396 542 и 4 798 823; Европейские заявки NN 34567А; 56782А; 300784А; 300785А и 414632А; N 4914188; Международная заявка WO 86/02080, патенты Великобритании NN 2 06 119 и 2 207 678; Wenger 1, Transpl.Proc. 15 Suppl. 1:2230 (1983); Wenger 2, Angew. Chem. Int. Ed. 24, 77 (1985) и Wenger 3, Progress in Chemistry of Organic Natural Products, 50, 123 (1986).

Класс циклоспоринов, таким образом, действительно очень велик и включает, например, [Thr] ²-, [Val] ²-, [Nva] ²- и [Nva]²-[Nva]⁵-циклоспорины (известные как циклоспорины C, D, G и M соответственно), [3-0-ацетил-MeBmt] ¹-циклоспорин (также известный как ацетат циклоспорина A), [дигидро-MeBmt] ¹-[Val] ²-циклоспорин (также известный как дигидро-циклоспорин D), [(D)Ser] >⁸-циклоспорин, [Melle]¹¹-циклоспорин, [(D)MeVal]¹¹-циклоспорин (также известный как циклоспорин H), [MeAla]⁶-циклоспорин, [(D)Pro]³-циклоспорин и т. д.

В соответствии с принятой номенклатурой циклоспоринов они определены в предлагаемом описании и формуле изобретения со ссылкой на структуру циклоспорина A. Это сделано таким образом, чтобы сначала обозначить те остатки (радикалы) молекулы, которые отличаются от остатков (радикалов) циклоспорина А, и используя термин "Циклоспорины" для того, чтобы указать, что остальные радикалы те же, что у Циклоспорина A. В то же время префикс "дигидро-" используется для обозначения циклоспоринов, у которых остаток MeBmt гидрогенирован (дигидро-MeBmt), т. е. -x-y представляет собой -CH₂-CH₂-.

Таким образом, [Thr]²-циклоспорин является циклоспорином, имеющим последовательность, показанную в формуле A, но в которой aAbu во 2-й позиции заменен на Thr и [дигидро-MeBmt]¹-[Val]²-циклоспорин является циклоспорином, имеющим последовательность, показанную в формуле A, но в которой остаток MeBmt в позиции 1 гидрогенирован, а αAbu во 2-й позиции заменен на Val.

Кроме того, аминокислотные остатки, показанные в виде сокращений, например Ala, MeVal, αAbu и т.д. должны пониматься в соответствии с принятой практикой, как имеющие (L)-конфигурацию, если не указано иного, как, например, в случае "(D)-Ala". Сокращения, начинающиеся с букв "Me", как, например, в случае "MeLeu", представляют α-N-метилированные остатки. Остатки молекулы циклоспорина индивидуально пронумерованы, как принято в данной области, по часовой стрелке и начиная с остатка MeBmt и дигидро-MeBmt в позиции 1. Такая цифровая последовательность применена во всем описании и пунктах формулы.

Теперь хорошо известно, что циклоспорин действует посредством вмешательства в процесс T-клеточной активации посредством блокирования инициации транскрипции IL-2, хотя полностью этот механизм еще не объяснен. Циклоспорин, как было установлено, образует комплекс с 17 КД цитозольным протеином (циклофилином), который встречается во многих типах клеток и идентичен пептидил-пролил-цистранс-изомеразе, ферменту, вовлеченному в (трехмерную) укладку белка.

Однако до сих пор неясно, коррелируется ли связывание с циклофилином напрямую с иммуносупрессивной активностью циклоспоринов, или действительно связывание с циклофилином само по себе является достаточным критерием иммуносупрессивной активности.

Теперь обнаружено, что имеются циклоспорины, сильно связывающиеся с циклофилином, по совсем не иммуносупрессивные. Из этого следует, что связывание с циклофилином является необходимым, но не достаточным критерием иммуносупрессивной активности.

Предлагаемое изобретение обеспечивает циклоспорины, обладающие активностью против репликации вируса ВИЧ-1.

Вирус человеческого иммунодефицита (ВИЧ) заражает преимущественно T-хелперные (T4) лимфоциты, хотя он реплицируется также в других различных типах клеток, особенно относящихся к моноцитам. Вирус вызывает медленно прогрессирующее заболевание иммунной системы, характеризующееся постепенным разрушением клеток T4, называемое СПИДом. Другие иммунологические нарушения при СПИДе это повышение количества цитотоксичных/супрессорных (T8) лимфоцитов, дефективный процесс антигенной презентации/узнавания и поликлональная активная B-клеток. Механизм деструкции T4 клеток все еще неясен. Похоже, что инфицируется сравнительно немного T4 клеток, и, следовательно, непосредственное цитопатическое действие вируса может быть не единственной причиной разрушения T4 клеток. При этом выдвинута гипотеза, что деструкция T4 клеток может усиливаться автоиммунным процессом, запусканием продуцирующими ВИЧ или покрытыми ВИЧ-белком клетками T4. Это непрерывное антигенное стимулирование может привести к состоянию перманентной активации T4 клеток, которые должны усиливать ВИЧ-репликацию в этих клетках и расширить T-цитотоксичные клоны. Незараженные T4 клетки могут становиться антигенными посредством присоединения экзогенного вирусного gp120 к CD4 молекулам и таким образом, станут мишенью T-цитотоксичной реакции.

В патенте США N 4 814 323 раскрыто, что циклоспорин обладает активностью против СПИДа, и что в общем "циклоспорины, известные как иммуносупрессоры", могут быть полезными для борьбы с этой болезнью. В нем, однако, не предполагается, что не-иммуносупрессивные циклоспорины могут обладать этим свойством.

Неожиданно было обнаружено, что циклоспорины, связывающиеся с циклофилином, но не являющиеся иммуносупрессивными, проявляет эффект ингибирования репликации ВИЧ-1.

Циклоспорин считается связывающимся с циклофилином, если он связывается с человеческим рекомбинантным циклофилином по меньшей мере на одну пятую, так же, как это делает циклоспорин в конкурирующем тесте ELISA, описанном Quesniaux (Eur. J. Immunol, 1987, 17, 1359 1365). В этом тесте испытуемые циклоспорины добавляют во время инкубирования циклофилина с покрытым BSA-циклоспорином, и рассчитывают концентрацию IC₅₀, необходимую для получения 50% -ного ингибирования контрольной реакции без конкурента. Результаты выражены в BR (пропорции связывания), являющейся десятичным логарифмом отношения IC₅₀ испытуемого соединения к IC₅₀ циклоспорина A, испытываемого одновременно с ним, т. е. BR 1,0 указывает на то, что испытуемое соединение связывает циклофилин в десять раз хуже циклоспорина A, а отрицательное значение указывает на более сильное связывание, чем в случае циклоспорина A.

Циклоспорин, активный против ВИЧ, имеет BR менее 0,7 (поскольку log₁₀5 примерно равно 0.7), предпочтительно равный нулю или меньше нуля.

Циклоспорин считается неиммуносупрессивным, если он обладает активностью в реакции MLR (Смещенной Лимфоцитной Реакции) не более 5% предпочтительно, не более 2% такой реакции циклоспорина A. Реакция MLR описана T.Meo ("Immunological Methods", L. Lefkovits B.Peris, Eds. Academic Press, N.Y. 227-239 (1979). Клетки селезенки (0,5 х 10⁶) мышей Bald/c (самка 8 10 нед) инкубируют в течение 5 дн совместно с 0,5 х 10⁶ облученными (2000 рад) клетками или с клетками селезенки мышей CBA (8-10-недельного возраста), обработанными митомицином C. Облученные аллогенные клетки вызывают пролиферативную реакцию в селезеночных клетках Bald/c, которая может быть измерена посредством введения меченого предшественника в ДНК. Поскольку клетки-стимуляторы облучены (или обработаны митомицином C), они не дают пролиферативной реакции на клетки Balb/c, но сохраняют свою антигенность.

Установленный IC₅₀ в реакции MLR испытуемого соединения сравнивает с IC₅₀ циклоспорина A, установленным в параллельном эксперименте.

Активность циклоспоринов в качестве ингибиторов репликации ВИЧ-1 может продемонстрировать следующая методика проведения теста:
1. Ингибирование вызываемого ВИЧ-1 цитопатического действия в клетках МТ4.

Используют процедуру исследования, описанную Pauwels и др. (J. Virol. Meth. 20/309, 1988), с небольшими модификациями. Трансформированную HTLV-I T4-клеточную линию, МТ4, которая, как было заранее выяснено, являлась высоко восприимчивой к заражению ВИЧ, использовали в качестве мишенной клетки. Ингибирование ВИЧ-1 вызываемого штаммом HTLV-IIIB цитопатического действия определяли посредством измерения жизнеспособности как ВИЧ-инфицированных, так и псевдо-инфицированных клеток. Жизнеспособность оценивали спектрофотометрически посредством восстановления на месте (insitu) 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолбромида (МТТ). Зараженные вирусом и незараженные культуры без соединения включают в эксперимент в качестве контроля вместе с незараженными клетками, обработанными испытуемым соединением. Выбирают такую концентрацию клеток, чтобы количество клеток в 1 мл повышалось в 10 раз за 4 дн инкубирования культур псевдозараженных клеток. Количество вирусного инокулята регулировали так, чтобы вызвать гибель 90% мишенных клеток после 4-дневного инкубирования. Вирус адсорбируется на 10-кратно концентрированной клеточной суспензии при 37^oC в течение 1 ч. Затем инфицированные клетки разводят 1: 10 и вносят их в микротитровальные чашки, содержащие испытуемое соединение.

2. Цитотоксичность. Для оценки анти-ВИЧ потенциала Y дополнительных клеточных линий и особенно у моноцитной клеточный линии (U937), сначала оценивали клеточную токсичность испытуемого соединения для этих клеточных линий. Суспензия клеток Jurkat и U937 доводят до концентрации 1 х 10⁵ клеток на мл и концентрируют в присутствии различных концентраций испытуемого соединения. Через 48 ч количества клеток в 1 мл сравнивают посредством окрашивания МТТ. Цитотоксичность клеток МТ4 может быть измерена точно так же.

3. Ингибирование репликации ВИЧ-1 в клетках Jurkat и U937. Линию Jurkat клеток Т4 и линию U937 моноцитов инфицировали посредством суспендирования 10-кратно концентрированных клеток в вирусном растворе. Адсорбцию осуществляли в течение 2 ч при 37^oC. Затем клетки осаждали центрифугированием, материал для инокуляции удаляли и клетки ресуспендировали при их исходной концентрации в свежей культуральной среде, содержащей испытуемое соединение. Таким образом, вещество добавляют после адсорбции. В дни (2, 5, 8, 12, 15 и 19) после инфицирования брали аликвоты инфицированных культур. Клетки центрифугировали и собирали надосадочную жидкость. В надосадочной жидкости определяли концентрацию вирусного антигена р24 посредством коммерческого набора ELLSA, которая затем служила в качестве параметра производства вируса. После каждого взятия аликвот клетки подсчитывали и их концентрацию доводили до 2 х 10⁵ клеток на мл посредством добавления свежей среды, содержащей испытуемое соединение в определенной концентрации.

Из соединений по изобретению, т. е. из не-иммуносупрессивных, связывающих циклофилин циклоспоринов, обладающих активностью против ВИЧ-1, некоторые являются новыми, а другие известны, однако активность против ВИЧ-1 известных соединений из этого числа ранее не была раскрыта, и во многих случаях в отношении известных соединений не было раскрыто, что они обладают какой-либо фармацевтической активностью.

При этом обнаружено, что многие из упомянутых активных соединений имеют структуру, отличающуюся от структуры циклоспорина А в 4 и/или 5 позициях.

Одну группу активных соединений составляют циклоспорины, у которых группа MeLeu в позиции 4 замещена различной N-метилированной аминокислотой, например, g-гидрокси-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr или MeAla. Кроме Melle и MeThr могут также использоваться их алло-формы Mealle и MeaThr. Стереохимия алло-формы такова, что в c-положении ее конфигурация противоположна конфигурации природной аминокислоты, и, таким образом, обычная форма и алло-форма составляют пару диастереоизомеров.

Еще одну группу упомянутых активных соединений составляют циклоспорины, у которых Val в 5-й позиции заменен на N-алкил-, предпочтительно, N-метил-, аминокислоту. Предпочтительно, этой N-алкилированной аминокислотой является Val или Leu. Предпочтительно, водород имино-группы [Val]⁵ заменен на неразветвленную C_1-6алкильную группу, предпочтительно, метил, этил или пропил, особенно предпочтительно метил. Эта последняя группа активных соединений полностью является новой.

Дополнительно или альтернативно, определенные активные соединения могут отличаться от циклоспорина A в 1, 2, 3 и/или 6 позициях. Предпочтительную группу активных соединений составляют соединения формулы (I)

где W MeBmt, дигидро-MeBmt или 8'-гидрокси-MeBmt;
X αAbu, Val, Thr, Nva или O-метил-треонин (MeOThr);
R Sar или (D)-MeAla;
Y MeLeu, γ-гидрокси-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle или MeaThr;
Z Val, Leu, MeVal или MeLeu; и
Q MeLeu, g-гидрокси-MeLeu или MeAla;
при условии, что когда Y представляют MeLeu, тогда либо Z является MeVal или MeLeu, либо W является 8'-гидрокси-MeBmt.

Группы W, X, Y, Z, Q и R имеют (независимо друг от друга) следующие предпочтительные значения:
W является предпочтительно W', где W'- MeBmt или дигидро-MeBmt;
X является предпочтительно X', где X' aAbu или Nva, более предпочтительно X'', где X'' αAbu;
R является предпочтительно R', где R' Sar;
V является предпочтительно Y', где Y'-γ-гидрокси-MeLeu, MeVal, MeThr или Melle;
Z является предпочтительно Z', где Z' Val или MeVal; и
Q является предпочтительно Q', где Q' MeLeu.

Одну особенно предпочтительную группу активных соединений по изобретению составляют соединения формулы (I), в которой W, это W', X-X', Y-Y', Z-Z', Q-Q', и R-R'.

Особенно предпочтительными соединениями формулы 1 являются
a) [дигидро-MeBmt}¹-[g-гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин;
b) [MeVal]⁴-циклоспорин;
c) [Melle]⁴-циклоспорин;
d) [MeThr]⁴-циклоспорин;
e) [g-гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин,
f) [Nva]²]-[g -гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин;
g) [g -гидрокси-MeLeu]⁴-[g -гидрокси-MeLeu]⁶-циклоспорин;
h) [Nva]²-[g -гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин;
i) [MeVal]⁵-циклоспорин;
j) [MeOThr]²-[(D)MeAla]³-[MeVal]⁵-циклоспорин.

Кроме того, некоторые соединения, не охватываемые формулой (I), также относятся к группе упомянутых активных соединений, например,
k) [MeAla]⁶-циклоспорин и
l) [g -гидрокси-MeLeu]⁹-циклоспорин.

Изобретение обеспечивает также новые активные соединения формулы (II):

где W', X, R, Y и Z такие, как определено выше, при условии, что
1) если Y является MeLeu или MeAla, то Z представляет собой MeVal или MeLeu;
2) если W' MeBmt, R Sar и Y-γ -гидрокси-MeLeu, то Z другой, чем Val.

Предпочтительную группу активных соединений по изобретению составляет соединения формулы (II), в которой X является X'', Y-Y', Z-Z', при условии, что если W' является MeBmt, то Y' другой, чем g -гидрокси-MeLeu.

Особенно предпочтительными соединениями являются соединения a), b), c), d), f) и h). Обнаружено, что некоторые из этих соединений, особенно соединения b) и c), блокируют иммуносупрессивное действие циклоспорина посредством блокирования его связывания с циклофилином, и таким образом действуют как антагонисты циклоспорина.

Активные соединения по изобретению могут быть получены многими путями, которые можно классифицировать так:
1). Ферментация.

2). Биотрансформация.

3). Получение производных.

4). Частичный синтез.

5). Полный синтез.

1) Некоторые активные соединения по изобретению получают в качестве побочных продуктов ферментации исходных или модифицированных штаммов производящих циклоспорин микроорганизмов, таких как грибки Tolypocladium inflatum, как показано на примере производства соединения c), описанном в примере 1 ниже.

2) Другие активные соединения по изобретению, включая известные соединения j) и i) являются метаболитами циклоспорина, и могут быть выделены хроматографическими методами из мочи людей или животных, получающих цикоспорин. Кроме того, эти и другие метаболические трансформации возможны с использованием микроорганизмов, например, производство соединений c) и g) посредством биотрансформации циклоспорина A (примеры 2 и 3), или производство соединения f) посредством биотрансформации циклоспоирна G (пример 4). Эти примеры демонструруют новый способ получения циклоспоринов, имеющих один или более g -гидрокси-MeLeu остатков, и выделения продукта из ферментационного бульона.

3) Под получением производных понимают, что приводные или синтетические циклоспорины могут быть превращены в активные соединения по изобретению посредством одной или более химических реакций, в которых одна или более аминокислот модифицируют без открытия пептидных связей и их преобразования. Например, класс активных соединений по изобретению, у которых Val в позиции 5 является N-алкилированным, могут быть получены посредством реакции соответствующего циклоспорина, имеющего Val в 5-й позиции, с бутил-литием, с последующей реакцией с алкилирующим агентом, как показано на примере получения соединения h) (пример 5) и соединен i) (пример 6).

В качестве дополнительного примера соединение a) может быть получено посредством гидрогенирования соединения e) (Пример 7), а соединение J), которое также является главным метаболитом циклоспорина, может быть получено из известного соединения ацетата циклоспорина так, как описано в примере 8.

4) Выражение "частичный синтез" использован для обозначения ряда химических реакций, в ходе которых открывается кольцо природного циклоспорина, удаляется одна или более аминокислот, добавляются другие аминокислоты, и кольцо снова закрывается.

5) Полный синтез циклоспоринов может быть осуществлен посредством построения линейного ундекапептида и его зацикливанием, как описано Wenger (ссылка выше), а также в патенте США NN 4 396 542 и 4 798 823. В принципе, любой циклоспорин может быть получен путем полного синтеза, хотя если доступен один из остальных методов, то он может оказаться более удобным, чем полный синтез. Полный синтез может использоваться для получения соединения d) (пример 9), и для получения известного метаболитного соединения 1).

Соединение k) является известным веществом, свойства которого описаны Quesniaus и др. [Mol. Immunol. 24, 1159 (1987)] и который также может быть получен полным синтезом. Например, в патенте США N 4 914 188 описан полный синтез этого соединения.

Пример 1 [Meile]⁴-Циклоспорин (Соединение с). Продуцирующий штамм
Соединение с) получают ферментацией с использованием штамма Cy E 4556 грибка Tolypocladium inflatum, депонированного в DSM (Немецкая Коллекция Микроорганизмов) по условиям Будапештского договора 24 июля 1991 с депозитарным номером DSM 6627. Этот штамм является мутантом штамма NRRL 8044 вида Tolypocladium inflatum, и таксономически идентичен родительскому штамму, который полностью описан, например, в патенте Великобритании N 1 491 509.

Культуры. 1. Стартовая агаровая культура.

Культуры штамма DSM 6627 на скошенном агаре выращивают 14 дн при 27^oC на следующей агаровой среде:
Дрожжевой экстракт (Gistex) 4 г
Солодовый экстракт (Wander) 20 г
Агар 20 г
Деминерализованная вода До 100 мл
PH среды доводят до 5,4 5,6 и ее стерилизуют в течение 20 мин при 120^oC.

2. Предкультура.

Споры из мицелия 4 стартовых культур суспендируют в 40 мл 0,9-ного солевого раствора. В каждую из серии 500-миллилитровых колб Эрленмевера (Erlenmever), содержащих каждая 100 мл предкультуральной среды, инокулируют 20 мл этой суспензии. Состав предкультуры следующий:
Казеин (Amber EHC) 25 г
Мальтоза 75 г
KH₂PO₄ 1 г
KCl 2.5 г
Деминерализованная вода до 1000 мл
PH среды доводят до 5,2 5,5 добавлением HCl, а затем стерилизуют в течение 20 мин при 120^oC. Предкультуры ферментируют в течение 24 ч при 27^oC на роторном шейкере со скоростью 200 об/мин с эксцентричностью 50 мм.

3. Промежуточная культура.

В 25-литровый стальной ферментер, содержащий 20 л предкультуральной среды, вводят 200 мл предкультуры. Промежуточную культуру ферментируют в течение 5 дн при 27^oC со скоростью перемешивания 150 об/мин и при скорости воздушного потока 0,5 л/мин на литр среды под давлением 0,5 бар.

4. Главная культура.

100 л предкультуральной среды инокулируют 10 литрами промежуточной среды и ферментируют в 120-литровом стальном ферментере. К этой среде добавляют 4 г/л D-Треонин, стерилизованный фильтрованием. Ферментацию осуществляют в течение 14 дн при 27^oC, при перемешивании со скоростью 70 об/мин и при скорости воздушного потока 0,4 л/мин на литр среды под давлением 0,5 бар, поддерживавшемся первым 5 дн, причем скорость перемешивания затем повышают до 100 об/мин, а скорость воздушного потока до 0,5 л/мин на весь остальной период ферментации.

Выделение. Мицелий отделяют от культуральной среды и экстрагируют в аппарате Turrax путем раздавливания и перемешивания трижды с 10 л смеси метанол/вода (9:1 об/об). Разрушенный мицелий выделяют из растворителя посредством всасывающей фильтрации, и объединенные фильтраты концентрируют выпариванием под вакуумом при 40^oC до тех пор, пока пар не будет содержать только воду. Полученную смесь экстрагируют четырежды с использованием 2 л 1,2-дихлорэтанол на каждой экстракции, и объединенные растворы 1,2-дихлорэтана концентрируют выпариванием под вакуумом при 40^oC.

Остаток подвергает хроматографии на силикагелевой колонке (10 кг силикагеля, размер гранул от 0,02 мм до 0,045 мм, "Grace", с использованием в качестве элюента смеси этилацетата и воды (фракциями по 2,5 л). Фракция 20-23, содержащие [Meile]⁴-циклоспорин, смешивают и затем разделяют хроматографически на силикагелевой колонке (600 г силикагеля, размер от 0,04 до 0,063 мм, "Merck") с использованием смеси хлороформ/метанол (98:2 по объему) в качестве элюента (размер фракции 300 мл). Дальнейшей очистки достигают посредством хроматографии на силикагелевой колонке (400 г силикагеля, размер гранул от 0,04 до 0,063 мм, "Merck") с использованием смеси метиленхлорид/метанол (98: 2 по объему) в качестве элюента (размер фракции 200 мл), с получением чистого [Meile]⁴-циклоспорина в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 155 158^oC; [p]D²⁰ -235^oC (c 0,68 в CHCl₃) и -193^oC (c 0,74 CH₃OH).

IR-спектр в CH₂Cl₂ показан на фиг. 1; ЯМР-спектр в CDCl₃ показан на фиг. 2.

Пример 2 [g-гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин (Соединение е). Соединение е) получают путем биотрансформации циклоспорина микроорганизмом Sebekia benihana. Использованный исходный штамм называется NRLL 11111 и принадлежит к видам Sebekua benihana (Dietz, Li: Sebekia, new denus of the family Actinoplaceae. Abstrs. 82nd Ann. Meet. Soc. Microbiol. 163, Atlanta, 1982). Этот штамм способен гидроксилировать новобиоцин. Штамм в культуре, использованный для получения Соединения е) и родственных ему соединений, депонирован в коллекции DSM (D-3300, Брауншвейг) с депозитарным номером DSM 6182.

1. Агаровая стартовая культура. Культура штамм DSM 6182 на скошенном агаре выращивали в течение 10 дн при 27^oC. Агаровая среда имела следующий состав:
Глюкоза 10 г
Крахмал (растворимый) 20 г
Дрожжевой экстракт (Gistex) 5 г
Пептон (N-Z-Амин, Тип А, Шеффилд) 5 г
CaCO₃ 1 г
Агар (Bacto) 18 г
Деминерализованная вода до 1 литра
Уровень pH: нейтрализован до 7 добавлением NaOH/H₂SO₄.

Стерилизация: при 120^oC в течение 20 мин.

2. Предкультура.

Споры и мицелий исходной культуры суспендировали в 10 мл 0,9-ного солевого раствора. В несколько колб Эрленмайера емкость по 200 мл, содержащих каждая по 50 мл предкультуральной среды, вводили в каждую по 5 мл этой суспензии.

Состав предкультуральной среды следующий:
Глюкоза 7 г
Крахмал (растворимый) 10 г
Дрожжевой экстракт (Gistex) 4.5 г
Солодовый экстракт (жидкий, Wander) 10 г
Пептон (N-Z-Амин, Тип А, Шеффилд) 2.5 г
CaCO₃ 1 г
Микроэлементный раствор N 235 1 мл
Деминерализованная вода До 1 л
Уровень pH: нейтрализован до 7 добавлением NaOH/H₂SO₄.

Стерилизация: при 120^oC в течение 20 мин.

Микроэлементный раствор N 235:
H₃BO₃ 0,1 г
FeSO₄·7H₂O 5 г
KI 0,05 г
CoCl₂·6H₂O 2 г
CuSO₄·5H₂O 0,2 г
MnCl₂·4H₂O 2 г
ZnSO₄·7H₂O 4 г
Деминерализованная вода До 1 л
H₂SO₄ (97%) 1 мл
Предкультуры ферментируют в течение 4 дн при 27^oC на роторном шейкере при скорости вращения 200 об/мин с эксцентричностью 50 мм.

3. Промежуточная культура
В несколько колб Эрленмайера емкость по 200 мл, содержащих каждая по 50 мл предкультуральной среды, вводили в каждую по 5 мл предкультуры. Промежуточную культуру ферментировали в течение 3 дн при 27^oC на роторном шейкере при скорости вращения 200 об/мин с эксцентричностью 50 мм.

4. Главная культура
В несколько колб Эрленмайера емкость по 500 мл, содержащих каждая по 50 мл главной среды (всего 12 л), вводили в каждую по 5 мл промежуточной культуры. Эти культуры ферментируют в течение 3 дн при 27^oC на роторном шейкере при 200 об/мин с эксцентричностью 50 мм. Через 24 ч циклоспорин A (7,5 мг), растворенный в метаноле, добавили к главной культуре (150 мг/л).

Состав главной культуральной среды следующий:
Церелоза 10 г
Декстрин 10 г
Крахмал (растворимый) 10 г
Дрожжевой экстракт (Gistex) 2,5 г
Мука из соевых бобов (Nurupan, Edelsoya) 12,5 г
K₂HPO₄ 0,25 г
KH₂PO₄ 0,12 г
MgSO₄·7H₂O 0,10 г
CaCl₂·6H₂O 0,05 г
Микроэлементный раствор АС-1 1 мл
Деминерализованной воды До 1 л
Уровень pH: нейтрализован до 7,2 7,5 добавлением KOH/H₂SO₄.

Стерилизация: при 120^oC в течение 20 мин.

Микроэлементный раствор АС-1: этот раствор имел тот же состав, что микроэлементный раствор N 235, но с добавлением (NH₄)₅Mo₇O₂₄ (0,2 г).

5. Выделение.

Мицелий отделяют из культуральной среды и полученный культуральный фильтрат (13 л) экстрагируют трижды 1,2-дихлорэтаном, используемом в количестве 1,5 л на каждую экстракцию. Комбинированные растворы 1,2-дихлорэтана выпаривают под вакуумом при температуре 40^oC. Неочищенный остаток подвергают гель-фильтрованию (Sephadex LH-20) с использованием метанола в качестве элюента. Эти фракции, содержащие циклоспориновые соединения (525 мг), смешивают и хроматографируют на силикагеле (50 г, размер гранул 0,04 0,063 мм, "Merck") с использованием смеси хлороформ/метанол в качестве элюента. Повторной хроматографией с использованием той же системы получают чистый [ g -гидроксид-MeLeu]⁴-циклоспорин в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 150 153^oC, [p]D²⁰ -225^oC (c=0,53 в CHCl₃) и -171^oC (c 0,44 CH₃OH).

Пример 3. [ g -гидрокси-MeLeu] ⁴-[ g -гидрокси-MeLeu]⁶-циклоспорин (Соединение g). Более полярные фракции, получаемые при очистке [ g -гидрокси-MeLeu] ⁴-циклоспорина, далее очищают посредством повторной хроматографии на силикагелевой колонке (размер гранул 0,04-0,063 мм) с использованием смеси ацетон/гексан в соотношении 2: 1 в качестве элюента, с последующей хроматографии на силикагеле с использованием смеси метил-т. бутиловый эфир/метанол/вода в соотношении 90:9:1 в качестве элюента. Первые фракции содержат [ g -гидрокси-MeLeu] ⁴-циклоспорин, который далее очищают посредством обесцвечивания активированным углем с получением чистого соединения в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 162-164^oC, [p]D²⁰ -211^oC (c=0,50 в CHCl₃) и -157^oC (c 0,52 CH₃OH).

Более поздние фракции из вышеуказанной хроматографической силикагелевой колонки содержат [ g -гидрокси-MeLeu]⁴-[ g -гидрокси-MeLeu]⁶-циклоспорин и далее очищают посредством обесцвечивания активированным углем с получением чистого целевого соединения в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 157-160^oC, [p]D²⁰ -217^oC (c 0,54 в CHCl₃) и -176^oC (c 0,42 CH₃OH).

Пример 4. [Nva]² [ g -гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин (Соединение f).

Это соединение получают посредством процедуры, аналогичной процедуре получения соединения е) ([ g -гидрокси-MeLeu]⁴ -циклоспорин), но с использованием циклоспорина G ([Nva]² -циклоспорин) в качестве исходного материала. После очистки посредством повторной хроматографии на силикагелевой колонке с использованием этилацетата, насыщенного водой, и смеси ацетон/гексан 2: 1 в качестве элюента, соответственно, целевое соединение получают в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 138 - 141^oC, [p]D²⁰ -213^oC (c 0,69 в CHCl₃) и -168^oC (c 0,70 в CH₃OH).

Пример 5 [Nva]⁵-циклоспорин (Соединение h)
Циклоспорин А (0,60 г 0,5 ммоль), растворенный в тетрагидрофуране (20 мл), инкубируют с 0,63 мл 1,6 М раствора бутиллития (1,0 Ммоль) в гексане. Полученный раствор реагируют с диметил сульфатом (0,1 мл, 1,5 ммоль) при -78^oC. Реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и перемешивают до утра.

Выделение флэш-хроматографией (SiO₂, 5% смесь метанол/эфир), с последующим HPLC (обратная фаза) дает целевой продукт. Это соединение характеризуется посредством 300 МГц¹H ЯМР спектром CDCl₃, показанным на фиг. 3.

Пример 6. [MeOThr]²-[(D)MeAla]³-[MeVaL]⁵-циклоспорин (Соединение i).

Смесь 480 мл THF (абсолютный) и 6,96 г (49,2 ммоль) диизопропиламина охлаждают до -80^oC, и в нее медленно добавляют через шприц 33,5 мл 1,33 М раствора бутиллития в гексане (= 44,5 ммоль). Смесь перемешивают в течение 30 мин при -80^oC, а затем через шприц в течение 2 3 мин добавляют раствор 8 г (6,6 ммоль) циклоспорина C ([The]²-циклоспорин) в 120 мл абсолютного THF. Чистый раствор перемешивают еще при -80^oC, а затем медленно добавляют 2,06 мл метилиодида.

Смеси позволяют нагреться до комнатной температуры в течение 2 ч, а затем добавляют 40 мл воды и растворители выпаривают на роторном выпаривателе при 30^oC под давлением 15 мм рт.ст. Остаток разделяют между водой и эфиром, и слой эфира четырежды полу-насыщенным солевым раствором, сушат над сульфатом магния и выпаривают с получением остатка весом 8,1 г.

Остаток хроматографируют на 1200 г Кизельгеля с водо-насыщенным этилацетатом с получением неочищенного продукта, который после еще одной хроматографии на 200 г Кизельгеля с 5% MeOH/CH₂Cl₂ дает чистый целевой продукт, [p] D²⁰ -195^oC (c 1,0 в CHCl₃).

Пример 7. [Дигидро-MeBmt]¹ [ -гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорин (Соединение a)
К суспензии 200 мг предварительно гидрогенированый 10% смеси палладий/активированный уголь в 4 мл этанола добавляют 1,2 г [ g -гидрокси-MeLeu] ⁴-циклоспорина (Соединение e) в 10 мл этанола, и проводят гидрогенизацию при комнатной температуре до тех пор, пока водород перестает потребляться. После удаления катализатора фильтрованием, раствор выпаривают с получением целевого соединения в виде аморфного белого порошка с температурой плавления 154-156^oC, [p]D²⁰ -225^oC (c 0,87 в CHCl₃) и -169^oC (c 0,70 в CH₃OH).

Пример 8. [8'-Гидрокси-MeBmt]¹- циклоспорин (Соединение j).

1. [O-ацетил- w -бромо-MeBmt]¹-циклоспорин:
Смесь 25,0 г (20 ммоль) [O-ацетил-MeBmt]¹ -циклоспорина (Traber и др. Helv.Chim.Acta 1982, 65, 1653), 4,4 г (25 ммоль) N-бром-сукцилимида и 400 мг азобисизобутиронитрила в 250 мл тетрахлориде углерода нагревают с обратным холодильником в течение 2,5 ч. Растворитель выпаривают и заменяют эфиром, затем отфильтровывают от твердых веществ, промывают водой, сушат над сульфактом магния и выпаривают до сухого состояния. Остаток хроматографируют на силикагеле со смесью Этиловый эфир/этилацетат (4:1) с получением 10,7 г (40% ) аморфного продукта, который кристаллизуют из смеси эфир/гексан с получением 8,4 чистого вещества с температурой плавления 207 209^oC. Последующие фракции хроматографии содержат дополнительно 11,2 г продукта немного худшего качества.

2. [O-ацетил- w- ацетокси-MeBmt]¹-циклоспорин:
Смесь 4,31 г (3,3 ммоль) продукта стадии 1 (загрязненного, по оценке, 15 20% исходного материала) и 2,1 г (8 ммоль) тетраэтиламмоний-ацетат-тетрагидрата в метил-этил-кетоне, содержащая каталитическое количество иодида натрия, нагревают на масляной бане при 105^oC в течение 3 ч и выдерживают при комнатной температуре в течение выходных (до понедельника). Растворитель разбавляют метил-т-бутиловым эфиром и промывают водой и солевым раствором. Слой органических веществ сушат над сульфатом магния и выпаривают с получением 4,0 г неочищенного продукта, который очищают на колонке RP-18 с обратной фазой (240 г) с получением 3,07 г целевого продукта с температурой плавления 191 192^oC.

3. [ w гидрокси-MeBmt]¹-циклоспорин:
Смешивают раствором 1,72 г (1,3 ммоль) продукта, полученного на стадии 2, в 75 мл метанола и раствором 1,2 г натрия в 50 мл метанола и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем раствор подкисляют уксусной кислотой. Растворитель выпаривают при пониженном давлении и остаток растворяют в метил-т-бутиловом эфире, промывают последовательно водой, солевым раствором и раствором бикарбоната натрия, сушат на сульфатом магния и выпаривают. Неочищенный продукт (1,6 г) элюируют из колонки RP-18 (240 г) смесью метанол/вода в соотношении 75:15 с получением 1,5 г чистого продукта. Образец кристаллизуют из смеси эфир/гексан с получением кристаллического продукта с температурой плавления 181 183^oC.

Пример 9. [MeThr]⁴-циклоспорин (Соединение d)
Полный синтез циклоспорина, как он описан в патентах США N 4 396 542 и 4 798 823, осуществляют с использованием MeThr в 4-й позиции вместо MeLeu. Продукт имеет [p]D²⁰ -249,6^oC (c 1,0 в CHCl₃).

Пример 10. [MeVal]⁴-циклоспорин (Соединение d).

Полный синтез циклоспорина, как он описан в патентах США N 4 396 542 и 4 798 823, осуществляют с использованием MeVal в 4-й позиции вместо MeLeu. Продукт имеет [p]D²⁰ -226^oC (c 0,358 в CHCl₃).

Пример 11. Иммуносупрессия и связывание циклофилина.

Активными Соединениями по изобретению, растворенными циклоспорину
В табл. 1 даны примеры (1) пропорции связывания циклофилина (BR) активными соединениями по изобретению, рассчитанной по результатам исследования ELISA и (2) иммуносупрессивной активности этих соединений, измеренной в процентах активности природного циклоспорина (IR - Иммуносупрессивная пропорция).

Пояснения по значениям этих данных и по методам проведения исследований даны выше.

Активные соединения по изобретению могут использоваться как при предотвращении СПИДа у ВИЧ-положительных пациентов, еще не имеющих символов заболевания, так и при лечении пациентов, страдающих СПИДом. У пациентов, у которых СПИД уже появился, введение активного соединения по изобретению будет реверсировать разрушение Т4 клеток, связанное со СПИДом, вызывать регрессию связанных со СПИДом нарушений, таких как саркома Капоши (Kaposi), и снижать вероятность новых случайных заражений.

Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает способ лечения и предотвращения синдрома приобретенного иммунодефицита и других нарушений, вызываемых вирусом ВИЧ-1 у пациента, зараженного указанным вирусом, предусматривающий введение указанном пациенту эффективного количества активного соединения по изобретению.

Активное соединение по изобретению может вводится любым традиционным путем, в частности энтерально, орально, в виде растворов для питья, таблеток или капсул или парантерально, например, в виде растворов или суспензий для инъекций. При внутривенном введении возможная дневная доза составляет от 1 до 20 мг/кг, предпочтительно от 3 до 10 мг/кг, а при оральном введении от 1 до 50 мг/кг, предпочтительно, от 7 до 20 мг/кг.

Токсичность активных соединений по изобретению та же, что и у циклоспорина. Поскольку активные соединения по изобретению не являются иммуносупрессивными, то удается обойти определенные побочные эффекты, относящиеся к иммуносупрессии. Однако другие побочные эффекты, связанные с циклоспорином, в частности нефротоксичность при длительном применении, могут вызывать и циклоспоринами по изобретению.

Предпочтительные галеновые формы для активных соединений по изобретению включают формы на основе микроэмульсий, описанных в патенте Великобритании N 2 222 770А, которые включают формы как внутреннего (орального), так и наружного применения, а также формы (оральные и инъекционные), полученные из растворов сухих веществ, соединяющих моноэфир сахарида и жировой кислоты, например, монолаурат сахарозы, как описано в патенте Великобритании N 2 209 671А. Подходящие дозированные формы на один прием для орального введения включают, например, от 25 до 200 мг активного соединения на дозировку.

Примеры галеновых форм.

Пример А
Продукт по примеру 1 50,0 мг
Гликофурол 180,0 мг
Миглиол 812 90,0 мг
Кремофор RH 40 180,0 мг
Альфа-Токоферол 0,5 мг
Пример B
Продукт по примеру 1 100,0 мг
Тетрагликоль 20,0 мг
Captex 800 20,0 мг
Nikkol HCO-40 860,0 мг
Бутилгидрокситолуол 1,0 мг
Пример C
Продукт по примеру 1 25,0 мг
Гликофурол 75 100,0 мг
Миглиол 812 35,0 мг
Кремофор RH 40 90,0 мг
Бутилгидроксианизол 0,2 мг
Пример D
Продукт по примеру 1 10,0 мг
Тетрагликоль 10,0 мг
Миритол 5,0
Кремофор RH 40 75,0
Альфа-Токоферол 0,1 мг
Отдельные компоненты этих примерных форм, а также методы их приготовления, полностью описаны в патенте Великобритании N 2 222 770А, содержание которого полностью включено в настоящее описание путем ссылки.

Формула изобретения

1. Циклоспорины формулы

где W MeBmt или дигидро MeBmt;
X-αAbu, Val, Thr, Nva или MeOThr;
R Sar или (D)-MeAla;
Y MeLeu, γ-гидрокси-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle или MeaThr;
Z Val, Leu, MeVal или MeLeu,
а при условии, что когда Y представляет MeLeu или MeAla, то Z является MeVal или MeLeu, и если W представляет MeBmt, R представляет Sar и Y представляет γ-гидрокси-MeLau, то Z другой, чем Val.

2. Циклоспорин по п. 1 формулы

где W' MeBmt или дигидро-MeBmt,
Y' γгидрокси-MeLeu, MeVal, MeThr или Melle;
Z' Val или MeVal, а при условии, что если W' MeBmt, то Y' другой чем g-гидрокси-MeLeu.

3. Циклоспорин по п. 1, являющийся [дигидро-MeBmt]¹- γ-гидрокси-MeLeu] ⁴-циклоспорином, или [MeVal]⁴-циклоспорином, или [Melle]⁴-циклоспорином, или MeThr] ⁴ циклоспорином, или [Nva] ²-γ-гидрокси-MeLeu]⁴-циклоспорином, или [MeVal]⁵ циклоспорином, или [MeOThr]²[(D)MeAla]³ [MeVal]⁵-циклоспорином.

4. Циклоспорин по п. 1 или 2 формулы [MeIle]⁴-циклоспорин.

РИСУНКИ

Рисунок 1