Иммунодиагностикум и способ твердофазного иммуноанализа на его основе

 

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, биотехнологии и экспериментальной иммунохимии. Сущность изобретения: иммунодиагностикум представляет собой водную взвесь частиц маркера - неорганического катализатора, с оптимальными размерами в диапазоне 0,1 - 10 мкм, сорбционно связанных с одним из специфических иммунореагентов при соотношении по массе маркера к иммунореагенту в диапазоне от 1000:1 до 100000:1 и стабилизированных высокомолекулярными полимерами. Способ твердофазного иммуноанализа, основанный на применении иммунодиагностикума, включает иммобилизацию лиганда на матрицу, осуществление иммунологической реакции между иммобилизованным лигандом и специфически связывающимся с ним иммунодиагностикумом с последующим выявлением образовавшихся комплексов лиганда и иммунодиагностикума по наличию или количеству связавшегося с матрицей маркера, осуществляемого в характерной для данного маркера индикаторной каталиметрической реакции. Изобретение позволяет упростить и удешевить иммунодиагностику за счет использования стабильных, дешевых и доступных маркеров, а также за счет экономного использования иммунореагентов, обеспечить чувствительность, не уступающую, а в ряде случаев превосходящую чувствительность иммуноферментного анализа, повысить надежность и сократить время определения. 2 с. и 5 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к иммунохимическим методам исследований и может быть использовано для выявления в исследуемых образцах специфических антигенов (АГ) и антител (АТ) в медицине, ветеринарии, биотехнологии и экспериментальной иммунохимии.

Известны иммунодиагностикумы для поверхностного блот-иммуноанализа на основе высокодисперсных (с размерами частиц от 3 до 450 нм) гидрозолей металлов и их соединений, использующихся в качестве маркеров [1] Такие маркеры способны при накоплении на поверхности среды блотинга создавать окраску, различимую визуально или регистрируемую спектрофотометрически. Известны также диагностикумы, использующие в качестве маркеров такие же высокодисперсные коллоиды неметаллов, в частности селена и теллура (Патент ЕПВ N 0298368, кл. G O1 N 33/58, кл. G O1 N 33/546), обуславливающие изменения оптических свойств реакционной среды при агглютинации (преципитации) диагностикума. И в том, и в другом случаях регистрируемый результат иммунологической реакции обусловлен количеством (концентрацией) и оптическими свойствами самого маркера. Эти методы надежны и просты в исполнении, однако вследствие того, что для формирования регистрируемых изменений оптических свойств требуются значительные концентрации меченого иммунореагента и лиганда, они уступают по чувствительности таким методам иммунодиагностики, как иммуноферментный анализ (ИФА).

Известны также иммунодиагностикумы для иммуноферментного анализа, представляющие собой конъюгат одного из иммунореагентов с маркером одним из ферментов растительного или микробиологического происхождения. Конъюгирование указанных компонентов в таких диагностикумах производится за счет ковалентного связывания и определяется молярным соотношением около 1^oC1.

Известно близкое к предлагаемому иммунодиагностикуму решение [1] в котором использован диагностический состав: коллоидный раствор частиц маркера (металла или его соединения) с заданной дисперсностью, сорбционно или ковалентно связанный со специфически имуннореагеном (антителами, антигенами или стафилококковым белком А) и стабилизированный высокомолекулярными неспецифицескими полимерами (бычьим сывороточным альбумином, яичным альбумином, полиэтиленгликолем и т. д.). Использование таких диагностикумов ограничено в ряде практических применений низкой чувствительностью его выявления. Как уже отмечено выше, выявление таких диагностикумов основывается на оптических свойствах маркера (окраске и контрастности) и достигается при накоплении на поверхности твердой фазы его визуально фиксируемых количеств.

Известно, что чувствительность обнаружения следовых количеств неорганических веществ, обладающих каталитическими свойствами, может быть существенно увеличена применением индикаторных каталиметрических реакций. Так, для большинства элементов периодической системы нижняя граница концентраций, определяемых с применением каталиметрии, на 1-2 порядка ниже, чем значения, определяемые методами спектрофотометрии, полярографии и пламенного варианта атомной абсорбуции (С.У.Крейнгольд "Каталиметрия в анализе реактивов и веществ особой чистоты.", -М. Химия, 1983, с.23), не говоря уже о визуальной регистрации. Однако до настоящего времени принцип индикаторной каталиметрии в иммунологических тестах не использовался.

Наиболее близким к предлагаемому диагностикуму является иммунопероксидазный конъюгат для иммуноферментного анализа (Кревиня В.Я. Елигулашвили Р. К. Получение и исследование иммуноферментных комплексов. В сб. "Вирусные гепатиты типов А и В", Рига, 1983, с.110-115), представляющий собой один из иммунореагентов, ковалентно связанный в молярном соотношении 1:1 или 1:2 с пероксидазой хрена. Последний иммунодиагностикум имеет следующие недостатки: значительная стоимость маркера и соответственно диагностикума на его основе, обусловленная сложной процедурой выделения и очистки активного фермента; необходимость в хранении фермента при низких температурах и периодической оценке его активности; неизбежная потеря активности фермента и иммуноглобулинов в процессе получения коньюгата ковалентного связывания этих реагентов; относительно низкое насыщение коньюгата ферментной меткой (обычно молярное соотношение фермента и иммуноглобулинов 1:1), что требует для достижения высокой чувствительности применения сложных (как правило, афинных) методов очистки коньюгируемых иммуноглобулинов или антигенов; подверженность диагностикума влиянию примесей в исследуемом образце, способных инактивировать или блокировать фермент; необходимость обеспечения строгих физиологических условий (температура, буферные системы, особая чистота реактивов) в процессе приготовления, хранения и использования диагностикума для обеспечения нормального функционирования фермента.

Большинство из перечисленных недостатков обусловлены биологической природой маркера.

Основной задачей изобретения является создание более дешевого и стабильного иммунодиагностикума, обеспечивающего более высокую чувствительность анализа по сравнению с приведенными известными решениями.

Поставленная задача решается применением иммунодиагностикума, приготовленного на основе одного из нерастворимых или труднорастворимых катализаторов и представляющего собой водную взвесь частиц размером от 0,1 до 10 мкм маркера катализатора, сорбционно связанного при соотношении по массе от 100000: 1 до 1000: 1 соответственно с одним из специфических иммунореагентов (антителами, антигенами, стафилококковыми протеинами и т.п.) и стабилизированного высокомалекулярными полимерами (БСА, ПЭГ, желатин, поливинилпирралидон и т.п.).

Причем удешевление и увеличение стабильности иммунодиагностикумов достигается использованием в качестве маркеров широкого круга доступных, дешевых и стабильных неорганических веществ, а также щадящим и экономным расходом иммунореагенов.

Увеличение чувствительности достигается выбором в качестве маркеров веществ, обладающих выраженными каталитическими свойствами и способных с высокой чувствительностью выявляться в индикаторных каталиметрических реакциях (таких, как труднорастворимые в воде соединения железа или меди, или марганца, или хрома, или никеля, или кобальта, или титана, или молибдена, или вольфрама, или серебра, а также труднорастворимые в воде соли галогенводородных кислот или коллоиды селена или серебра или золота), а также применением более крупных частиц маркера, способных обеспечить накопление маркера, достаточной для эффективного проведения индикаторной каталиметрической реакции.

Новыми по сравнению с прототипами являются следующие признаки иммунодиагностикума: используемые маркеры представляют собой активные неорганические катализаторы: золото или серебро, или селен, или труднорастворимые в воде соединения серебра или железа, или меди, или марганца, или хрома, или никеля, или кобальта, или титана, или молибдена, или вольфрама, или ванадия, или селена, или ртути, или труднорастворимые соли галогенводородных кислот; предпочтительные размеры частиц маркера находятся в диапазоне 0,1 10 мкм; сорбционная связь иммунореагента на частицах маркера установлена соотношением по массе иммунореагента к маркеру в диапазоне от 1:100000 до 1: 1000.

Наиболее близким решением предлагаемого способа имммуноанализа является способ твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (Авт. св. СССР N1243504, кл. G 01 N 33/54). Способ ИФА включает иммобилизацию лиганда на поверхности ячеек иммунологическмх планшетов (матрицу); осуществление иммунологической реакции между иммобилизованным лигандом и специфически связывающимся с ним иммунодиагностикумом; выявление иммунных комплексов "лиганд
иммунодиагностикум" по наличию или количеству связывающегося с матрицей маркера, определяемого в ферментативной реакции разложения субстрата в присутствии хромогенного индикатора. Метод ИФА нашел широкое применение в научной и медицинской практике благодаря своей доступности и высокой чувствительности. Описанный способ анализа является наиболее близким к предлагаемому решению и имеет следующие недостатки:
относительно высокая стоимость используемых в ИФА диагностикумов, обусловленная сложностью процедур выявления и очистки биологически активного фермента маркера и иммунореагентов, неизбежными значительными потерями маркера и иммунореагентов в процессе получения конъюгатов путем ковалентного связывания;
подверженность результатов анализа влиянию примесей в исследуемом образце, способных инактивировать или блокировать фермент, что ограничивает сферу применения ИФА исследованиями относительно чистых проб;
необходимость обеспечения в процессе анализа строгих физиологических условий (температура, буферные системы, особая чистота реактивов) для обеспечения нормального функционирования фермента.

Задачей изобретения является создание такого способа твердофазного иммуноанализа, который позволит использовать более дешевые и стабильные иммунодиагностикумы при сохранении или повышении чувствительности иммунологических тестов и скорости анализа по сравнению с ИФА.

Поставленная задача решается использованием способа твердофазного иммуноанализа, включающего иммобилизацию определяемого лиганда на матрицу - планшеты для иммунологических реакций, осуществление иммунологической реакции между иммобилизованным лигандом и иммунодиагностикумом, выявление образовавшихся иммунных комплексов "лиганд иммунодиагностикум" по наличию или количеству связавшегося с матрицей маркера.

При этом повышение чувствительности достигается применением эффектного способа выявления маркера индикаторной каталиметрической реакции, характерной для данного маркера, а также за счет увеличения массового соотношения "маркер: иммунореагент" путем преимущественного использования крупных частиц маркера с размерами, превышающими 0,1 мкм.

Сокращение времени анализа достигается подбором эффективных комбинаций маркер (катализатор) субстрат, проведением каталиметрической реакции в объеме в гетерогенной системе после снятия маркера с поверхности матрицы и удаления с его поверхности биокомпонентов соответствующим буферным раствором или в гомогенной системе после перевода маркера в ионную форму добавлением кислоты или щелочи, а также возможностью проведения каталиметрической реакции при повышенной до 70^oC температуре.

Новыми по сравнению с прототипом являются следующие признаки способа твердофазного иммуноанализа:
выявление иммунных комплексов лиганда и иммунодиагностикума производят по наличию или количеству связывающегося с матрицей маркера в характерной для этого маркера индикаторной каталиметрической реакции путем введения в реакционную смесь субстрата, содержащего индикаторные вещества и обеспечивающие при контакте с маркером изменение оптических свойств этой реакционной среды;
индикаторную каталиметрическую реакцию осуществляют в объеме после снятия маркера с матрицы и удаления с его поверхности биокомпонентов соответствующим буферным раствором;
индикаторную каталиметрическую реакцию осуществляют в объеме после перевода маркера в ионную форму добавлением в ячейки планшета кислоты или щелочи;
индикаторную каталиметрическую реакцию проводят при повышенной до 70^oC температуре.

В соответствии с принципом, положенным в основу предлагаемого метода анализа, авторы считают целесообразным определять последний термином "твердофазный иммунокаталиметрический анализ" или в сокращении "ТИКА". Такая терминология использована в дальнейшем описании.

Термин "определяемый лиганд" в данном описании является определением вещества, соединения или образования, наличие или количество которого в тестируемом образце необходимо установить. "Определяемый лиганд" может быть антителами, моно- или полиспецифичным простым или сложным соединениями, имеющими, как минимум, один общий эпитопный сайт или рецептор, к которому может быть получен связывающий белок иммунореагент. Способом, описанным в изобретении, могут анализироваться иммуноглобулины, инфекционные агенты различной природы, гормоны, витамины, некоторые токсиканты и другие соединения, способные взаимодействовать со специфическими связывающими компонентами иммунореагентами.

В соответствии с вышеизложенным, термином "иммунореагент" в настоящем описании определяются антигены, антитела, стафилококковый протеин А и другие соединения, способные специфически распознавать и связывать определяемый лиганд.

Термином "маркер" в данном описании определен широкий круг неорганических веществ (элементов и их соединений), способных образовывать взвеси в водной среде, обладающих выраженными каталитическими свойствами и способностью с высокой чувствительностью выявляться в индикаторных каталиметрических реакциях, а также не оказывающих при контакте повреждающего воздействия на специфические характеристики используемых иммунореагентов. Примерами веществ, способных выступать в роли "маркеров", могут служить платина, золото, серебро, цинк, железо, медь, хром, никель, кадмий, селен, мышьяк, сера и некоторые другие элементы; нерастворимые в воде соли Zn(IV), Co(II), Th(IV), Nb(V), Ta(V), Mo(VI), W(VI), Fe(III), Ti(IV), V(V), Cr(VI) и др. а также нерастворимые соли галогеноводородных кислот. Все перечисленные выше вещества обладают выраженными каталитическими свойствами по отношению к широкому кругу реакций. В частности, многие из них могут катализировать реакции окисления пероксидом водорода индикаторных веществ, используемых при постановке ИФА, таких, например, как орто-фенилендиамин. В отношении ряда из перечисленных потенциальных маркеров, таких как платина, золото, серебро, медь, селен, иодид серебра, бромид серебра, гидроокись меди, гидроокись хрома, оксид ванадия, сульфид мышьяка, сульфид свинца, сульфат бария, двуокись титана, окись железа, гидроокись железа, гидроокись алюминия и некоторых других в предыдущих исследованиях (см. Евр. пат. NN 0158746; 0298368), показана возможность получения стабильных препаратов при конъюгировании их с иммунореагенами. На выбор маркера накладывает ограничения необходимость проведения индикаторной каталиметрической реакции непосредственно в ячейках планшета для иммунологических реакций. Эти реакции должны протекать в объеме, ограниченном емкостью ячейки планшета, при нормальном давлении и температуре, лимитированной термостойкостью материала, со скоростью, достаточной для регистрации результатов в течение 20-30 мин. Кроме того, по экономическим соображениям в выборе маркера целесообразно ориентироваться на наиболее дешевые и доступные катализаторы и субстраты. Использование в примерах к настоящему описанию гидроокиси железа в качестве маркера и перекиси водорода с добавлением о-фенилендеамина в качестве субстрата демонстрирует одно из наиболее доступных и просто реализуемых в сложившихся условиях решений и не претендует на оптимальность сделанного выбора. Известные свойства таких активных и доступных катализаторов, как соли титана, кобальта, меди и других металлов позволяют уверенно предполагать наличие комбинаций "маркер - субстрат", обеспечивающих большую чувствительность и экспрессность твердофазного иммунокаталиметрического теста по сравнению с приведенными в настоящем описании примерами.

Приготовление иммунодиагностикума включает следующие этапы.

1. Получение водной взвеси частиц маркера с заданной дисперсностью;
2. Коньюгирование полученных на предыдущем этапе частиц маркера со специфическим к определяемому лиганду иммунореагентом;
3. Стабилизация полученного конъюгата и блокирование свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера высокомолекулярными биополимерами;
4. Коррекция водородного показателя водной взвеси полученного иммунодиагностикума до параметров, необходимых для осуществления иммунологической реакции.

(1). Получение высокодисперстной водной взвеси маркера может быть осуществлено любым способом, в том числе и методами, описанными в ранее опубликованных патентах, использующих гидрозоли неорганических веществ. Однако в отличие от ранее опубликованных технических решений, использующих гидрозоли с размером частиц от 5 до 450 нм, в изобретении предпочтение отдается более крупным частицам с оптимумом размеров 0,1 10 мкм. При этом обоснованием нижней границы этого диапазона служит расчетная величина массы катализатора, необходимой для достижения чувствительности ИФА, а верхняя граница диапазона ограничена устойчивостью водной взвеси частиц катализатора. Для выделения фракции частиц необходимого размера можно использовать различные методы сепарирования, например центрифугирование в режимах, рассчитанных на основании седиментационных характеристик частиц определенного маркера с заданными размерами или фильтрование полидисперсной взвеси частиц маркера через мембраны с соответствующим размером пор. В ряде случаев необходимая дисперсность может быть обеспечена условиями получения гидрозолей.

(2) Коньюгирование полученных на этапе (1) частиц маркера со специфическим к определяемому лиганду иммунореагентом может быть осуществлено различными известными способами, таким как ковалентное связывание, физическая сорбция или с использованием промежуточных связующих агентов (например, в случае конъюгирования маркера с иммуноглобулинами, поверхность маркера может быть предварительно насыщена молекулами стафилококкового протеина А, а затем путем иммунохимического взаимодействия последний может быть связан со специфическими к определяемому лиганду иммуноглобулинами). Степень насыщения поверхности частиц маркера специфическим иммунореагентом определяется качеством последнего. Вследствие значительной площади поверхности частиц маркера (с поверхностью частицы размером 1-2 мкм могут быть связаны сотни тысяч молекул типа иммуноглобулина G) в настоящем способе могут быть использованы иммунореагенты с относительно невысокой специфической активностью (1% и менее), поскольку достаточный уровень активности иммунодиагностикума может быть достигнут при сорбции на частице маркера от нескольких сотен до нескольких тысяч активных молекул специфического иммунореагента. По этой же причине при использовании предлагаемого способа отсутствует необходимость проводить конъюгирование при избытке иммунореагента достаточно хорошего качества, как это практиковалось ранее. Расчеты показывают, что оптимальная нагрузка маркера иммуноглобулинами класса G при использовании препаратов lgG, содержащих около 1% специфических активных молекул, и частиц маркера с размерами в диапазоне 0,1 10 мкм достигается при соотношении по массе конъюгируемых иммуноглобуленов и маркера в диапазоне соответственно от 1:1000 до 1:100000. При этом иммуноглобулины занимают около 6-10% поверхности маркера при общем числе таких молекул на одной частице около нескольких тысяч. Эксперименты показали, что больший уровень специфической нагрузки не дает выигрыша в чувствительности анализа и, более того, в ряде случаев повышает неспецифический фон определения. Экономное использование иммунореагентов выгодно отличает предлагаемый способ от ранее описанных методов получения диагностикумов, требующих применения значительного избытка дорогостоящих высокотитражных или аффинно очищенных иммунореагентов.

При обработке процедуры конъюгирования хорошие результаты получали связывая иммунореагент с поверхностью маркера методом простой физической сорбции. Причем при дробном добавлении взвеси маркера к раствору иммунореагента (в 3-5 приемов с интервалами 10-15 мин при перемещении) удается максимально сорбировать иммунореагент и избежать тем самым обязательной в ранее описанных способах процедуры отделения иммунодиагностикума от несвязавшегося с маркером иммуноградиента, что значительно упрощает процедуру приготовления реагента. Такое эффективное использование наиболее дорогостоящего компонента иммунодиагностикумов-иммуноградиента является экономически выгодным отличием изобретения от ранее описанных способов, при осуществлении которых, как правило, значительная часть иммуноградиента уходит в отходы.

(3) Стабилизацию полученного конъюгата и блокирование свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера производят одним из известных высокомолекулярных соединений таких, как бычий сывороточный альбумин (БСА), овальбумин, лактальбумин, желатин, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и т.п. или их комбинацией. Суммарная концентрация блокирующих полимеров должна находиться в диапазоне 0,1 3 мас.

(4) Коррекцию водородного показателя до физиологических параметров, необходимых для осуществления иммунологической реакции, производят 0,01 М фосфатным буферным раствором с 0,15 М NaCl (pH 7,2-7,4).

При необходимости длительного хранения в полученный иммунодиагностикум могут добавляться консерванты такие, как азид натрия до 0,02-0,1% глицерин до 50% -ной конечной концентрации и т.п. В ряде случаев, при использовании недеформируемых частиц маркера, возможно лиофильное выслушивание иммунодиагностикума.

Полученный иммунодиагностикум используют при постановке твердофазного иммунокаталиметрического анализа.

Способ твердофазного иммунокаталиметрического анализа (ТИКА) включает следующие стадии:
1.иммобилизация определяемого линганда на матрице;
2.осуществление иммунологической реакции между иммобилизованным лигандом и иммунодиагностикумом;
3. осуществление индикаторной каталиметрической реакции;
4. учет результатов и их интерпретация.

(1) В качестве матрицы (твердой фазы) в описываемом способе могут быть использованы планшеты и отдельные ячейки для иммунологических реакций, изготовленные из полистирола полихлорвинила и других сорбирующих материалов. В то же время нет принципиальных ограничений для применения в качестве матрицы подложек и мембран из различных материалов, например нитроцеллюлозных, стекловолокнистых, найлоновых фильтров и других материалов, на которых может быть надежно зафиксирован определяемый лиганд, однако их использование требует модификации описываемого варианта ТИКА.

Иммобилизацию лиганда из жидкого образца на матрице осуществляют любым известным методом, не приводящим к утрате специфических свойств лиганда. Могут быть использованы такие способы, как физическая сорбция, ковалентное связывание, иммунное взаимодействие типа "сэндвич-способа" и т.п. По истечении периода инкубации, достаточного для фиксирования лиганда на матрице, остаток анализируемого жидкого образца удаляют и производят блокирование свободных сайтов связывания на поверхности матрицы блокирующими высокомолекулярными веществами, аналогичными описанным в п.3 процедуры приготовления иммунодиагностикума. Для того, чтобы избежать случайных взаимодействий, целесообразно использование одного и того же блокирующего агента в процедурах приготовления иммунодиагностикума и иммобилизации лиганда на матрице. (2) После достаточного периода инкубации блокирующего раствора и необязательной процедуры отмывки в ячейки планшета вносят рабочее разведение иммунодиагностикума и инкубируют при 37^oC в течение 20-30 мин для осуществления иммунной связи между иммубилизованным лигандом и частицами иммунодиагностикума, после чего остатки несвязавшегося иммунодиагностикума удаляют соответствующей процедурой отмывки.

Из приведенного описания следует, что 1 и 2 стадии ТИКА по существу не отличаются от соответствующих стадий ИФА.

(3) Выявление или количественное определение иммунных комплексов "лиганд-иммунодиагностикум" производят, определяя наличие (количество) связавшегося с матрицей маркера в характерной для него индикаторной каталиметрической реакции (ИКР). Для выявления маркера может быть использована любая известная для него каталиметрическая реакция, обеспечивающая наибольшую чувствительность, достаточную селективность и экспрессность определения. Скорость реакции должна обеспечивать изменение оптических свойств реакционной смеси не менее 0,2 ОД за 30 мин. Известно, что каталиметрическая реакция может развиваться на границе раздела частиц катализатора (маркера) и индикаторного раствора. Однако скорость такой реакции не велика. Повысить скорость можно путем увеличения площади контакта индикаторного раствора и катализатора за счет десорбции частиц маркера с матрицы и удаления покрывающих частицы маркера белков иммуноградиента и блокирующих компонентов. Однако наиболее активно протекает ИКР в гомогенной среде после перевода маркера-катализатора в ионную форму. Способ перевода маркера в ионную форму зависит от химической природы используемого катализатора и, как правило, осуществляется воздействием кислот или щелочей. Гомогенный вариант ИКР является наиболее предпочтительным в рамках концепции изобретения. Применение десорбционного варианта каталитической реакции в гетерогенной системе целесообразно при использовании катализаторов, которые в обычных условиях сложно или невозможно перевести в ионную форму (например, золи золота или платина). Дополнительным резервом увеличения скорости ИКР во всех описанных выше вариантах может служить повышение температуры реакции, практически ограниченное термостойкостью материала матрицы (около 70^oC).

(4) Результаты ТИКА могут учитываться визуально или регистрироваться спектрофотометрически при определенной длине волны пропускаемого света (например автоматическим сканирующим спектрофотоматериалом типа "Мультискан" для учета результатов ИФА на планшетах), как цветовой сигнал реакционной среды в ячейках планшета, характеризующий индикаторную каталиметрическую реакцию. Интенсивность цветового сигнала пропорциональна количеству маркера в определяемом объеме.

Интерпретацию результатов производят путем сравнения интенсивности цветового сигнала анализируемого образца (образцов) с контрольными образцами, заведомо не содержащими определяемого лиганда, или в случае количественной оценки с серией известных разведений лиганда.

В настоящем примере описаны варианты получения разноименно заряженных гидрозолей гидроокиси железа. Наличие альтернативных вариантов заряда гидрозолей позволяет проводить конъюгирование с иммунореагентами, имеющими различные изоэлектрические точки, в наиболее щадящих (близких к физиологическим) условиях.

Вариант 1. Получение положительно заряженного гидрозоля гидроокиси железа (ГГЖ[+]).

К одному объему кипящей дистиллированной воды медленно, так чтобы кипение практически не прекращалось, добавляют двукратный объем 6%-ного хлорного железа. После остывания смеси ее дважды центрифугируют по 10 15 мин при 4500-5000 об\мин, каждый раз отбрасывая надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок в дистиллированной воде. При таком режиме центрифугирования оседают лишь частицы с размерами, превышающими 0,5 мкм. Измеряют водородный показатель гидрозоля и доводят его 1 М-ным раствором трисоснования до 3,9-4,1 ед. pH. В таком виде гидроокись железа имеет положительный заряд до значений 10-11 ед. pH и готова для конъюгирования с иммунореагентами. Для конъюгирования необходимо использовать свежий (не более суток с момента приготовления) гидрозоль.

Вариант 2. Получение отрицательно заряженного гидрозоля гидроокиси железа (ГГЖ[-]).

Для получения отрицательно заряженных гидрозолей используют принцип модифицирования поверхности частиц гидроокиси железа за счет хемосорбции на ней анионов железосинеродистой кислоты. Наиболее полное насыщение поверхности этими анионами происходит при использовании свежих препаратов гидрозолей, описанных в варианте 1.

К свежему препарату положительно заряженного гидрозоля, полученного по процедуре, описанной в варианте 1, добавляют концентрированный раствор железосинеродистого калия, содержащего 5-кратное его количество по отношению к массе гидроокиси железа. Трехкратным центрифугированием при 4-5 тыс. оборотов в течение 10-15 мин освобождаются от избытка реагентов, каждый раз удаляя надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок пипетированием в дистиллированной воде. Корректируют водородный показатель до 7,6-8,0 ед. pH добавлением соляной кислоты или трис-основания. В таком виде препарат может быть использован для конъюгирования с отрицательно заряженными биополимерами при нейтральных либо слабощелочных значениях водородного показателя.

Вариант 3. Получение гидрозоля ферриглицерата аммония (ГФА).

41,6 г хлорного железа растворяют в 66,4 мл дистиллированной воды и вносят в полученный раствор 33,3 мл глицерина. После перемешивания добавляют 26 мл 20% -ного раствора аммиака. К 10 мл ГФА добавляют при перемешивании 1 М раствор трис-основания до установки водородного показателя на уровне 7,4-7,6 ед. pH. Центрифугируют полученную взвесь так же, как в варианте 1.

Методом фильтрования через мембранные фильтры, высушивания и взвешивания определяют общую весовую концентрацию частиц в препарате ГГЖ[+] ГГЖ[-] или ГФА и в дальнейшем используют полученную величину для расчетов соотношения "гидрозоль:иммунореагент" при получении иммунодиагностикума.

Для получения конъюгатов используют lgG, выделенные из иммунной сыворотки высаливанием сульфатом аммония с последующим диализом против стократных и более объемов 0,01 М трис-HCl буфера с водородным показателем 7,6-8,0 ед. pH с тремя сменами буфера. Возможно использование других методик выделения и очистки lgG. В полученных препаратах lgG спектрофотометрически измеряют концентрацию общего белка способом с применением Кумасси G-250.

Вариант 1. Получение конъюгата ГГЖ[-] с иммуноглобулинами класса G.

Отмеривают необходимый объем препарата lgG и определяют соответствующее ему количество гидрозоля из расчета: 1мг гидроокиси железа на 1 мкг общего белка препарата lgG. Добавляют к раствору иммунореагента расчетное количество гидрозоля в три приема с интервалами по 10-15 мин при перемешивании (в первый прием вносят половину расчетного объема ГГЖ[-] во второй половину остатка и в третий остаток), инкубируют при перемешивании 10-15 мин. К полученному таким образом препарату добавляют в соотношении 1:10 по объему 10% -ный раствор БСА на фосфатном буфере с водородным показателем 7,2-7,4 ед. pH с добавлением 0,1% азида натрия. После 10-15 минутной экспозиции с перемешиванием к полученной смеси добавляют в соотношении 1:1 стабилизирующий раствор БСА на 0,01М трис-HCl буфере с водородным показателем 7,2-7,4 ед. pH с 0,15 М хлористого натрия; 0,02 ПЭГ 20000; 0,03% ПЭГ 6000 и 0,02% азида натрия.

Вариант 2. Получение конъюгата ГГЖ[+] с иммуноглобулинами класса G.

Значение водородного показателя препарата lgG доводят до значений в диапазоне 3,9-4,1 ед. pH добавлением раствора соляной кислоты. Вносят расчетное количество ГГЖ[+] так же, как в варианте 1, и, после 10-15 минутной экспозиции при перемешивании к полученной смеси добавляют 10%-ный раствор БСА с 0,1% азида натрия (pH 3,9-4,1) в соотношении 1:10. Спустя 10-15 мин доводят значение водородного показателя до 7,2-7,4 ед. pH добавлением 1 М трис-основания (за первый прием вносят 50 мкл раствора трис-основания на 1 мл внесенного 10%-ного раствора БСА, а затем проводят точную корректировку). К полученной смеси добавляют стабилизирующий 1%-ный раствор БСА (см. вариант 1) в соотношении 1:1.

Перед употреблением полученные иммунодиагностикумы разводят до рабочего разведения тем же стабилизирующим 1%-ным раствором БСА (рабочее разведение устанавливают экспериментально для каждой партии диагностикума).

Вариант 3. Получение конъюгата ГФА с иммуноглобулинами класса G.

Добавляют дробно (так, как описано в варианте 1) необходимое количество взвеси маркера к расчетному (см. вариант 1) объему раствора иммуноглобулинов (полученных по описанной в предисловии процедуре). После 10 минутного перемешивания при комнатной температуре добавляют 10%-ный раствор БСА в соотношении 1:10. После 10 минутного перемешивания добавляют 0,2%-ный раствор желатина в соотношении 1:2. Перемешивают полученную смесь в течение 10 мин. Измеряют водородный показатель и при необходимости корректируют его до значения 7,2-7,4 ед. pH, добавляют 5 мл глицерина в качестве консерванта-стабилизатора. В таком виде иммунодиагностикум хранят или используют в постановке ТИКА.

Пример 3. Сравнение чувствительности твердофазных иммунокаталиметрического (ТИКА) и иммуноферментного (ИФА) методов выявления антител против lgG человека в прямом варианте постановки.

Для постановки ИФА использовали коммерческий препарат "Антитела кроличьи диагностические против иммуноглобулинов G человека, меченные пероксидазой, сухие", производства Ленинградского НИИВС. Для постановки ТИКА использовали конъюгаты ГГЖ[+] с антителами, выделенными из коммерческой козьей сыворотки против lgG человека, производства Московского ИЭМ АМН СССР. Оба метода использовали в прямой постановке с иммобилизацией антигена на отечественных планшетах для иммунологических реакций физической сорбцией в течение 18 ч при 4^oC.

В качестве антигена и в том, и в другом случаях использовали препарат нормальных иммуноглобулинов человека производства МЭМ АМН СССР. Контролем служили ячейки планшета, в которые вместо антигена вносили по 50 мкл 0,01М калий фосфатного буфера 7,2-7,4. Трехкратные отмывки после стадий нанесения антигена и собственно иммунологической реакции проводили 0,01 М калий фосфатным буфером с водородным показателем 7,2-7,4 ед. pH с 0,1% твин-20. В качестве субстратной смеси в ИФА использовали 0,01 М перекись водорода с 0,4 мг/мл о-фенилендиамина на 0,1 М цитратном буфере с водородным показателем 5,2-5,4 ед. pH, а в ТИКА 0,01 М перекись водорода с 2 мг/мл о-фенилендиамина на дистиллированной воде. При постановке ТИКА после осуществления стадии иммунологической реакции антиген-антитело в ячейки планшета вносили до 50 мкл 2N раствора соляной кислоты для перевода гидроокиси железа в ионную форму и сразу после этого добавляли по 100 мкл субстрата на ячейку.

Взаимодействие с субстратной смесью осуществляли при комнатной температуре в течение 30 мин. Учет результатов проводили на сканирующем спектрофотометре типа "Мультискан" (Финляндия) при длине волны 492 нм.

Результаты показали, что в исходной постановке, в одинаковых условиях предложенный способ (ТИКА) в 8 раз (3 двукратных разведения) чувствительнее аналога (ИФА).

Пример 4. Выявление вируса осповакцины в жидких образцах в "сэндвич" - варианте постановки предложенного способа (ТИКА) с использованием конъюгатов на основе положительно и отрицательно заряженных гидрозолей гидроокиси железа.

Использовали конъюгаты ГГЖ[+] и ГГЖ[-] с иммуноглобулинами класса G, выделенными из коммерческой противооспенной кроличьей сывортки, производства Томского НИИВС. Эти же антитела использовали для стандартной сенсибилизации ячеек отечественных планшетов для иммунологических реакций. В качестве антигена использовали коммерческий препарат антигена вируса осповакцины производства Томского НИИВС. В качестве контролей использовали ячейки без антигена, а также ячейки с антигеном, обработанные конъюгатом ГГЖ[+] (ГГЖ[-]) с lgG из нормальной кроличьей сыворотки и ненагруженный ГГЖ[+] (ГГЖ[-]) со стабилизаторами. Отмывки проводили 1М NaCl на дистиллированной воде с 061 М трис-основания и 0,05% твин-20. Все нанесения, экспозиции и отмывки выполняли в соответствии с общепринятой методикой постановки ИФА за исключением финальной стадии, на которой связавшийся с подложкой ГГЖ[+] (ГГЖ[-]) переводили в ионную форму добавлением в каждую ячейку по 50 мкл 2N соляной кислоты и затем вносили по 100 мкл субстрата (0,01М раствора перекиси водорода с 0,1 мг/мл о-фенилендиамина) на ячейку. Экспозиция до проявления результатов при комнатной температуре в среднем составляла 20 30 мин. Проявление можно было ускорить до 5-10 мин, повышая температуру до плюс 50-60^oС. Учет проводили так же, как описано в предыдущем примере.

Чувствительность определения вируса осповакцины в описанном варианте постановки предложенного способа (ТИКА) с использованием ГГЖ[+] составила около 1000 БОЕ/образец (2·10⁴ БОЕ/мл), а с применением ГГЖ[-] около 300 БОЕ/образец (6·10³БОЕ/мл) или соответственно около 20 и 3 нг/мл. Хранение конъюгатов при +4+1 С в течение 6 месяцев (срок наблюдения) привело к незначительному (не более 10%) снижению специфической активности препаратов.

Пример 5. Определение вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в прямом варианте постановки предложенного способа (ТИКА) с использованием конъюгата специфических иммуноглобулинов с ГФА.

В качестве антигена использовали очищенный высокоскоростным центрифугированием и инактивированный ультрафиолетовым облучением препарат вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (штамм Тринидат), из которого готовили серию стандартных двукратных разведений на фосфатном буферном растворе (pH 7,2-7,4).

Для получения специфических конъюгатов по процедуре, описанной в варианте 3 примера 2, использовали lgG, выделенные сульфатом аммония из гипериммунных кроличьих сывороток против вируса ВЭЛ. В качестве контролей использовали конъюгаты ГФА с нормальными кроличьими lgG и ненагруженный ГФА со стабилизаторами, а также ячейки планшета без антигена. Рабочие разведения конъюгатов готовили на 0,01М фосфатном буферном растворе (pH 7,2-7,4).

Иммобилизацию на отечественных полистироловых планшетах для иммунологических реакций проводили методом физической сорбции при 4 С в течение 18 ч с последующей блокировкой свободных сайтов связывания на поверхности планшета 1%-ным раствором БСА на 0,01М фосфатном буферном растворе (pH 7,2-7,4) в течение 2 ч при комнатной температуре.

Отмывки производили 1М раствором NaCl на дистиллированной воде с 0,05% твин-20 трехкратно по 5-10 мин.

Общая постановка анализа в объеме 50 мкл на ячейку проводилась по общепринятой для ИФА методологии за исключением того, что пред внесением субстратной смеси гидрозоль, связавшийся с матрицей, переводили в ионную форму добавлением в каждую ячейку по 50 мкл 2N раствора соляной кислоты.

Учет результатов проводили после 20 минутной экспозиции при комнатной температуре на ридере "мультискан" при длине волны 492 нм.

Достоверное выявление вируса ВЭЛ при описанной постановке предложенного способа (ТИКА) было зафиксировано при концентрации около 10⁸ виронов/мл (10 нг/мл), а абсолютная чувствительность метода составила около 5·10⁶ вирионов/образец (0,5 нг/ образец).

Гидроокись железа и ферроглицерат аммония являются примерами большого ряда неорганический веществ, для которых уже показана возможность получения стабильных диагностикумов при конъюгировании с иммунореагентами (Пат. ЕВП N 0158746 и N 0298368). Вещества из этого ряда и близкие к ним по физико-химическим свойствам, для которых отработаны высокочувствительные индикаторные реакции (см. Г.Мюллер, М.Отто, Г.Вернер "Каталиметрические методы в анализе следов элементов" -М.Мир, и веществ особой чистоты." -М. Химия, 1983) определили перечень маркеров, используемых в предложенном диагностикуме. Основанием для включения маркеров в этот перечень служат известные сведения о возможности получения на их основе стабильных диагностикумов, а также о возможности высокочувствительного выявления этих веществ в индикаторных каталиметрических реакциях.

Предлагаемые иммунодиагностикумы и основанный на их применении способ твердофазного иммуноанализа за счет применения каталиметрического метода выявления связавшегося с матрицей маркера, а также использования крупных (более 0,1 мкм) его частиц и обусловленного этим высокого уровня соотношения "маркер:иммунореагент" обеспечивают чувствительность, не уступающую, а в ряде случаев превосходящую чувствительность ИФА и при этом имеют перед последним ряд преимуществ:
использование дешевой и стабильной метки;
простота получения иммунодиагностикума;
возможность использования иммунореагентов с относительно низким специфическим титром;
отсутствие в способе приготовления диагностикумов процедуры ковалентного связывания, существенно снижающей специфическую активность иммунореагентов;
экономное и безотходное использование иммунореагентов;
отсутствие потребности в буферных системах на стадии проявления результатов, необходимых в ИФА для функционирования фермента;
меньшая зависимость специфичности определения от примесей в образце и чистоты используемых препаратов;
возможность сокращения времени анализа на стадии проявления результатов за счет десорбции маркера с матрицы или перевода его в ионную форму, а также за счет повышения температуры реакции до 70^oC.

Формула изобретения

1. Иммунодиагностикум, содержащий водную взвесь частиц маркера, сорбционно связанных с одним из специфических иммунореагентов антигеном или иммуноглобулинами, или стафилококковым протеином А, стабилизированный высокомолекулярными биополимерами, отличающийся тем, что в качестве маркера введены нерастворимые или труднорасворимые в воде неорганические катализаторы в виде частиц с размерами 0,1 -10,0 мкм при значительном превышении отношения массы маркера к иммунореагенту.

2. Иммунодиагностикум по п.1, отличающийся тем, что маркер представляет собой высокодисперсную водную взвесь селена, или золота, или серебра, или труднорастворимых в воде соединений серебра, или железа, или меди, или марганца, или хрома, или никеля, или кобальта, или титана, или молибдена, или вольфрама, или ванадия, или селена, или ртути, или труднорастворимых солей галогенводородных кислот.

3. Иммунодиагностикум по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что сорбционная связь иммунореагента на частицах маркера установлена соотношением по массе иммунореагента и маркера 1 100000 -1000 соответственно.

4. Способ твердофазного иммуноанализа, включающий иммобилизацию лиганда на матрицу, осуществление иммунологической реакции между иммобилизованным лигандом и специфически связывающимся с ним иммунодиагностикумом с последующим выявлением образовывавшихся комплексов лиганда и иммунодиагностикума по наличию или количеству связавшегося с матрицей маркера, отличающийся тем, что выявление иммунных комплексов лиганда и иммунодиагностикума производят в характерной для данного маркера индикаторной каталиметрической реакции путем введения в реакционную смесь субстрата, содержащего индикаторные вещества, обеспечивающие при контакте с маркером изменение оптических свойств этой реакционной смеси.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что индикаторную каталиметрическую реакцию проводят после десорбции маркера с матрицы и удаления с его поверхности иммунореагента и блокирующих компонентов добавлением соответствующего буферного раствора.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что индикаторную каталиметрическую реакцию проводят после перевода маркера в ионную форму добавлением кислоты или целочи.

7. Способ по пп. 4 6, отличающийся тем, что индикаторную каталиметрическую реакцию осуществляют при температуре 50 70^oС.