Способ разделения и детектирования аминокислот

 

Назначение: изобретение относится к аналитической химии, а именно, к тонкослойной хроматографии аминокислот, и может найти применение при анализе чистоты аминокислот, производимых в промышленности, и в медицине - для диагностики наследственных дефектов обмена веществ. Сущность изобретения: аминокислоты разделяют двумерной тонкослойной хроматографией с последовательным использованием двух хроматографических систем растворителей: изопропанол - ацетон - 24-25%-ный раствор аммиака - вода в соотношении (19,0-27,0): (20,0-26,0): (3,0-6,5):(6,0-10,0) (по объему) и хлороформ - этанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении (23,0-27,0):(13,5-16,0):(4,5-6,5): (1,3-3,5) (по объему). Для детектирования аминокислот используют нингидриновый реактив и дополнительно реактивы Эрлиха, Несслера.

Изобретение относится к аналитической химии, конкретно, к тонкослойной двумерной хроматографии смесей аминокислот.

Изобретение может найти применение при анализе чистоты аминокислот, производимых в промышленности, в медицине, в частности для дифференциальной диагностики наследственных дефектов обмена веществ, при аминокислотном анализе в пищевой и перерабатывающей промышленности и т.п.

Для разделения аминокислот используются различные хроматографические и электрофоретические методы. Наиболее широко применяются тонкослойная (ТСХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография. Достоинствами метода ТСХ являются простота, отсутствие дорогостоящего оборудования, а значит, доступность массовому потребителю, и высокая скорость анализа.

Принципиальным моментом для проведения ТСХ аминокислот является выбор сорбирующего слоя, наносимого на подложку, и хроматографической системы растворителей. Для ТСХ всего спектра известных аминокислот до сих пор не подобраны универсальные условия разделения (сорбент система растворителей). Это связано с тем, что сам объект смесь аминокислот условно распадается на две группы с низкими (до 0,3) и высокими (0,3-1,0) значениями коэффициента подвижности Rf *(Коэффициент подвижности отношение скорости миграции данной аминокислоты к скорости миграции фронта растворителя) /1/. Тем не менее известны попытки разделения не всего спектра, а 20 основных аминокислот биологических жидкостей.

Так, известен способ разделения основных аминокислот в биологических жидкостях с помощью одномерной ТСХ**(Одномерная ТСХ ТСХ, предполагающая элюирование пластинки в одном направлении) на пластинках "Силуфол" (ЧССР) и фирмы "Merck" (Германия) со слоем сорбента силикагеля /1/. Для разделения используют системы растворителей: н-бутанол ледяная уксусная кислота вода в соотношении 3: 1:1 (по объему). Разделение аминокислот протекает за 2 ч при комнатной температуре. Окрашивание хроматограмм (детектирование) производят погружением пластинки в нингидриновый реактив. Окраска проявляется в темноте в течение 2 ч. Способ позволяет разделить 11 аминокислот с Rf0,13 и Rf0,4. Аминокислоты с промежуточными значениями Rf не поддаются интерпретации известным способом из-за перегруженности этой области аминокислотам и неэффективности данной системы растворителей для их разделения. Известный способ рекомендован в качестве экспресс-метода анализа аминокислот биологических жидкостей, однако только для предварительной диагностики заболевания. Результаты анализа приходится подтверждать с помощью дополнительных методик определения конкретных аминокислот.

Известен способ разделения 15 основных аминокислот с помощью двумерной ТСХ*** (Двумерная ТСХ ТСХ, предполагающая элюирование пластинки в двух взаимно перпендикулярных направлениях) на силикагеле фирмы Whatman (США) с последовательным использованием двух систем растворителей: н-бутанол - уксусная кислота вода (4: 1:5) и фенол вода (15:1) /2/. Детектирование аминокислот проводят с использованием нингидринового реактива. Этот способ разделения аминокислот наиболее эффективен из известных аналогов, но длителен по времени ( > 7 ч). Способ позволяет разделить с хорошим результатом 15 аминокислот из 20 основных аминокислот биологических жидкостей.

Таким образом, проблема разделения аминокислот до сих пор не решена.

Задачей изобретения является разработка метода разделения и анализа широкого спектра аминокислот ( > 20).

Поставленная задача решается способом разделения и детектирования аминокислот с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на силикагеле с последовательным использованием двух систем растворителей: изопропиловый спирт ацетон 24-25% -ный водный раствор аммиака вода в соотношении (19,0-27,0): (20,0-26,0): (3,0-6,5): (6,0-10,0) (по объему) и хлороформ этанол уксусная кислота вода в соотношении (23,0-27,0):(13,5-16,0):(4,0-6,5):(1,3-3,5) (по объему). Окрашивание разделенных аминокислот проводят нингидриновым реактивом, дополнительно используют реактивы Эрлиха и Несслера.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Для анализа аминокислот могут быть использованы пластинки со слоем силикагеля фирмы "Merck", "Силуфол" и "Сорбфил" /1/ размером 10х10 или 10х15 см.

Для разделения аминокислот приготавливают раствор смеси 22 стандартной аминокислоты в 25%-ном этаноле в концентрации 1 мг/мл.

0,5 мкл раствора смеси стандартных аминокислот наносят в точку на расстоянии 1,5 см от нижнего и левого краев пластины. Раствор наносят при помощи микрошприца V=1 мкл.

Хроматографию осуществляют восходящим способом последовательно в двух хроматографических камерах размером 29,0х22,5х16,0 см.

Камеры для ТСХ предварительно заряжают системой растворителей и насыщают в течение 12-16 ч под плотно притертой крышкой.

Пластину с нанесенным образцом погружают нижним краем в хроматографическую камеру с системой растворителей изопропиловый спирт - ацетон 25%-ный раствор аммиака вода (26,0-22,0:4,2:8,5) (по объему) и хроматографируют на расстояние примерно 60 мм от линии старта.

После высушивания на воздухе пластину поворачивают на 90o (так, чтобы точка нанесения образца находилась в нижнем правом углу пластинки) и опускают в хроматографическую камеру с системой растворителей хлороформ этанол - уксусная кислота вода (24,5:13,5:4,0:2,2) (по объему), и хроматографируют на расстояние примерно 60 мм от линии старта. Пластинку высушивают на воздухе.

Время ТСХ 2-2,5 ч.

Детектирование хроматограмм производят нингидриновым реактивом при помощи пульверизатора или методом окунания. Состав нингидринового реактива: 100 мг нингидрина, 100 мл ацетона, 1 мл ледяной уксусной кислоты. Проявление окраски происходит в термостате при 45oC (5 мин). Для детектирования триптофана используют реактив Эрлиха. Для детектирования серина и треонина используют реактив Несслера 3.

Для идентификации конкретных аминокислот на хроматограмме смеси аминокислот предварительно проводят хроматографирование каждой из стандартных аминокислот в условиях вышеприведенного примера. Полученные хроматограммы являются эталоном для любых последующих анализов смесей аминокислот. Воспроизводимость результатов проверена на пластинках "Сорбфил", "Merck", "Силуфол" и для различных биологических жидкостей.

Аналогичным образом проводят разделение аминокислот биологических жидкостей (мочи, крови). Биологические жидкости готовят согласно методике, описанной в /1/.

Реализация заявленного интервала соотношений ингредиентов систем растворителей (включая граничные) приводит к эффективному разделению смеси стандартных аминокислот и аминокислот биологических жидкостей. На хроматограммах сохраняется порядок расположения аминокислот.

Даже незначительный выход за рамки заявляемого соотношения инградиентов двух систем растворителей и концентрации раствора аммиака приводит к резкому снижению эффективности разделения. Преимущество заявляемого способа - способность разделить 22 аминокислоты (В способе-прототипе 15 аминокислот). Таким образом, подтверждается эффективность разделения аминокислот с помощью заявляемого способа выше. Разделение аминокислот в случае заявляемого изобретения протекает значительно быстрее (за 2-2,5 ч), чем в способе-прототипе ( > 7 ч). Кроме того, предлагаемые две системы растворителей могут быть использованы (одновременно) при ТСХ на пластинках со слоем силикагеля разных фирм ("Merck", "Силуфол", "Сорбфил), т.е. универсальны для разделения аминокислот на силикагеле.

Формула изобретения

Способ разделения и детектирования аминокислот с использованием двумерной тонкослойной хроматографии, включающий нанесение пробы на основу с силикагелем, последовательную обработку основы двумя системами растворителей и детектирование разделенных аминокислот нингидриновым реагентом, отличающийся тем, что используют системы растворителей состава: изопропанол ацетон 24 - 25% -ный раствор аммиака вода в соотношении по объему 19 27 20 26 3,0 6,5 6 10 и хлороформ этанол уксусная кислота вода в соотношении по объему 23 27 13,5 16,0 4,0 6,5 1,3 3,5, а для детектирования аминокислот дополнительно используют реактива Эрлиха и Несслера.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к аналитической химии, конкретно к тонкослойной хроматографии аминокислот, присутствующих в биологических жидкостях

Изобретение относится к способу проявления в тонкослойной хроматографии (ТСХ)
Изобретение относится к хроматографии и может быть использовано для разделения смесей веществ в высокоэффективной микротонкослойной хроматографии

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в горнодобывающей, химической промышленности и других областях производства при определении ацилированных аминокислот методом тонкослойной хроматографии

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в химической, биологической, фармацевтической и других отраслях промышленности при анализе поликислот методом тонкослойной хроматографии

Изобретение относится к медицине и касается идентификации арпенала в лекарственных формах

Изобретение относится к области аналитической химии, преимущественно к анализу с применением тонкослойных хроматографических пластин

Изобретение относится к области анализа и может быть использовано для быстрого высокоэффективного разделения и индикации многокомпонентных смесей

Изобретение относится к области химического анализа и может быть использовано для определения концентраций о-хлорфенола и 2,6-дихлорфенола в воздухе при санитарно-гигиенических исследованиях на содержание хлорфенолов

Изобретение относится к аналитической химии и может найти применение в аналитических лабораториях

Изобретение относится к методам анализа токсичных соединений и может быть использовано при экологическом мониторинге

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам разделения химических соединений методом тонкослойной хроматографии, и может быть использовано при анализе смесей веществ в различных научных и практических областях биологии, химии, пищевой промышленности, охране окружающей среды, медицины и т.д
Изобретение относится к области фармацевтической химии, а именно к способам идентификации резвератрола (3,5,4'-тригидроксистильбена) с применением хроматографических методов разделения, в частности, тонкослойной хроматографией, и может быть использовано при определении содержания резвератрола в чистом виде, а также в объектах различного происхождения

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам разделения химических соединений методом тонкослойной хроматографии, и может быть использовано для анализа смесей веществ в различных областях химии, фармации, медицины, контроле состояния окружающей среды, пищевой промышленности и т.д
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и предназначено для дифференциальной диагностики степени зрелости плода (СЗП) у беременных в сроки 37-42 недели
Наверх