Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью

 

Изобретение относится к медицине и биохимии, точнее, к способам получения средств, обладающих антикоагулянтной активностью из природных источников. Способ включает экстрагирование, очистку и сушку целевого продукта, отличаясь тем, что в качестве сырья используется нативный сапропель без какой-либо предварительной обработки. Из сапропеля настаиванием получают экстракт с помощью трехкратного объема 0,05 М раствора аммиака. Экстракт концентрируют упариванием в 80-100 раз, экспонируют 24 ч при -15^oC, отделяя нерастворившиеся частицы центрифугированием с ускорением 3000-4000 g, и затем диализуют через целлофан Т - 100 против 200-кратного объема дистиллированной воды. Недиализующуюся фракцию упаривают досуха на ротационном испарителе, получая целевой продукт в виде светло-коричневого хорошо растворимого в воде порошка - целевой продукт, антикоагулянт, активность которого составляет 95 ± 3 единиц (ЕА) на 1 мг сухого вещества. Из 1 кг сапропеля получают 8000-10000 ЕА. 1 табл.

Изобретение относится к медицине и биохимии, точнее к способам получения антикоагулянтов из природных продуктов.

Известны способы получения экстрактов с антикоагулянтной активностью из растительного сырья, характеризующиеся использованием дорогостоящих органических растворителей и ограниченностью сырьевой базы.

Так, известен способ получения из травы медуницы мягчайшей экстракта с антикоагулянтной активностью (Бышевский А.Ш. Герберт И.Я. Влияние некоторых растений Западной Сибири на процесс гемокоагуляции. Проблемы освоения лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Востока. Тез. докл. Всесоюз. научн. конф. Новосибирск, 1983. с.181-181). Сущность способа заключается в том, что высушенную траву экспонируют в 70% этаноле, получая водно-этанольный экстракт, отгоняют этанол, водный экстракт концентрируют, получая целевой продукт в виде концентрированного водного экстракта.

Приведенный выше способ является аналогом заявляемого способа. Его недостатки использование для экстракции этилового спирта, трудность дозировки целевого продукта, полное отсутствие очистки целевого продукта от примесей.

Известен способ получения средства, обладающего антикоагулянтным действием путем экстракции высушенной травы медуницы мягчайшей 70% этанолом, упаривания экстракта и последовательной обработки хлороформом и этилацетатом, концентрирования на водяной бане и высушивания посредством обезвоживания 96% этанолом (П.И. Левен, И.Я. Геребер. Антикоагулянты прямого действия из медуницы мягчайшей. Тез. докл. У Всесоюз. биохимического съезда. М. Наука, 1982. т.2 с.280-280).

Для получения средства траву медуницы мягчайшей высушивают до сухо-воздушного состояния, и высушенную траву обрабатывают 70%-ным этанолом в соотношении 1: 20 в течении 60 мин дважды на кипящей водяной бане с обратным холодильником.

Спирто-водные извлечения объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, спирт из фильтрата отгоняют под вакуумом, и полученный водный остаток оставляют на 1 сутки при температуре +5^oC для осаждения хлорофилла и других балластных веществ. Выпавший осадок отделяют фильтрованием.

Фильтрат обрабатывают хлороформом в соотношении 1:1, добиваясь бесцветного хлороформного слоя (4 повтора), затем этилацетатом в соотношении 1:1 до получения бесцветного этилацетатного слоя (5 повторов).

Водное извлечение концентрируют выпариванием на кипящей водяной бане до сиропообразной консистенции и добавляют 96% этанол в соотношении 1:8.

Выпадающий осадок отделяют центрифугированием при 3000 и высушивают в токе воздуха, получая сухой экстракт целевой продукт. Из 100 г травы получают около 90 условных единиц активности (ЕА) антикоагулянта на 1 мг массы сухого вещества.

Этот способ мы рассматриваем как прототип предложенного способа. К его недостаткам относятся ограниченность сырьевой базы (медуница мягчайшая), применение дорогостоящих и токсичных реактивов (этанол, хлороформ, этилацетат), присутствие в качеств примесей других биологически активных веществ (полисахариды, дубильные вещества, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты).

Задача изобретения получение экстракта с антикоагулянтной активностью из доступного сырья без использования дорогостоящих и токсичных реактивов.

Технический результат изобретения заключается в следующем: 1. В качестве материала для получения экстракта с антикоагулянтной активностью используется сапропель распространенный и не нуждающийся в предварительной обработке продукт; 2. В том, что выделения целевого продукта применяются недорогие и нетоксичные материалы (дистиллированная вода, водный раствор аммиака и целлофан отечественного производства.

Существенные признаки изобретения заключаются в следующем: 1. Из цельного сапропеля извлекаются водорастворимые соединения путем настаивания его с 3-х кратным объемом 0,05 М водного раствора аммиака; 2. Аммиачные экстракты сапропеля упаривают в 80-100 раз с помощью ротационного испарителя и отделяют выпадающие частицы с помощью центрифугирования; 3. Надосадок выдерживают при температуре -15^oC в течение 24 ч. Размораживают при комнатной температуре, выпавший при этом осадок отделяют центрифугированием; 4. Супернатант диализуют против дистиллированной воды через целлофан Т-100 и затем выпаривают до получения светло-коричневого сухого порошка; 5. Полученный негигроскопичный порошок является целевым продуктом, растворимым в 0,14 М растворе натрия хлорида и обладающим антикоагулянтной активностью. Условной единицей активности (ЕА) является то количество раствора порошка, которое в 2 раза удлиняет время свертывания равного объема рекальцифицированной нормальной плазмы человека. В продукте, полученном из 1 кг нативного сапропеля содержится 8000-10000 ЕА.

Положительный эффект предлолженного способа по сравнению со способом-прототипом заключается: 1. В использовании недорогого и чрезвычайно распространенного сырья, не требующего предварительной обработки, в то время как медуница мягчайшая после сбора подлежит высушиванию в течение продолжительного времени и имеет ограниченное распространение.

2. В отказе от дорогостоящих и токсичных реактивов этанола, хлороформа и этилацетата.

3. В отсутствии посторонних примесей других биологически активных веществ.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Для получения целевого продукта предусмотрена следующая последовательность операций: 1. Один объем нативного сапропеля заливают 3-х кратным объемом 0,05 М водного раствора аммиака и настаивают при постоянном перемешивании в течение 2-3 ч.

2. Настой отстаивают в течение суток при комнатной температуре и собирают надосадок с помощью сифона или осторожно сливая.

3. Порции надосадка объединяют и упаривают на водяной бане или с помощью ротационного испарителя в 80-100 раз (до 30-40 мл при обработке 1 кг сапропеля).

4. Концентрат центрифугируют в течение 15 мин при 3000-4000 g.

5. Надосадок выдерживают при температуре -15^oC в течение 24 ч. Размораживают при комнатной температуре, выпавший осадок отделяют центрифугированием в течение 15 мин при 3000-4000 g.

6. Супернатант диализуют против дистиллированной воды через мембрану Т-100 (пленка гидратцеллюлозная для гемодиализ со средним размером пор 1,74 ангстрема(К. И.Мышкин, В.Н.Леонов, А.Т.Староверов. Сравнительная характеристика некоторых образцов целлофана, применяемых для экстракопорального гемодиализа. -Сов.медицина,1967 N6, с.55-58)- 10 мл надосадка против 2-3 л воды в течение 12 ч.

7. Недиализующуюся часть надосадка выпаривают досуха на ротационном испарителе. Полученный светло-коричневый порошок целевой продукт. В целевом продукте из 1 кг сапропеля содержится 8000-10000 ЕА.

Приведенная ниже таблица характеризует предложенный способ в сравнении со способом-прототипом.

Таким образом, целевой продукт с помощью предложенного способа получен без предварительной обработки недорогого сырья сапропеля существенно отличается по качеству от получаемого из травы медуницы, распространение которой ограничено, а сбор и сушка требуют значительных затрат. В предлолженном способе не используются токсичные и дорогостоящие органические растворители, а выход целевого продукта примерно одинаков в пересчете на 1 кг исходного сырья.

Как и антикоагулянт из травы медуницы, антикоагулянт из сапропеля представлен гликопептидами с небольшой молекулярной массой, после введения которых животным снижается свертывающая активность на 6-12 ч, что позволяет использовать целевой продукт для блокады свертывания крови у экспериментальных животных и как материал для проведения исследований, предшествующих клиническим испытаниям.

Формула изобретения

Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью путем экстракции природного сырья растворителем, упаривания экстракта, очистки целевого продукта и его высушивания, отличающийся тем, что в качестве природного сырья используют сапропель, экстракцию проводят настаиванием в 3-кратном объеме 0,05 М раствора аммиака, упаривают в 80 100 раз от исходного объема, выдерживают в течение суток при температуре -15^oС, а очистку осуществляют центрифугированием в течение 15 мин при 3000 4000 q, диализуют против 200-кратного объема дистиллированной воды через мембрану Т-100 в течение 12 ч и концентрат выпаривают на ротационном испарителе.

РИСУНКИ

Рисунок 1