Способ определения галактозы в сыворотке крови

 

Изобретение относится к биохимии и ветеринарии и касается способа определения гексоз, например галактозы, в сыворотке крови для ранней диагностики нарушений минерального обмена. Сущность способа определения галактозы в сыворотке заключается в использовании для анализа тонкослойной хроматографии путем нанесения водного раствора исследуемой пробы (10 мкл) на стартовую линию пластинки силуфол, двухкратном элюировании в смеси растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (1oC3):(2oC5), соответственно с последующим обнаружением анилинфталатом. Предлагаемый способ позволяет в течение 40-45 мин получить данные о наличии галактозы в сыворотке крови без предварительной ее обработки.

Изобретение относится к биохимии и ветеринарии и касается способа определения гексоз, например галактозы, в сыворотке крови для ранней диагностики нарушений минерального обмена.

В клинической практике наиболее распространено определение углеводсодержащих белков сыворотки крови по одному из входящих в их состав компонентов, например гексозам. Из наиболее применяемых способов для клинико-диагностических лабораторий является определение гексоз (маннозы, галактозы), связанных с белками, фотометрическими методами с использованием триптофана и орцинового реактива, после гидролиза гликопротеидов и гликозаминогликанов сыворотки крови серной кислоты. (В.Г.Колб, В.С.Камышников. Справочник по клинической химии. Минск: Беларусь, 1982, с. 182-188).

Известны хроматографические способы определения (и разделения) гексоз в тонких слоях с применением различных сорбентов и элюирующих систем. На силикагеле в системе растворителей бензол-метанол-уксусная кислота (1:3:1), метилэтилкетон-метанол-уксусная кислота (3:1:1) определен ряд гексоз, в том числе галактоза и манноза (А.А.Ахрем, А.И.Кузнецова. Тонкослойная хроматография. М. Наука, 1964, с. 86).

Известен способ определения гексоз, например глюкозы, в биожидкостях с применением реактива, содержащего в своем составе глюкозооксидазу, пероксидазу, фосфорный буфер и хромоген, включающий раствор амидопирина и солянокислого анилина в этаноле, стабилизированный раствором солянокислого гидроксиламина (патент РФ N 2009499, кл. 5 G 01 N 33/50).

Известно определение гексоз в сыворотке крови по Эрссеру и Эндрю. Сыворотку крови освобождают от белка добавлением пикриновой кислоты (75 мг/л). Окрашенную в желтый цвет жидкость после центрифугирования хроматографируют. Образцы наносят (по 10 мкл) на пластинку и подвергают двухкратному элюированию в системе этилацетат-пиридин-вода (6:3:2) одновременно с этанолами. После высушивания хроматограмму опрыскивают раствором п-аминобензойной кислоты, нагревают при 60-90oC и наблюдают пятна альдез. (М.Шаршунова, В.Шварц, Ч. Михалец. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. Ч. 2. М. Мир, 1980, с. 514).

Недостатком данного способа является то, что методика осложнена предварительной операцией отделения белка от сыворотки крови пикриновой кислотой.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ определения гексоза в сыворотке крови орциновым методом после гидролиза серной кислотой. Гликопротеиды, содержащие гексозы, выделяют из сыворотки крови этанолом с последующим центрифугированием. Белковый осадок растворяют в 0,1н растворе едкого натра, прибавляют орциновый реактив (раствор орцина в серной кислоте), перемешивают, нагревают на водяной бане при 80oC 15 мин, охлаждают и пробы, окрашенные в розовый цвет колориметрируют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (при длине волны 500-560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм. Расчет производят по калибровочному графику. Стандартный раствор гексоз конц. 1 г/л готовят из галактозы и маннозы, взятых в равных весовых количествах. (В.Г.Колб, В.С.Камышников. Справочник по клинической химии. -Минск: Беларусь, 1982, с. 185).

Недостатком данного способа является громоздкость и длительность проведения анализа (не менее 8 ч). Способ предусматривает обязательные операции: отделение белкового осадка этанолом с последующим центрифугированием, выделение гексоз из гликопротеидов путем их гидролиза серной кислотой.

Таким образом, известные способы и приведенный выше не позволяют определять гексозы непосредственно в сыворотке крови без предварительной ее обработки.

Задачей изобретения является проблема совершенствования способа определения гексоз в сыворотке крови, таких, как, например, галактоза без предварительной ее обработки (отделения белкового осадка и гидролиза углеводсодержащих белков).

Эта задача решается способом определения галактозы в сыворотке крови с использованием тонкослойной хроматографии путем нанесения исследуемой пробы на стартовую линию пластинки с силикагелем, двухкратного элюирования в смеси растворителей с последующим обнаружением анилинфталатом, в котором на пластинку, например силуфол, наносят водный раствор сыворотки крови, а в качестве элюента используют смесь растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (1oC3):(2oC5) соответственно.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. К 1 объему сыворотки крови прибавляют 2 объема воды и водный раствор наносят на пластинку силуфол. Пластинку подвергают двухкратному элюированию в смеси растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (1oC3):(2oC5) соответственно и после сушки на воздухе проявляют анилинфталатом при температуре 90-100oC в течение 10 мин.

Пример 1. К 1 объему сыворотки крови прибавляют 2 объема воды, затем на стартовую линию пластинки силуфол наносят 10 мкл водного раствора сыворотки. Одновременно на стартовую линию наносят 10 мкл этанола (раствора галактозы). Пластинку сушат на воздухе и подвергают двухкратному элюированию на расстоянии от старта 10 см в системе растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (1oC3) соответственно. После каждого элюирования пластинку сушат на воздухе. Затем пластинку опрыскивают анилинфталатом, высушивают от проявителя, нагревают при температуре 90-100oC не менее 10 мин и наблюдают проявление темно-бурых пятен галактозы. Определяют Rf: для стандартного образца Rf 0,72; для исследуемой пробы сыворотки крови одно пятно, Rf 0,72.

Пример 2. К 1 объему сыворотки крови прибавляют 2 объема воды, затем на стартовую линию пластинки силуфол наносят 10 мкл водного раствора сыворотки крови. Одновременно на стартовую линию наносят 10 мкл этанола (раствора галактозы). Пластинки сушат на воздухе и подвергают двухкратному элюированию на расстоянии от старта 10 см в системе растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (2oC5) соответственно. После каждого элюирования пластинку сушат на воздухе. Затем пластинку опрыскивают анилинфталатом, высушивают от проявителя, нагревают при температуре 90-100oC не менее 10 мин и наблюдают появление темно-бурых пятен галактозы. Определяют Rf: для стандартного образца Rf 0,72; для исследуемой пробы сыворотки крови одно пятно, Rf 0,72. Для количественного определения галактозы в сыворотке крови исследуемых проб расчет проводят по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика используют стандартные образцы раствора галактозы следующих концентраций (мкг/мл): 5, 10, 15, 20, 25, 30. Калибровочную кривую строят на основании количества взятого вещества (в мкг) и найденного размера площади пятна (в мм2), руководствуясь общеизвестными принципами (А.А.Ахрем, А.И.Кузнецова. Тонкослойная хроматография. М. Наука: 1964, с. 52).

Таким образом, предлагаемый способ определения галактозы в сыворотке крови позволяет в течение 40-45 мин без предварительной ее обработки (отделения белкового осадка и гидролиза углеводсодержащих белков серной кислотой) сразу получить данные о наличии галактозы в малом количестве (10 мкл) исследуемой пробы качественно и количественно.

Предлагаемый способ за счет экспрессности и большой чувствительности (до 0,005 мкг вещества) может быть использован для ранней диагностики нарушений минерального обмена, которые клинически проявляются в форме остеодистрофии.

Формула изобретения

Способ определения галактозы в сыворотке крови, включающий проведение тонкослойной хроматографии сыворотки крови на пластине с силикагелем, двукратное элюирование в смеси растворителей, с последующей обработкой химическим реагентом для проявления сахаров, отличающийся тем, что на пластину для тонкослойной хроматографии наносят смесь сыворотки крови с водой в соотношении 1 2, в качестве элюента используют смесь растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (1 3) (2 5) соответственно, а проявление ведут анилинфталатом.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, в частности - к пульминологии, и может быть использовано при лечении больных с бронхообструктивным синдромом
Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической микробиологии
Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и может найти применение при лечении близорукости
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и патологической анатомии

Изобретение относится к аналитической биохимии, конкретно к клинической биохимии, и может быть использовано в медицине для диагностики заболеваний различной этиологии

Изобретение относится к медицине, а именно к терапевтической стоматологии и может найти применение при диагностике и оценке эффективности лечения воспалительных заболеваний пародонта

Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии, и предназначено для оценки эффективности противовоспалительной терапии, назначаемой конкретному больному ревматоидным артритом
Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии

Изобретение относится к медицине и касается видов патологии или состояний организма, связанных с нарушениями азотистого обмена, особенно при различных видах почечной патологии, обширных хирургических ранах, ожогах

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии, терапии

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии и может быть использовано для диагностики и прогнозирования состояния больного в послеоперационном периоде и при развитии острого воспалительного процесса
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано при проведении больным с неблагоприятным прогнозом адъювантных методов терапии

Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, и может быть использовано для проведения дифференицальной диагностики инсулинзависимого и инсулиннезависимого диабета, состояния их компенсации

Изобретение относится к медицине, а именно гепатологии, и предназначено для прогнозирования цирроза печени у больных с хроническими диффузными поражениями органа

Изобретение относится к области исследования или анализа материалов особыми способами, а именно к способам исследования крови при действии ксенобиотиков, и может быть использовано для оценки микросомальной системы печени после воздействия малых доз иприта и люизита при реальных путях поступления ОВ (отравляющих веществ) в организм, а также при решении задач по уничтожению ХО (химического оружия) в районах военно-химических объектов, в частности по обследованию здоровья населения и обслуживающего персонала в местах по хранению и уничтожению ХО

Изобретение относится к оптико-электронной промышленности и может быть использовано для комплексного исследования параметров взвеси частиц микронных и субмикронных размеров (10-8 - 10-4 м): распределения частиц по группам с определенными размерами, химического состава частиц, скоростей изменения этих характеристик

Изобретение относится к медицине, в частности, к кардиологии, и может быть использовано для лечения любых клинических вариантов ишемической болезни сердца
Наверх