Способ определения ферментативной активности биокатализатора

 

Использование: энзимология и может найти применение в физико-химической биологии, биотехнологии и медицине для определения ферментативной активности биокатализаторов, а именно, микроорганизмов, ферментов и т.д. Сущность изобретения: способ определения ферментативной активности биокатализатора включает приготовление эталонного и исследуемого образцов, проведение ферментативной реакции с последним, определение оптической плотности образцов после реакции, оценку ферментативной активности биокатализатора по изменению величины оптической плотности, после проведения ферментативной реакции с последующей регистрацией величин оптических плотностей обоих образцов обеспечивают воздействие на них электрическим полем и во время данного воздействия повторно регистрируют величины оптических плотностей образцов, определяют отношение величин оптических плотностей соответствующих образцов до и во время воздействия электрическим полем и по сравнению их судят о наличии ферментативной активности биокатализатора. 6 ил.

Изобретение относится к энзимологии и может найти применение в физико-химической биологии, биотехнологии и медицине для определения ферментативной активности биокатализаторов, а именно, микроорганизмов, ферментов и т.д.

Известны различные физико-химические способы определения ферментативной активности: цитометрия, флуоресценция, спектрофотометрия и т.п.

Известен, например, способ определения ферментативной активности, предусматривающий иммобилизацию ферментного субстрата на одном конце оптического волокна, приведение ферментного субстрата в контакт с пробой для инициации ферментативной реакции и образования иммобилизованного продукта реакции, имеющего иные спектральные свойства, чем свойства ферментного субстрата. Ферментативную активность определяют на основе изменений спектральных свойств субстрата (Патент США N 238809A, кл. C 12 Q 1/00, C 12 M 1/00, 1/34, опубл. 24.08.93).

Недостатком данного способа является необходимость предварительной иммобилизации новой порции субстрата на поверхности оптического волокна перед каждым измерением.

Известен также способ акустического определения активности ферментов путем инкубации фермента с раствором специфического субстрата и регистрации изменения скорости распространения акустических колебаний в реакционной смеси при ферментативной реакции, которую проводят непосредственно в акустической камере. В качестве акустической камеры используют акустический резонатор, а для определения скорости распространения акустических колебаний в камере с исследуемой средой создают стоячую волну и регистрируют изменения собственной частоты резонатора (Патент Российской Федерации N 2007460 кл. C 12 Q 1/00, заявл. 18.04.91 и опубл. 15.02.94).

Однако данный способ не предназначен для определения ферментативной активности микробных клеток.

Известен также способ определения активности популяций микроорганизмов, окисляющих углеводы, путем инкубирования нефлуоресцирующего органического соединения с микроорганизмами и измерения возникающих в результате этого флуорохромированных клеток при помощи сканирующего флуоресцентного микроскопа или проточного цитометра и оценки полученной гистограммы (Патент ГДР N 268000 кл. C 12 Q 1/02 публ. 17.05.89.).

Данный способ предназначен только для определения активности микробных клеток, окисляющих углеводы.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения ферментов, обладающих амидазной активностью (Патент СССР N 1353809 A 1 кл. C 12 Q 1/00 заявл. 10.02.86 и опубл. 23.11.87.). Способ заключается в приготовлении исследуемого и эталонного образцов, проведении ферментативной реакции гидролиза аминоациламинонафталинсульфамидов, после чего добавляют раствор проявителя, содержащий диазоль и кислоту, останавливающую действие фермента. Полученный раствор красителя помещают в кювету спектрофотометра и определяют оптическую плотность в максимуме поглощения красителя. По величине оптической плотности рассчитывают количество продукта реакции и далее активность фермента, сравнивая ее с эталонным образцом.

Однако данный способ не применим для определения ферментативной активности по отношению к другим субстратам.

Целью предлагаемого изобретения является разработка способа определения ферментативной активности различных биокатализаторов и расширение диапазона используемых субстратов.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения ферментативной активности биокатализаторов, включающем приготовление эталонного и исследуемого образцов, проведение ферментативной реакции с последним, определение оптической плотности образцов, оценку ферментативной активности биокатализатора по изменению величины оптической плотности, после проведения ферментативной реакции с последующей регистрацией величин оптических плотностей обоих образцов обеспечивают воздействие на них электрическим полем и во время данного воздействия повторно регистрируют величины оптических плотностей образцов, определяют отношение величин оптических плотностей соответствующих образцов до и во время воздействия электрическим полем и по сравнению их судят о наличии ферментативной активности биокатализатора.

В известной авторам научно-технической литературе не обнаружены способы с подобной совокупностью признаков. Полученный результат, обусловленный совокупностью этих признаков, не достигался в известных решениях. Преимуществами способа являются высокая скорость анализа и возможность проведения исследований, не повреждая и не разрушая клетки.

Способ заключается в следующем: Предварительно получают биомассу клеток по принятой для данного штамма технологии. Далее биомассу отделяют от среды центрифугированием, отмывают и подготавливают для анализа.

Готовят эталонный образец, состоящий из суспензии известного количества биокатализатора, и исследуемый образец, состоящий из суспензии такого же количества биокатализатора с добавлением определяемого субстрата.

Образцы инкубируют при температуре, оптимальной для проявления ферментативной активности, в течение фиксированного интервала времени.

После окончания ферментативной реакции регистрируют величины оптических плотностей образцов. Затем обеспечивают воздействие электрическим полем на эталонный и исследуемый образцы и регистрируют величины оптических плотностей образцов при следующих частотах электрического поля: 10, 52, 104, 502, 1000, 5020 и 10000 кГц и определяют отношение величин оптических плотностей соответствующих образцов до и во время воздействия электрическим полем и по сравнению их судят о наличии ферментативной активности биокатализатора.

Пример 1. Определение амидазной активности клеток штамма Brevibacterium sp. по отношению к акриламиду.

Готовят следующие растворы.

Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.

Раствор 2. 1 г/л акриламида в деионизированной воде.

Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 200 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35^oC в течение 20 мин. Далее эталонный образец вводят в измерительную ячейку и определяют величину оптической плотности, затем обеспечивают воздействие электрическим полем и определяют величины оптических плотностей во время данного воздействия на следующих частотах электрического поля - 10, 52, 104, 502, 1000, 5020 и 10000 кГц, используя электрический анализатор ELBIC. Определяют отношение величин оптических плотностей до и во время воздействия электрическим полем для каждой частоты электрического поля. Аналогично поступают с исследуемым образцом. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов (фиг. 1).

Пример 2. Определение амидазной активности клеток штамма Brevibacterium sp. по отношению к ацетамиду.

Готовят следующие растворы.

Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.

Раствор 2. 1 г/л ацетамида в деионизированной воде.

Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 200 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35^oC в течение 15 мин. Определяют отношение величин оптических плотностей как показано в примере 1. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов. Полученные данные представлены на фиг. 2.

Пример 3. Определение амидазной активности клеток штамма. Brevibacterium sp. по отношению к пропионамиду.

Готовят следующие растворы.

Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.

Раствор 2. 1 г/л пропионамида в деионизированной воде.

Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 200 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35^oC в течение 30 мин. Определяют отношение величин оптических плотностей как показано в примере 1. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов. Полученные данные представлены на фиг. 3.

Пример 4. Определение амидазной активности клеток штамма Brevibacterium sp. по отношению к бутирамиду.

Готовят следующие растворы.

Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.

Раствор 2. 1 г/л бутирамида в деионизированной воде.

Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 200 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35^oC в течение 40 мин. Определяют отношение величин оптических плотностей как показано в примере 1. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов. Полученные данные представлены на фиг. 4.

Пример 5. Определение ферментативной активности клеток штамма Pseudomonas sp. C-11. по отношению к p-нитрофенолу.

Готовят следующие растворы.

Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.

Раствор 2. 1 г/л р-нитрофенола в деионизированной воде.

Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 100 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35^oC в течение 40 мин. Определяют отношение величин оптических плотностей как показано в примере 1. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов. Полученные данные представлены на фиг. 5.

Пример 6. Определение ферментативной активности клеток штамма Pseudomonas sp. БА-11 по отношению к p-нитрофенолу.

Готовят следующие растворы.

Раствор 1. Клетки ресуспендируют в деионизированной воде с электропроводностью не больше 200 мкSm/sm. Оптическая плотность суспензии при 670 нм составляет 0,4 - 0,5 отн.ед.

Раствор 2. 1 г/л p-нитрофенола в деионизированной воде. Готовят эталонный образец, состоящий из 2 мл раствора 1, и исследуемый образец, состоящий из 2 мл раствора 1 и 100 мкл раствора 2. Образцы инкубируют при температуре 35^oC в течение 60 мин. Далее эталонный образец вводят в измерительную ячейку и определяют величину оптической плотности, затем обеспечивают воздействие электрическим полем и определяют величины оптических плотностей во время данного воздействия на следующих частотах электрического поля - 10, 52, 104, 502, 1000, 5020 и 10000 кГц, используя электрооптический анализатор ELBIC. Определяют отношение величин оптических плотностей до и во время воздействия электрическим полем для каждой частоты электрического поля. Аналогично поступают с исследуемым образцом. Ферментативную активность микробного биокатализатора определяют по сравнению полученных значений для эталонного и исследуемого образцов (фиг. 6).

Формула изобретения

Способ определения ферментативной активности биокатализатора, включающий приготовление эталонного и исследуемого образцов, проведение ферментативной реакции с последним, определение оптической плотности образцов, оценку ферментативной активности биокатализатора по изменению величины оптической плотности, отличающийся тем, что после проведения ферментативной реакции с последующей регистрацией величин оптических плотностей обоих образцов обеспечивают воздействие на них электрическим полем и во время данного воздействия повторно регистрируют величины оптических плотностей образцов, определяют отношение величин оптических плотностей соответствующих образцов до и во время воздействия электрическим полем и по сравнению их судят о наличии ферментативной активности биокатализатора.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6