Пептид и способ его получения

 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ, обладающих иммуннорегулирующими свойствами, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии. В основу изобретения положена задача создания нового синтетического биологически активного пептида, обладающего иммунорегулирующим свойством, формулы: Х - G1u-Тrp - Y где Х - Н или Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ - аминомаслянная кислота ζ - аминокапроновая кислота; Y - Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, p-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ - аминомаслянная кислота, ζ - аминокапроновая кислота, ОН, моно- или дизамещенный амид (C₁ - C₃). Синтез пептида производится в растворе путем последовательного наращивания цепи с С-конца молекул, используя стратегию максимального блокирования функциональных групп, исходя из алкилового эфира аминокислоты с помощью метода активированных эфиров и метода смешанных ангидридов, используя третбутилоксикарбониламинокислоты. 2 с.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ, обладающих иммуннорегулирующими свойствами, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии.

В практической медицине широко известны в качестве регуляторов иммунных процессов тимусные экстракты, в частности тимозин фракция 5 (Coldstein A.L., Guna A., Latz M.M., Hardy H.A., White A.) тималин (CH, N 659586). Эти экстракты состоят из комплекса веществ полипептидной природы и получение их из природных источников ограничено сложностью производства, малым выходом активных веществ и значительной вариабельностью их физико-химических характеристик и биологических свойств. Кроме того, из-за присутствия в природных препаратах тимуса балластных компонентов при их использовании у больных иногда возникают побочные явления. Последнее обстоятельство явилось стимулом для создания синтетических пептидов, обладающих иммунорегуляторными свойствами: SU N 1582393, EP N 230052, US N 5008246, US N 5013723. Каждый из полученных синтетических пептидов с ограниченным комплексом необходимых свойств обладает высокой активностью, низкой токсичностью, отсутствием побочных эффектов, которые определяют их возможное применение в медицине.

В основу изобретения положена задача создания нового синтетического биологически активного пептида, обладающего иммунорегулирующим свойством, формулы: X-Glu-Тrp-Y, где H или Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ - аминомасляная кислота, ζ - аминокапроновая кислота; Y - Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-VaL, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ - аминомасляная кислота, ζ - аминокапроновая кислота, - OH, моно- или дизамещенный амид (C₁ -C₃)/ Целью изобретения было также создание принципиально нового технологического процесса получения вещества пептидной природы, который позволил бы при минимальном количестве и простоте стадий получать с высоким выходом продукт вышеприведенной формулы.

Сущность нового способа состоит в синтезе пептида в растворе путем последовательного наращивания цепи с C-конца молекул, используя стратегию максимального блокирования функциональных групп, исходя из алкилового эфира аминокислоты с помощью метода активирования эфиров и метода смешанных ангидридов, используя третбутоксикарбониламинокислоты.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Пример.

H-Ile-Glu-Trp-OH 1. Получение Boc-Ile-OPFP.

Смесь 46,0 г (0,2 моль) Boc-Ile-ОН и 40,5 г (0,22 моль) пентафторфенола в 100 мл этилацетата охлаждали до -5^oC и добавляли 45,3 г (0,22 моль) N,N-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивали 3 ч при комнатной температуре, дициклогексилмочевину отфильтровывали, растворители упаривали в вакууме, остаток кристаллизовали в смеси этилацетат-гексан. Выпавший осадок отфильтровывали. Выход: 71,3 г (90%).

2. Получение Boc-Ile-Glu-Trp-OH.

19,8 г (0,05 моль) Boc-Ile-OPFP растворяли в 100 мл диметилформамида и при перемешивании добавляли раствор 20 г (0,06 моль) Glu-Trp и 5,0 г (0,06 моль) NaHCO₃ в воде. Раствор перемешивали в течение 20 ч при комнатной температуре, затем упаривали растворители в вакууме. К остатку добавляли 200 мл этилацетата и 200 мл 2%-ного раствора серной кислоты, перемешивали. Органический слой промывали раствором серной кислоты (2·100 мл), насыщенным раствором NaCl до pH 7, сушили над безводным сульфатом натрия, растворитель отгоняли в вакууме. Остаток кристаллизовали в системе этилацетат-гексан, осадок отфильтровывали и сушили в вакууме. Выход 20,5 г (75%).

3. Получение H-Ile-Glu-Trp-OH.

20,5 г Boc-Ile-Glu-Trp-OH растворяли в 150 мл муравьиной кислоты, перемешивали 3, 5 ч при t 45^oC и растворитель упаривали в вакууме. К остатку добавляли 200 мл воды и упаривали в вакууме еще раз. Остаток заливали смесью 300 мл изопропанола, 200 мл эфира и выдерживали 10 ч. Осадок фильтровали и сушили в вакууме. Выход: 15,3 г (75%).

Очистку пептида проводили с помощью обращенно-фазной хроматографии в системе ацетонитрил- 0,1%-ным раствором трифторуксусной кислоты. Выход 13 г (85%).

В результате изучения физико-химических свойств пептида были получены следующие его характеристики:
Первичная структура - H-Ile-Glu-Trp-OH
Брутто формула - C₂₄H₃₀N₄O₄
Молекулярный вес - 446,5 Da
Внешний вид - белый с желтоватым оттенком или серый порошок.

Растворимость - растворим в воде, практически нерастворим в хлороформе.

УФ-спектр в области 250 - 300 мм несет максимум 280⁺ 2 мм, плечо 287⁺ 2 мм.

Для ряда соединений нового пептида в табл. 1 приведены значения R_f1 в системе (хлороформ-метанол - 32% уксусная кислота = 60:45:20) и R_f2 в системе (бутанол-пиридин-вода-уксусная кислота = 5:5:4:1).

Биологическая активность нового пептида изучалась на морских свинках с помощью общепринятого теста E-розеткообразования. В табл. 2 приведены сравнительные данные воздействия препаратов тимуса и заявленного пептида на процесс E-розеткообразования лимфоцитов морских свинок после обработки их трипсином.

Установлено, что в in vitro заявляемый пептид активнее известных препаратов в 10³ раза.

С целью изучения безопасности пептида проводили изучение его острой токсичности. Изучение острой токсичности проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического комитета РФ "Требования к доклиническому изучению общетоксичного действия новых фармакологических веществ", М., 1985.

Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении 1000-кратной дозы пептид не оказывал острого токсичного действия и при этих дозах оказалось невозможным достигнуть их ЛД50.

Таким образом, новый пептид, не являясь токсичным, обладает ярко выраженными иммунорегулирующими свойствами.

Формула изобретения

1. Пептид формулы
X - Glu - Trp - Y,
где X - H или Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tуr, Phe, Trр, D - Ala, D - Leu, D - Ile, D - Val, D - NVal, D - Pro, D - Tуr, D - Phe, D - Trр, γ -аминомасляная кислота, ζ -аминокапроновая кислота;
Y - Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tуr, Phe, Trр, D - Ala, D - Leu, D - Ile, D - Val, D - NVal, D - Pro, D - Tуr, D - Phe, D - Trр, γ -аминомасляная кислота, ζ -аминокапроновая кислота, -OH, моно- или дизамещенный С₁ - С₃-амид.

2. Способ получения пептида формулы
X - Glu - Trр - Y,
где X - H или Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVl, Pro, Tyr, Phe, Trр, D - Ala, D - Leu, D - Ile, D - Val, D - NVal, D - Pro, D - Tуr, D - Phe, D - Trр, γ -аминомаслянная кислота, ζ -аминокапроновая кислота;
Y - Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tуr, Phe, Trр, D - Ala, D - Leu, D - Ile, D - Val, D - NVal, D - Pro, D - Tуr, D - Phe, D - Trр, γ -аминомасляная кислота, ζ -аминокапроновая кислота, -OH, моно- или дизамещенный С₁ - С₃-амид,
отличающийся тем, что вводят во взаимодействие в растворе алкиловый эфир аминокислоты с третбутилоксикарбонил аминокислотой, затем последовательно наращивают пептидную цепь методом активированных эфиров и методом смешанных ангидридов, последовательно присоединяют третбутилоксикарбонил аминокислоты с предварительным отщеплением на каждой стадии третбутилокси карбонильной группы путем обработки реакционной смеси муравьиной кислотой и с последующей очисткой промежуточных продуктов кристаллизацией, получают продукт формулы X - Glu - Trр - Y, который очищают обращенно-фазной хроматографией.

РИСУНКИ

Рисунок 1