Способ скринингового обследования женщин детородного возраста с помощью тест-системы eli-p для прогноза развития эмбриона/плода и рождения здорового либо аномального ребенка

 

Способ может быть использован в области медицины, биотехнологии, иммунологии, акушерства и гинекологии. У женщин детородного возраста с ранними сроками беременности или до беременности осуществляют забор крови, из которой получают сыворотку, затем получают тест-систему ЕLI-Р (очищенные тест-антигены) и проводят иммуноферментный анализ (твердофазный), определяют иммунореактивность сывороточных аутоантител организма женщины, оказывающих существенное влияние на нормальный эмбрио/фетогенез и направленных к антигенам, участвующим в процессах развития органов и тканей плода, например к основному белку миелина, белку S100, анионному прочносвязанному белку хроматина АБХ 14- 18, мембранному белку МР65 и при получении данных об отклонении иммунореактивности тестируемых сывороток от уровня нормальных значений к любому из них, по степени выраженности отклонений определяют уровень риска нарушений развития плода. Способ пригоден для массовых диспансерных обследований. 9 табл.

Область техники: медицина, акушерство и гинекология, иммунология, биотехнология.

Накапливается все больше указаний на то, что иммунная система посредством органоспецифических иммунных реакций (гуморального и клеточного типа), принимает непосредственное участие в процессах органогенеза на этапах раннего эмбрионального развития (Абрамов В.В., Взаимодействие нервной и иммунной систем. Новосибирск: Наука, 1988). Соответственно, можно ожидать, что вызванные разными внешними или внутренними причинами сбои в механизмах иммунорегуляции, происходящие во время беременности или незадолго до беременности, могут сопровождаться нарушениями формирования отдельных органов и тканей и эмбриона в целом. В результате подобных сбоев можно ожидать рождения новорожденного, имеющего те или иные врожденные аномалии.

Отличительной особенностью иммунной системы является способность иммунокомпетентных клеток синтезировать и секретировать в общий кровоток антитела к чужеродным антителам (например, вирусным, бактериальным). Кроме того, иммунная система каждого организма продуцирует "естественные" регуляторные антитела (аутоантитела) к любым антигенным компонентам собственного организма. Синтез последних в здоровом организме поддерживается в определенных границах, необходимых для выполнения "естественными" антителами определенных регуляторных функций, а их гиперпродукция (равно как и гипопродукция) могут вести к развитию тех или иных патологических состояний (A.B. Poletaev, Autoantibodies as an universal modulators of biological functions. In: Bio-medicine 2000 - Proc. 1th Int. Workshop, Moscow, 1993, 42-48). Сказанное в полной мере относится и к развитию эмбрионов и плодов. Например, если у матерей незадолго до беременности или во время беременности отмечалось повышенные титры "естественных" антител к белку нервных клеток S100, то у их потомства отмечаются разного рода нарушений развития нервной системы (A.B. Poletaev, O. P. Selifanova, Transfer of elevated anti-S100 autoimmunity from mother to their offsprings in rats. Life Sci., 1994, v.54, N 18, 1377-1381).

Чисто генетические дефекты развития (т.е. в равной степени зависящие от матери и отца) являются причиной не более чем 2-3% врожденных аномалий развития. Остальные 97-98% врожденной патологии не зависит от состояния отца и определяются разного рода эпигенетическими причинами, неблагоприятно влияющими на состояние системы мать-плод. В качестве этиологических факторов здесь могут выступать и инфекционные заболевания женщины, и сильные стрессы, и вредные химические и физические воздействия типа ионизирующей радиации и множества др. причин. Важно отметить, что иммунная система в целом организма наиболее рано реагирует на отмеченные потенциально вредящие воздействия. Не исключено, что повышенная частота рождения детей в разного рода врожденными уродствами в регионах, относящихся к экологически неблагоприятным зонам, в значительной мере обуславливается индуцированными средой нарушениями со стороны иммунорегуляторных механизмов у их матерей, так как именно женщина является связующим и опосредующим звеном между плодом и средой, а любые внешние воздействия, в первую очередь отражаются на ее организме. В том числе, и на количествах продуцируемых женщиной молекул регуляторных антител, важных для дифференцировки и морфогенеза органов и тканей развивающегося эмбриона и плода.

В качестве дополнительных фактических обоснований изобретения могут выступать публикации, в которых приводятся данные о доступности внутренних органов формирующего эмбриона и плода для материнских антител (Fabian R.H., Welch A. L., Chen Y.C., Hulsebosch C.E. Maternal antibodies access the neonatal CNS. In: Soc.Neurosci. Abstr., 1993, v. 19, pt.2, p.1463); о необходимости ряда блокирующих антител в сыворотке матери для успешного развития плода (Takeuchi S. Is production of blocking antibodies in successful human pregnancy an epiphenomenon? Amer. J.Reprod.Immunol., 1990, v.24, N 4, p. 108-119); о задержках роста и развития плода под влиянием материнских цитотоксических антител (Hasegawa I., Takakuwa K., Adachi S., Kahazawa k. Cytotoxic antibody against trophoblast and Lymphocytes present in pregnancy with intrauterine fetal growth retardation and its relation to anti-phospholipid antibody. J.Reprod. Immunol., 1990, v.17, N2, p.127-139).

Вышесказанное явилось основанием для разработки тест-системы ELI-P (от ELISA-detected Probability of Pathology), пригодной для прогностической оценки уровней ряда "естественных" регуляторных аутоантител организма женщины, важных для нормального эмбрио/фетогенеза, направленных к антителам, непосредственно участвующим в процессах развития органов и тканей плода.

Прямых аналогов изобретения не выявлено. В качестве отдаленного (косвенного) аналога можно рассматривать способ диагностики нарушений развития плода, выполняемый на основе иммуноферментного определения альфа-фетопротеина (АФП) в околоплодных водах. Среди лабораторных методов диагностики возможных нарушений развития плода, основанных на детекции гуморальных (молекулярных) изменений, большое распространение получили тест-системы, применяемые для определения содержания иммунорегуляторного белка АФП в околоплодных водах беременной женщины (Pecchio F., Rapellino M., Torre G.C., eds. , International workshop on AFP: new trends and perspectives., J.Nucl. Med. Allied Sci., 1989, 33, suppl. 1-137). Установлено, что дефекты развития нервной трубки плода как правило сопровождаются незначительным повышением содержания АФП в околоплодных водах. Это позволяет использовать данный способ в качестве диагностического теста в акушерстве.

В то же время, рассмотренный способ обладает рядом существенных недостатков: во-первых, метод определения уровня АФП требует получения пробы околоплодной жидкости, что является достаточно сложной инвазивной процедурой, потенциально опасной для развивающегося плода; во-вторых, метод применим лишь начиная с этапов появления достаточно развитой нервной трубке плода, т.е. достаточно поздно (с 15-18 недель беременности); в третьих, имеется множество причин, обусловленных изменениями в организме женщин, приводящих к резкому повышению содержания АФП (в первую очередь разные заболевания печени - Taketa K., alfa-Fetoprotein: reevaluation in hepatholigy. Hepathology, 1990, 12, 6, 1420-1432), не связанных с нарушениями развития нервной трубки плода: это может вести к ошибочной гипердиагностике патологии развития.

Кроме того, способ, основанный на детекции содержания АФП, не позволяет диагностировать иные (не связанные с нарушениями развития нервной трубки) формы патологии.

В отличие от рассмотренного выше способа выявлений нарушения развития плода, который может рассматриваться в качестве отдаленного аналога или прототипа изобретения, предлагаемый способ позволяет: использовать для диагностики 0,01 мл крови женщины (из подушечки пальца), вместо пробы околоплодных вод; обследовать женщин как на начальных этапах беременности (уже в первые недели), так и до беременности; пригоден для прогноза риска возникновения разных форм патологии будущего ребенка, в том числе и не связанных с нарушениями формирования нервной трубки.

Целью заявляемого способа является повышение надежности прогноза нормального или аномального развития эмбриона и плода на основе оценки содержания в сыворотке крови (у беременных женщин или женщин, обследуемой до беременности) регуляторных аутоантител, направленных к компонентам тест-системы ELI-P (белки, участвующие в механизмах раннего развития), содержание которых является критическим для нормального развития эмбриона и плода.

Поставленные цели достигаются путем реализации существенных признаков предлагаемого способа, а именно в результате сорбции на стандартные 96-луночные планшеты для ИФА а) белка ОБМ (АГ1), б) белка S100 (АГ2), в) анионных белков хроматина АБХ 14-18 (АГ3), г) мембранного белка МБ 65, нанесения на них тестируемых проб сывороток и эталонной референс-сыворотки, полученной от здоровых лиц, выявлении образующихся антиген-антительных комплексов с помощью конъюгатов вторичных (антивидовых) иммуноглобулинов, меченных пероксидазой хрена, проявлении реакции в лунках планшета о-фенилендиамином/H₂O₂ и сравнения уровня интенсивности реакции в лунках, содержащих тестируемые сыворотки с лунками, содержащими референс-сыворотку. Для проведения анализа ELI-P требуется получение 0,01-0,02 мл сыворотки крови женщины (например, из подушечки пальца).

Антигены, используемые в тест-системе ELI-P 1. Получение основного белка миелина (антиген 1). Для получения данного компонента тест-системы могут использоваться разные методы (например, описанный Deibler et al. - J.Neurochem., 1986, 47, 4, 1219-1225) либо готовые коммерчески доступные препараты основного белка миелина (например, продукт фирмы CALBIOCHEM).

2. Способ получения белка S100 (антител 2). Для получения данного компонента тест-системы могут использоваться разные методы (например, описанный А. Б.Полетаевым (Док. дисс., Москва, 1988), либо применяли коммерческий препарат белка S100 (например, фирмы CALBIOCHEM).

3. Полученные прочносвязанных анионных белков хроматина (АБХ 14-18; антиген 3) 3.1 Из свежего мозга крупного рогатого скота выделяли фракцию клеточных ядер (например, мозг гомогенизируют в 0,15 M NaCl с 0,01 М трис-HCl pH 7,5; центрифугируют 5 мин при 1000 g; полученный осадок ресуспендируют в 0,32 M сахарозе; повторно центрифугируют 5 мин при 1000 g; процедуры ресуспендирования в растворе сахарозы/центрифугирования повторяют 5-7 раз).

3.2. Полученные ядра гомогенизировали в 0,2 M NaCl, центрифугировали и отбрасывали экстракт, содержащий белки нуклеоплазмы и слабосвязанные белки хроматина. Отмытый осадок гомогенизировали в 0,01 M трис-HCl буфера pH 8, с 2M NaCl, 2M мочевины и 0,1% тритона X-100. Центрифугировали, собирали супернатант, диализовали его против того же буфера без NaCl и наносили его на колонку DEAE-сефарозы, уравновешенную тем же буфером. Проводили ступенчатую элюцию белков, используя градиенты NaCl на том же буфере. Проводили ступенчатую элюцию белков, используя градиенты NaCl на том же буфере. Отбирали фракцию, элюируемую в диапазоне 0,3-0,7 M NaCl. После диализа против того же буфера без NaCl белки наносили на колонку анионообменника и проводили элюцию в линейном градиенте 0,1 М - 1,0 M KSCN с УФ-детекцией на 280 нм. Собирали последний пик.

3.3. По данным электрофореза в градиентном (8-20%) полиакриламидном геле с SDS-Na, полученный материал давал три дискретные интенсивно окрашиваемые зоны зоны, характеризующиеся мол.массой 14, 16 и 18 кД. Полученный материал использовался в работе.

4. Получение мембраносвязанного белка (МБ 65; антиген 4) 4.1. Из свежего мозга крупного рогатого скота выделяют фракцию клеточных мембран (например, мозг гомогенизируют в 0,15 M NaCl с 0,01 M трис-HCl pH 7,5; центрифугируют 5 мин при 1000 g; полученный осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют сахарозу до 0,32 M; повторно центрифугируют 10 мин при 3000 g; осадок отбрасывают; к супернатанту добавляют равный объем 0,32 M сахарозы. Процедуру повторяют 2-3 раза. Затем супернатант разбавляют 2-кратно водой и центрифугируют 60 мин при 20000 g. Собирают осадок клеточных мембран.

4.2. Полученные мембраны гомогенизировали в 0,01 M трис-HCl буфера pH 7, с 0,2 M NaCl. Центрифугировали, собирали осадок, отмывали его 0,01 M трис-HCl буфера pH 7,5. Гомогенизировали осадок в 0,01 M трис-HCl буфере, pH 7,5 с 0,1% тритона X-100 2M мочевиной. Центрифугировали 60 мин при 20000 g. Супернатант наносили его на колонку анионообменника, уравновешенную тем же буфером. Проводили ступенчатую элюцию белков, используя градиенты NaCl на том же буфере. Отбирали фракцию, элюируемую в диапазоне 0,1-0,3 M NaCl. После диализа против 0,01% тритона X-100 c 1 M мочевиной на трис-HCl буфере pH 7,5, белки наносили на колонку Mono-Q и проводили элюцию в линейном градиенте 0,01 M - 0,4M KSCN c 0,01% тритона X-100 c с УФ-детекцией на 280 нм. Собирали последний пик.

3.3 По данным электрофореза в градиентном (8-20%) полиакриламидном геле с SDS-Na, полученный материал давал одну основную зону (> 80% белка), характеризующуюся мол. массой 65 кД. Полученный материал использовался в работе.

Методика проведения непрямого ИФА 1. Для сорбции на стандартные 96-луночные плоскодонные полистироловые планшеты для иммуноферментного анализа готовят растворы каждого из белков-антигенов на карбонатном буфере. Приготовленные растворы вносятся в отдельные лунки планшета. Накрытые крышками планшеты инкубируют ночь в холодильнике при +2-4^oC.

2. Удаляют (стряхнуть) из лунок растворы белков и (без дополнительной отмывки) заливают в них блокирующий буфера (например, 0,5% раствор желатина на 0,15 M NaCl. Инкубируют 1 ч при 37^oC.

3. Отмывают планшеты отмывочным буфером (0,15 M NaCl/0,05% твин-20).

4. Внесение тестируемых сывороток:
а) В отдельных флаконах или ванночках для ИФА приготовить разведения сывороток 1:200.

б) внести разведенные сыворотки в лунки.

в) накрытые крышки планшеты инкубируют ночь при +4^oC.

В своей работе мы применяли следующую схему заливки антигенов и тестируемых сывороток в лунки планшеты (ст. табл.1).

5. Отмывают планшеты отмывочным буфером.

6. Проявление реакции:
а) исходный раствор конъюгата пероксидазы хрена (или иного фермента) с антителами к иммуноглобулинам IgG человека разводят в необходимое число раз (в зависимости от его реактивности) отмывочным буфером;
б) раствор конъюгата вносят во все лунки планшета;
в) накрытые крышками планшеты инкубируют 60-90 мин при 37^oC, либо 12-16 час при +2-4^oC. Конъюгат удаляют, а планшеты отмывают отмывочным буфером;
г) сразу после этого в лунки вносят раствор субстрата (0,01-0,05% о-фенилендиамина в 0,001-0,001% перекиси водорода на 0,01-0,05 М цитрат-фосфатном буфере в случае применения пероксидазных конъюгатов). Инкубируют планшеты в темноте 15-20 мин при комнатной температуре.

9. По достижении оптимального уровня окрашивания (через 10-20 мин инкубации в темноте) реакцию останавливают добавлением в каждую лунку 0,2-0,4 М серной кислоты.

10. Регистрация результатов реакции: интенсивность окрашивания оценивают с помощью ИФА-ридера любой модели.

11. Обработка полученных данных:
а) из нескольких (обычно трех) дублирующих друг друга значений результатов реакции эталонной и тестируемых сывороток выбирают среднее (в случае, если из 3 дублей один сильно отличается от двух других, т.е. является заведомо артефактом, его значение не принимают в расчет);
б) по полученным значениям оптической плотности содержимого лунок рассчитывают относительную интенсивность реакции тестировавшихся сывороток с белками (1), (2), (3) и (4) по отношению к эталону (в процентах).

12. Интерпретация полученных данных:
В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из четырех белков-антигенов не выходит за пределы от -15% до +40% по отношению к реакции референс-сыворотки (эталона), данную сыворотку относят к классификационной группе K1 (норма).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из четырех белков-антигенов выходит за пределы группы K1, но составляет не менее -40% и не более +65% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку к классификационной группе K2 (слабые отклонения).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из четырех белков-антигенов выходит за пределы групп K1 и K2, но составляет не менее -60% и не более +100% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят к классификационной группе K3 (умеренные отклонения).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из четырех белков-антигенов выходит за пределы групп K1, K2 и K3, но составляет не менее -70% и не более +150% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят к классификационной группе K4 (значительные отклонения).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из четырех белков-антигенов выходит за пределы группы K4 по отрицательным значениям ниже -70%, а по положительным значениям находится в диапазоне от +150% до +200% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят к классификационной группе K5 (резкие отклонения).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из четырех белков-антигенов выходит за пределы групп K1, K2, K3, K4 и K5, данную сывворотку относят к классификационной группе K6 (очень резкие, эксквизитные отклонения).

Эмпирические данные, полученные при анализе результатов родов женщин, предварительно обследовавшихся с применением метода ELI-P, позволили выявить закономерности, представленные в табл. 2.

Таким образом, вероятность благоприятного исхода беременности прямо зависит от уровня определяемых регуляторных антител в сыворотке крови женщин, а частота рождений аномальных новорожденных прямо коррелирует с уровнем их отклонений. Так, если соответствующие параметры не выходили за пределы от -15% до +40% от эталона (группа k1), вероятность рождения клинически здорового ребенка составляла более 90%, а случаев больших аномалий или мертворождений не отмечалось. Напротив, чем более выражены были отклонения, тем выше был риск возникновения врожденных аномалий и случаев мертворождений, вплоть до группы k6, в которой мы не наблюдали ни одного случая рождения здоровых детей. В промежуточных группах (K2-K5) риск серьезной патологии/мертворождений прогрессивно нарастал (от 15% у женщин группы K2 до 75% в группе K6).

Положительный эффект от реализации изобретения сводится к получению тест-системы (диагностикума) ELI-P, с помощью которого можно выявить женщин, сыворотки которых содержат аномальные уровни регуляторных аутоантител, что является универсальным признаком наличия (или начала развития) разных форм нарушения развития эмбриона и плода. Данные, получаемые в результате использования тест-системы ELY-P, позволяют оперативно и объективно, на основе инструментального иммуноферментного анализа, уже в начале первого триместра беременности, либо до наступления беременности выявить лиц, относящихся к группе повышенного риска аномалий развития эмбриона и плода.

Необходимо отметить, что выполнение анализов производится в условиях ин витро без какого-либо вреда для обследуемого.

Пример 1.

Обследуемая А.М., 24 года. Детей нет. Вторая беременность 8 нед. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста ELI-P приведены в табл. 3.

Результаты родов: Срочные роды, здоровая девочка рост 52 см, вес 3 800, балльность по шкале Апгар 9.

Пример 2.

Обследуемая О.С., 22 года. Детей нет. Первая беременность 5 нед. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста ELI-P приведены в табл. 4.

Результаты родов: Срочные роды, здоровый мальчик, рост 51 см, вес 3100, балльность по шкале Апгар 9.

Пример 3.

Обследуемая М. Р., 36 лет. Пятая беременность, 15 нед. Двое детей, здоровы. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста ELI-P приведены в табл. 5
Результаты родов: срочные роды, признаки недоношенности 2 ст., девочка рост 42 см, вес 1900, балльность по шкале Апгар 6-7.

Пример 4. Обследуемая М. О., 26 лет. Вторая беременность, 5 нед. Двое детей, здоровы. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста ELI-P приведены в табл. 6.

Результаты родов: срочные роды, девочка рост 50 см, вес 2400, балльность по шкале Апгар 7, повышенная возбудимость, нарушение моторики кишечника.

Пример 5. Обследуемая Н.Е., 29 лет. Третья беременность, 12 нед. Детей нет. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста ELI-P приведены в табл. 7.

Результаты родов: срочные роды, девочка рост 45 см, вес 1600, балльность по шкале Апгар 6-7, гипотрофия, гипертонус, повышенное внутричерепное давление, раннее заращение родничка, неврапатологические изменения. Девочка умерла в возрасте 4 мес. Патоморфологический диагноз: незрелость головного мозга; микроцефалия.

Пример 6.

Обследуемая А.Г., 39 лет. Третья беременность 9 нед., два выкидыша. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста ELI-P приведены в табл. 8.

По данным УЗИ-обследования на 22 нед. беременности - аномалии развития.

Результаты родов: беременность прервана (преждевременные искусственные роды на сроке 23 нед.), при вскрытии - множественные пороки развития.

Пример 7. Обследуемая Т.Т., 33 лет. Четвертая беременность 11 нед. Один ребенок с диагнозом олигофрения.

Результаты диагностического теста ELI-P приведены в табл. 9.

Результаты родов: Преждевременные искусственные роды на сроке 20 нед.; множественные пороки развития по данным патоморфологического исследования.

Технико-экономическая и социальная значимость
1. Применение диагностикума ELI-P для обследования беременных женщин на ранних сроках развития эмбриона и плода с целью выявления лиц, имеющих повышенный риск тератогенеза, позволит значительно снизить риск рождения психически и физически нездоровых детей. Выполнение исследования производится на основе иммуноферментного анализа в условиях "ин витро", требует 10 мкл крови тестируемого лица и безопасно для женщины, и будущего ребенка.

2. Получение реагентов не требует сложной и дорогостоящей аппаратуры и реактивов, а проведение процедур анализа может проводиться оператором-лаборантом.

3. Целесообразность, социальная и медицинская значимость новых объективных методов раннего прогнозирования отклонения в развитии эмбриона и плода очевидна, так как частота возникновения врожденных аномалий развития (вплоть до тяжелых уродств) составляет до 10% от общего числа новорожденных и особенно высока в экологически неблагоприятных регионах. В то же время надежные и объективные методы ранней диагностики (ранее 18-20 недель беременности) в настоящее время отсутствуют.

Формула изобретения

Способ скрининга женщин детородного возраста с ранними сроками беременности или до беременности, включающий забор крови, получение сыворотки, получение тест-системы ELI-P (очищенные тест-антигены) и проведение твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что определяют иммунореактивность сывороточных аутоантител организма женщины, оказывающих существенное влияние на нормальный эмбрио/фетогенез, и направленных к антигенам участвующим в процессах развития органов и тканей плода, например, к основному белку миелина, белку S100, анионному прочносвязанному белку хроматина АБХ 14 - 18, мембранному белку МР65 и при получении данных об отклонении иммунореактивности тестируемых сывороток от уровня нормальных значений к любому из них, по степени выраженности отклонений определяют уровень риска нарушений развития плода, исходя из данных "Таблицы прогноза", составленной на основе анализа накопленных банков данных.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 35-2003

Извещение опубликовано: 20.12.2003        

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 15.04.2004

Извещение опубликовано: 27.09.2007        БИ: 27/2007

---