Адъювант

 

Изобретение используется в биотехнологии, ветеринарной вирусологии и микробиологии при разработке и производстве иммунизирующих препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней у различных видов сельскохозяйственных животных. Адъювант содержит эмульгатор алкиломодифицированный полиоксиалкиленсилоксановый сополимер (АПС) - продукт полиприсоединения силоксанов и органических олефинов и масляную основу при соотношении указанных компонентов (мас.%) 5:10-90:95. АПС растворяют в масляной основе в указанных соотношениях и смесь стерилизуют. Полученный адъювант представляет собой прозрачную маслянистую жидкость светлого цвета, допускается слабая опалесценция. Технический результат заключается в снижении реактогенности, вязкости и повышении стабильности адъюванта и вакцины на его основе. 8 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной вирусологии и микробиологии, а более конкретно к масляным адъювантам, и может быть использовано при разработке и производстве иммунизирующих препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней у различных видов сельскохозяйственных животных.

При изготовлении средств специфической профилактики инфекционных болезней животных нашли применение, в основном, следующие адъюванты: минеральные сорбенты в сочетании с сапонином для изготовления сорбированных вакцин и масляные адъюванты - для эмульсионных.

Исследования свидетельствуют о преимуществах и перспективе использования эмульсионных препаратов, которые готовят с использованием масляных адъювантов [1, 2].

Изготовление эмульсионных препаратов является результатом смешивания двух взаимно нерастворимых фаз: масляной (масляного адъюванта) и водной, содержащей антиген (антигены), путем их энергичного перемешивания (эмульгирования).

При этом в зависимости от состава масляного адъюванта может быть получена эмульсия различных типов: "вода в масле" (обратная), "масло в воде" (прямая) или "вода - масло - вода" (множественная).

Для иммунизации сельскохозяйственных животных наиболее широко используют эмульсии обратного типа, для получения которых используют адъюванты следующего состава, мас.%: 1. Неполный адъювант Фрейнда [3]: Минеральное масло Байоль F - 85 Эмульгатор Арлацел A - 15 2. Масляная основа - 85 Эмульгатор безводный ланолин - 15 [4] В качестве масляной основы обычно используют вазелиновое, парфюмерное масло, масло для эмульгированных вакцин и антигенов или минеральное масло для противоящурных биопрепаратов.

Общими недостатками вышеуказанных адъювантов являются высокая вязкость и реактогенность для крупного и мелкого рогатого скота полученных с их использованием препаратов.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков предлагаемому изобретению является масляный адъювант, включающий эмульгатор безводный ланолин и в качестве масляной основы минеральное масло для противоящурных биопрепаратов при следующем соотношении ингредиентов, мас.%: Эмульгатор - 15 Масляная основа - 85 [4] Недостатки прототипа состоят в его высокой реактогенности, а также высокой вязкости при температуре ниже 20^oC.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка адъюванта и иммунизирующего препарата на его основе, обладающих низкой вязкостью и реактогенностью, а также высокой стабильностью.

Поставленная задача решена созданием изобретения, включающего совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технологического результата во всех случаях, на которые испрашивается объем правовой охраны.

Поставленная задача решена тем, что известный адъювант, включающий эмульгатор и масляную основу, в соответствии с изобретением содержит в качестве эмульгатора алкилмодифицированный полиоксиалкиленсилоксановый сополимер (АПС) общей формулы

где
A - [-C₂H₄O]_x[C₃H₆O]_y - R; R - H; CH₃, C₄H₉, COCH₃; x = 9 - 36, y = 0 - 33;
a = 4 - 62, b = 1 - 3, c = 0 - 30, m = 7 - 17
при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
АПС - 5 - 10
масляная основа - 90 - 95
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый адъювант и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) адъювант, который включает:
2) эмульгатор,
3) масляную основу.

По сравнению с прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются включение в состав адъюванта в качестве эмульгатора АПС общей формулы

где
A - [-C₂H₄O]_x[C₃H₆O]_y - R; R - H; CH₃, C₄H₉, COCH₃; x = 9 - 36, y = 0 - 33;
a = 4 - 62, b = 1 - 3, c = 0 - 30, m = 7 - 17
и выбор следующего соотношения ингредиентов, входящих в состав адъюванта, мас.%:
АПС - 5 - 10
масляная основа - 90 - 95
АПС является новым и ранее неизвестным продуктом полиприсоединения силоксанов и органических олефинов.

АПС имеет следующие физико-химические показатели:
Внешний вид и цвет - однородная, вязкая жидкость от светлого до коричневого цвета
Вязкость при 50^oC, мПа·с - 500
Плотность при 50^oC, г/см³ - 0,909
Показатель преломления П²_D - 1,453
Водородный показатель (pH водной вытяжки) - 7,0
ГЛБ - 6
Растворимость в минеральных маслах и синтетических жидкостях - Хорошая
Стойкость к высоким и низким температурам - Высокая
Эмульгирующая способность - Высокая
Гарантийный срок хранения не менее 1 года.

АПС хорошо сочетается с жирными, минеральными, растительными, синтетическими маслами и синтетическими жидкостями, а также с ПАВ (пентол, ланолин, Эпол, ВНИИЖ, сорбитаноолеат и др.).

АПС не является токсичным, относится к 4 классу веществ, малоопасных для развития острых отравлений.

В предлагаемом изобретении авторами впервые предложено использовать АПС в качестве эмульгатора в составе масляного адъюванта.

В качестве масляной основы используют минеральное масло для универсального адъюванта, минеральное масло ВГМ-6М, углеводородное синтетическое масло МЦ, минеральные вакцинные масла марок "М", "С" и "В", полиэтилсилоксановую жидкость ПЭС-3, при использовании которых получены положительные результаты [5 - 10].

В результате анализа решении, известных из уровня техники, установлено, что существенный отличительный признак предлагаемого адъюванта, заключающийся в использовании в его составе АПС в качестве эмульгатора, не известен.

Другие отличительные признаки предлагаемого адъюванта, характеризующие количественное содержание входящих в его состав ингредиентов, не могут рассматриваться в отрыве от признаков, характеризующих его качественное содержание.

По результатам опытом на лабораторных и сельскохозяйственных животных обнаружены новые свойства эмульгатора АПС: он не разрушает вирусы и микробы, не обладает токсичностью, его использование в составе вакцины приводит к снижению ее вязкости и реактогенности, повышению стабильности эмульсий.

Достижение технического результата изобретения обусловлено свойствами АПС: снижение реактогенности предлагаемого адъюванта - высокой поверхностной активностью АПС и его способностью проникать через клеточные мембраны, снижение вязкости вакцины - относительно низким показателем вязкости и текучестью АПС при низких температурах, повышение стабильности эмульсий - высокой эмульгирующей способностью АПС, что подтверждено результатами многочисленных испытаний предлагаемого адъюванта в составе эмульсионной противоящурной вакцины (ПЯВ) типа A₂₂, эмульсионной вакцины против инфекционного бурсита кур (ИБК) и эмульсионной вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота, овец и буйволов, сведения о которых приведены ниже, что никоим образом не ограничивает объем изобретения.

Пример 1. Предлагаемый адъювант готовят следующим образом. Навеску АПС растворяют или в минеральном масле для универсального адъюванта, или минеральном масле БГМ-6М, или углеводородном синтетическом масле МЦ, или вакцинных маслах марок "М", "С", "В" или полиэтилсилоксановой жидкости ПЭС-3 в оптимальных отношениях. Полученный раствор стерилизуют известными методами: нагреванием в сушильном шкафу при 120 - 130^oC в течение 2 ч. или путем стерилизующей фильтрации с помощью пластин марок "СФ", EKS, YAM и т.п. Полученный адъювант представляет собой прозрачную маслянистую жидкость светлого цвета, допускается слабая опалесценция. Адъювант разливают в стерильные флаконы и хранят при комнатной температуре до момента использования.

Пример 2. Состав адъюванта, мас.%:
АПС - 5
Масляная основа - 95
Адъювант готовят так, как описано в примере 1.

Пример 3. Состав адъюванта, мас.%:
АПС - 7,5
Масляная основа - 92,5
Адъювант готовят так, как описано в примере 1.

Пример 4. Состав адъюванта, мас.%:
АПС - 10
Масляная основа - 90
Адъювант готовят так, как описано в примере 1.

Пример 5. Для экспериментальной проверки предлагаемого адъюванта были подготовлены пять смесей его ингредиентов, три из которых показали оптимальные результаты. Оптимальный состав предлагаемого адъюванта определили в результате изучения физических свойств (вязкость, стабильность) полученных на его основе эмульсионных ПЯВ типа A₂₂.

Эмульсионные ПЯВ получали путем смешивания инактивированного ящурного антигена и предлагаемого адъюванта в отношении 1:1 в размельчителе тканей РТ-2 в течение 5 мин при 5000 об/мин.

Вязкость образцов эмульсионных ПЯВ определяли с помощью ротационного вискозиметра "Эмиля" при 20^oC и выражали в мПа·с. Согласно существующим требованиям [4] срок годности эмульсионных ПЯВ определен 12 месяцами. В течение этого времени вакцина должна быть стабильной.

Стабильность эмульсионных ПЯВ определяли путем визуального наблюдения за расслоением 20 см³ образца эмульсии при 37^oC. Стабильность характеризовали временем ее хранения до начала выделения водной фазы. Кроме того, определялась стабильность эмульсии центрифугированием в течение 30 мин при 3000 об/мин. Стабильными считали эмульсии, устойчивые к центрифугированию и не выделяющие водной фазы в течение 12 и более месяцев. Допускается выделение не более 5% масляной фазы от общего объема эмульсии. Результаты исследований приведены в табл.1.

Из табл. 1 следует, что оптимальный состав предлагаемого адъюванта следующий:
АПС - 5 - 10
Масляная основа - 90 - 95
(образцы 2, 3, 4, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 22, 23, 24, 27, 28, 29, 32, 33, 34).

В этом случае устойчивость эмульсий сохраняется в течение 12 и более месяцев, а вязкость не превышает 280 мПа·с, что обеспечивает легкую инъецируемость препаратов. Повышение содержания эмульгатора не улучшает свойств эмульсии (значительно увеличивает вязкость препаратов и ведет к необоснованному расходу компонентов), а уменьшение до 2,5% приводит к снижению устойчивости эмульсии (образцы 1, 6, 11, 16, 21, 26).

Пример 6. Эффективность предлагаемого адъюванта в сравнении с прототипом проверена в ряде опытов также в составе эмульсионной ПЯВ типа A₂₂.

Реактогенность адъювантов определяли количественным методом на белых мышах и качественным - на свиньях и крупном рогатом скоте.

Белым мышам массой 18 - 20 г в область подушечки одной из задних конечностей вводили образцы адъювантов в дозе 0,025 мл. Вторая конечность служила контролем. На каждый образец использовали 10 мышей. Через 10 дней мышей убивали, задние лапки отсекали по скакательный сустав и взвешивали раздельно. Реактогенность определяли как процент прироста массы лапок в результате воспалительной реакции по формуле
K = (M₁/M - 1)·100%,
где
K - коэффициент реактогенности;
M₁ - сумма веса опытных лапок;
M - сумма веса контрольных лапок.

Реактогенность адъювантов на свиньях и крупном рогатом скоте оценивали по наблюдениям за клиническим состоянием, температурой тела и по результатам патологоанатомического исследования через 10 дней после введения ПЯВ, содержащих различные адъюванты. Крупному рогатому скоту препараты вводили подкожно, а свиньям - внутримышечно в область шеи.

В табл. 2 и 3 приведены результаты оценки реактогенности предлагаемого адъюванта и эмульсионной вакцины на его основе в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Как видно из табл. 2 и 3, предлагаемый адъювант и вакцины на его основе обладают значительно меньшей реактогенностью, чем известный.

Из опытов на мышах (табл.2) следует, что реактогенность предлагаемого адъюванта в 1,2 - 2 раза ниже, чем у адъюванта-прототипа.

Данные табл.3 свидетельствуют, что вакцина с предлагаемым адъювантом вызывает на месте введения у крупного рогатого скота значительно меньшую воспалительную реакцию, чем вакцина с адъювантом-прототипом. Кроме того, она не вызывает образования абсцессов у животных.

Пример 7. В опыте на белых мышах была изучена иммуногенная активность эмульсионных ПЯВ типа A₂₂ с предлагаемым адъювантом и адъювантом-прототипом путем установления 50% иммунизирующих доз (ИмД₅₀). Вакцину вводили в дозе 0,4 мл подкожно в область спины в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8 (по 10 голов на каждое разведение). Вакцину разводили "Плацебо" с использованием аналогичного адъюванта. Контрольное заражение проводили на 21 день после вакцинации путем подкожного введения 10^4,0 ЛД₅₀/мл гомологичного вируса ящура, адаптированного к взрослым белым мышам. Результаты исследований представлены в табл.4.

Из данных табл.4 видно, что вакцины, изготовленные на основе предлагаемого адъюванта, не уступают по иммуногенной активности вакцине, изготовленной с использованием адъюванта-прототипа.

Пример 8. В опыте на свиньях были изучены иммуногенная активность и реактогенность вакцин с предлагаемым адъювантом и адъювантом-прототипом. Препараты вводили в дозе 1 мл внутримышечно в область шеи в разведениях 1:10, 1: 100, 1:1000 (по 4 головы на каждое разведение). Вакцину разводили "Плацебо" с использованием аналогичного адъюванта. Через 10 дней после вакцинации всех привитых и 2 контрольных животных заражали 10000 ИД₅₀/0,2 мл гомологичным вирусом в слизистую языка. Через 8 дней после заражения учитывали результаты и оценивали реактогенность по месту введения. Результаты приведены в табл.5.

Как видно из табл. 5, вакцина с предлагаемым адъювантом создает у свиней напряженный иммунитет, не уступая при этом вакцине с масляным адъювантом-прототипом.

Кроме того, при патологоанатомическом исследовании в месте введения вакцины с предлагаемым адъювантом не отмечено воспалительных реакций, тогда как у 7 из 12 животных, привитых вакциной с адъювантом-прототипом, установлено образование гранулем и абсцессов.

Пример 9. Предлагаемый адъювант испытан также в составе эмульсионной вакцины против ИБК, содержащей, мас.%:
Полиэтилсилоксановая жидкость (ПЭС-3) - 45
АПС - 5
Антиген - 50
Антигеном служила инактивированная димером этиленимина суспензия ткани фабрициевой сумки.

Вакцину против ИБК готовили аналогично ПЯВ. Приготовили 3 опытных образца эмульсионной вакцины против ИБК. В качестве контроля использовали сорбированную вакцину против ИБК, приготовленную в соответствии с классической прописью.

Для изучения иммуногенной активности каждой вакциной иммунизировали внутримычешно по 10 голов 30-дневных цыплят (по 0,5 мл в область грудной мышцы). Через 30 дней после вакцинации у цыплят отбирали пробы крови, а затем их убивали и проводили патологоанатомическое исследование.

Иммунный ответ у цыплят изучали в реакции диффузной преципитации (РДП) по накоплению титров антител в сыворотках крови.

В табл. 6 представлены результаты иммунизации цыплят инактивированной эмульсионной вакциной против ИБК с использованием предлагаемого адъюванта в сравнительном аспекте с сорбированной вакциной.

Как видно из табл. 6, предлагаемый адъювант стимулирует достаточно высокий синтез антител у цыплят в титре 1:8 - 1:16 (средний показатель по группе сывороток), что свидетельствует о способности эмульсионной вакцины активно вовлекать в процесс иммуногенеза иммунокомпетентные клетки организма. Индивидуальные титры антител в сыворотках крови цыплят составляют 1:4 - 1:32.

За весь период опыта (30 дней) при ежедневном осмотре птиц не наблюдалось клинических признаков инфекционного бурсита (болезни Гамборо). При массовом убое и вскрытии птиц не обнаруживалось никаких изменений ни во внутренних органах, ни на месте введения инактивированной эмульсионной вакцины. Следовательно, вакцина на основе предлагаемого масляного адъюванта безвредна, обладает высокой иммуногенной активностью и пригодна для иммунизации против ИБК.

Пример 10. Предлагаемый адъювант испытан также в составе эмульсионной вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота, овец и буйволов, содержащей, мас.%:
Полиэтилсилоксановая жидкость (ПЭС-3) - 43
АПС - 7
Антиген - 50
Антигеном служила формалинизированная суспензия производственного штамма пастерелл, используемая для изготовления коммерческой эмульсионной вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота, овец, буйволов.

Эмульсионную противопастереллезную вакцину готовили путем эмульгирования концентрированного пастереллезного инактивированного антигена в масляном адъюванте на лабораторном размельчителе тканей РТ-2. К стерильному и охлажденному до комнатной температуры адъюванту при постоянно работающей мешалке (3000 об/мин) постепенно добавляли антиген. Окончательное эмульгирование проводили при 5000 об/мин в течение 5 - 7 мин. Было приготовлено и испытано 4 опытных образца вакцины.

После проверки вакцины на стерильность (путем высева на различные питательные среды) приступили к дальнейшим исследованиям препарата.

Стабильность и вязкость противопастереллезной вакцины и реактогенность адъюванта проверили аналогично эмульсионным противоящурным препаратам.

В результате проведенных исследований установлено: все 4 образца вакцины термостабильны при температуре 37^oC в течение двухнедельного выдерживания в термостате, стабильны при центрифугировании в течение 30 мин при 3000 об/мин, при температуре 20 ^oC имели относительно низкую вязкость (140 мПа·с), коэффициент реактогенности адъюванта составил 30%.

Вышеперечисленные показатели отвечали существующим требованиям, предъявляемым к противопастереллезной вакцине.

Иммуногенную активность противопастереллезной вакцины определяли путем качественной оценки в опытах на взрослых кроликах массой 2,5 - 3 кг. Препараты вводили внутримышечно однократно 5 кроликам в дозе 1,5 мл в области бедра, три животных служили контролем. Через 30 дней после вакцинации животных заражали предварительно подтитрованной смертельной дозой вирулентного штамма пастерелл. Результаты контрольного заражения приведены в табл.7.

Из табл.7 следует, что все опытные вакцины обладали высокой иммуногенной активностью.

Безвредность вакцины определяли на взрослых кроликах массой 1,5 - 2 кг и белых мышах массой 18 - 20 г в сравнении с эмульсионной вакциной против пастереллеза крупного рогатого скота, овец и буйволов. На каждую серию вакцины использовали 32 кролика и 5 белых мышей. Вакцину вводили кроликам внутримышечно в дозе 3 мл (по 1,5 мл в области каждого бедра), мышам - подкожно в области спины по 0,3 мл.

Результаты проверки представлены в табл.8.

Результаты испытания на кроликах и мышах показали, что животные, привитые вакциной с предлагаемым адъювантом и коммерческой вакциной, на протяжении периода наблюдения были живы, следовательно, вакцина на основе жидкости ПЭС-3 и эмульгатора АПС безвредна.

Из вышеизложенного следует, что предлагаемый адъювант обладает более низкой реактогенностью по сравнению с прототипом наряду с прототипом наряду с высокой иммуностимулирующей активностью. Кроме того, препараты, полученные с использованием предлагаемого адъюванта, стабильны и легко инъецируемы.

Экономический эффект от использования предлагаемого адъюванта будет складываться из уменьшения потерь мяса ввиду незначительных изменений на месте введения препаратов, изготовленных с его использованием.

Предлагаемый адъювант найдет применение при изготовлении и применении средств диагностики и специфической профилактики инфекционных болезней у различных видов домашних и сельскохозяйственных животных.

Источники информации
1. De Mello P.A. The use of oil adjuvanted foot-and-mouth disease vaccine in endemie areas. - Bol. CPFA, 1982, 45 - 46, 33 - 42.

2. Bahnemann H.G. Large scale application of oil adjuvanted foot-and-mouth disease vaccine. In. : Europe. Comm. Control FMD. Rio de Janeiro, Brasil, 15 - 10 Oct. 1985. Rome, 1986, 132 - 135.

3. Воробьев А.А., Васильев Н.Н. Адъюванты (неспецифические стимуляторы иммуногенеза). - М.: Медицины, 1969, 20.

4. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа A, типа O, типа C, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ МСХ СССР 24.01.91 (прототип).

5. ТУ 38.101 1224-89.

6. ТУ 38.401 841-91.

7. ТУ 38.401 764-89.

8. ТУ 0253-002-00151911-93.

9. ТУ 38.401 139-93.

10. ГОСТ 13004-77.

Формула изобретения

Адъювант, включающий эмульгатор и масляную основу, отличающийся тем, что в качестве эмульгатора он содержит алкилмодифицированный полиоксиалкиленсилоксановый сополимер общей формулы

где A - [-C₂H₄O]_x [C₃H₆O]_y - R;
R - H; CH₃; C₄H₉; COCH₃,
x = 9 - 36;
y = 0 - 33;
a = 4 - 62;
b = 1 - 3;
c = 0 - 30;
m = 7 - 17,
при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
Сополимер - 5 - 10
Масляная основа - 90 - 95.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 16.01.2003

Номер и год публикации бюллетеня: 10-2004

Извещение опубликовано: 10.04.2004        

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 27.02.2005        БИ: 06/2005