Способ моделирования гранулематозного воспаления in vitro

 

Способ может быть использован в области медицины, а именно в экспериментальной патологии и иммунологии для исследования механизмов клеточной дифференцировки и трансформации в очаге гранулематозного воспаления, а также механизмы межклеточных взаимодействий в очаге "иммунного" и "неиммунного" гранулематозного воспаления и впоследствии разработки методов иммунофармакологического лечения гранулематозных болезней. Проводят длительное культивирование макрофагов и лимфоцитов в монослое на стекле, причем после совместного культивирования макрофагов с лимфоцитами, гранулоцитами и тучными клетками смыва перитонеальной полости, супернатант, содержащий все неадгезированные клетки, убирают, неадгезированные макрофаги и лимфоциты возвращают в культуру макрофагов в свежей порции среды после внесения в культуру макрофагов гранул зимозана, нагруженных кислым фуксином, смешанную культуру макрофагов и лимфоцитов инкубируют при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей сыворотку эмбрионов коров, пенициллин и стрептомицин, процедуру среды повторяют через каждые 3 сут одновременно с процедурой возврата в культуру макрофагов неадгезированных лимфоцитов, и через различные интервалы времени методами световой микроскопии регистрируют в культуре макрофагов появление различных переходных форм трансформированных макрофагов, гигантских многоядерных клеток, эпителиоидных клеток, формирование межклеточных контактов, образование кластеров, состоящих из эпителиоидных клеток. Способ обеспечивает глубокое исследование иммунных механизмов.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной патологии и иммунологии, и может быть использовано для исследования механизмов клеточной дифференцировки и трансформации в очаге гранулематозного воспаления, в частности механизмов дифференцировки мононуклеарных фагоцитов и их трансформации в эпителиоидные клетки и гигантские многоядерные клетки. Выяснение этих механизмов позволит разрабатывать способы иммунофармакологического воздействия на эти процессы, что, в свою очередь, позволит разрабатывать новые методы иммунофармакологического лечения воспалительных гранулематозных болезней.

Согласно классификации, основанной на морфологическом принципе (по структуре гранулем), выделяют гранулемы инородных тел, эпителиоидно-клеточные гранулемы, смешанные гранулемы и другие [1]. Общепризнано, что без опытов in vitro невозможно дать подробную характеристику отдельным субпопуляциям иммунокомпетентных клеток в иммунопатологическом процессе и факторам, которые они выделяют, а также изучать механизмы межклеточных взаимодействий и выяснять механизмы иммунных реакций, к которым можно отнести и воспаление. Известно, что в культуре ткани, содержащей макрофаги, гигантские многоядерные клетки и эпителиоидные клетки появляются на 2 неделе после начала культивирования [2, 3]. Однако использование не диссоциированных на клетки культур тканей, культур клеток, полученных из уже сформировавшихся гранулем, также как и использование "чистых" культур макрофагов при моделировании гранулематозного воспаления in vitro, не позволяет достаточно глубоко исследовать иммунные механизмы, участвующие в регуляции процессов клеточной дифференцировки и трансформации в очаге гранулематозного воспаления, в том числе и иммунных механизмов, влияющих на дифференцировку мононуклеарных фагоцитов и их трансформацию в эпителиоидные клетки и гигантские многоядерные клетки [4, 5]. Вместе с тем имеются экспериментальные и клинические данные, свидетельствующие о том, что в формировании эпителиоидно-клеточных и смешанных гранулем большую роль играют иммунные механизмы, включающие когнатные взаимодействия между клетками, в которых участвуют различные субпопуляции лимфоцитов [6, 7] . Показано, что процессы образования гигантских многоядерных клеток можно инициировать в однослойных культурах непримированных макрофагов после внесения в культуру супернатантов культур лимфоцитов, инкубированных с лектинами (Con A, PHA), супернатантов миксткультур лимфоцитов и супернатантов культур сенсибилизированных in vivo лимфоцитов после их стимуляции in vitro специфическими антигенами [8, 9, 10]. Однако инициировать процессы образования эпителиоидных клеток в однослойных культурах макрофагов такими способами не удавалось. Особенностью разработанной модели по сравнению с известными способами моделирования in vitro процессов клеточной (макрофагальной) дифференцировки и трансформации, протекающих в очаге хронического воспаления, основанными на использовании очищенных от "посторонних" клеток однослойных культур макрофагов, является предварительное (до внесения частиц для фагоцитоза или других индукторов воспаления) совместное культивирование макрофагов с лимфоцитами, гранулоцитами и тучными клетками (из смыва перитонеальной полости) и длительное совместное культивирование перитонеальных макрофагов, фагоцитировавших химически модифицированные гранулы зимозана, с лимфоцитами.

Задача изобретения - разработать способ моделирования in vitro процессов формирования смешанных воспалительных гранулем, сочетающих реакции типа "гранулем инородных тел" с гиперчувствительными эпителиоидно-клеточными гранулемами.

Цель изобретения - разработать способ моделирования гранулематозного воспаления in vitro, позволяющий исследовать закономерности и механизмы клеточной дифференцировки и трансформации, а также механизмы межклеточных взаимодействий в очаге "иммунного" и "неиммунного" гранулематозного воспаления для разработки методов иммунофармакологического лечения гранулематозных болезней.

Способ состоит в кратковременном начальном совместном культивировании макрофагов, лимфоцитов, гранулоцитов и тучных клеток, последующем внесении в однослойную культуру макрофагов гранул зимозана, нагруженных кислым фуксином, длительном совместном культивировании макрофагов и лимфоцитов и осуществляется следующим образом. Из перитонеальной полости мышей (путем вымывания стерильной средой 199 для культивирования клеток) получают перитонеальную жидкость, содержащую смесь макрофагов, лимфоцитов, гранулоцитов и тучных клеток. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют свежую порцию стерильной среды 199, содержащую 10% сыворотки эмбрионов коров, 100 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, подсчитывают количество клеток в суспензии в камере для счета клеток и доводят концентрацию клеток в суспензии до 2 · 10⁶/мл. По 2 мл суспензии перитонеальных клеток вносят в стерильные пластиковые чашки Петри с диаметром 40 мм, на дно которых помещаются обезжиренные стерильные покровные стекла (24х24 мм). Клетки инкубируют при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂ в течение 1 сут. После этого из чашек убирают супернатант, содержащий, главным образом, лимфоциты и в небольшом количестве тучные клетки и неадгезированные макрофаги. В чашки Петри с прикрепившимися к стеклу макрофагами и небольшим количеством гранулоцитов и адгезированных лимфоцитов вносят 2 мл свежей среды 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, а также гранулы зимозана, нагруженные (окрашенные) кислоым фуксином (ГЗФ, Рубин С, мол. формула - C₂₀H₁₇N₃O₉Na₂S₃) в такой концентрации, чтобы соотношение частицы : клетки было равное 10 : 1. Монослой макрофагов инкубируют с ГЗФ при 37^oC в течение 1 ч. Затем супернатант, содержащий нефагоцитированные ГЗФ, удаляют, монослой макрофагов промывают средой 199 (1 раз) и вносят в чашку Петри 1 мл среды 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина. Супернатант (полученный ранее), содержащий лимфоциты и другие неадгезированные клетки, центрифугируют, к осажденным клеткам добавляют 1 мл среды 199 (содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина). Суспензию неадгезированных перитонеальных клеток, содержащую, главным образом, лимфоциты, вносят в культуру макрофагов. Смешанную культуру макрофагов и лимфоцитов инкубируют при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂, в течение 3 сут. Затем среду для культивирования заменяют по схеме, описанной выше. Процедуру замены среды для культивирования клеток с возвратом лимфоцитов в культуру макрофагов проводят через каждые 3 сут. Через различные интервалы времени после начала культивирования (2 - 14 сут) стекла с монослоем макрофагов промывают в среде для культивирования, клетки фиксируют в абсолютном метаноле и окрашивают 10 - 15 мин в 1%-ном растворе основного фуксина, по Романовскому в модификации Филлипсона (или другими методами окраски для световой микроскопии), заключают в глицерин (на предметных стеклах) и исследуют методами световой микроскопии. Через различные интервалы времени после начала культивирования в культуре макрофагов регистрируют появление различных переходных трансформированных форм макрофагов, эпителиоидных клеток, гигантских многоядерных клеток, количественные и качественные характеристики межклеточных контактов, количество делящихся клеток в культуре, количество образуемых ими кластеров (скоплений) и другие параметры, характеризующие особенности клеточной дифференцировки и трансформации, а также межклеточные взаимодействия. Оценку результатов культивирования проводят по 3 - 5 препаратам; на каждом препарате просматривают 5000 клеток.

Пример 1. Через 1 сут после начала культивирования (до внесения ГЗФ в смешанную культуру макрофагов и других перитонеальных клеток) в культуре макрофагов эпителиоидные клетки отсутствуют, многоядерные клетки представлены только двухъядерными макрофагами, количество которых не превышает 0,5%.

Пример 2. Через 1 сут после начала совместного культивирования перитонеальных макрофагов с другими клетками смыва перитонеальной полости в культуру макрофагов вносили ГЗФ, культивирование макрофагов проводили без процедуры возврата лимфоцитов в культуру клеток. Через 10 сут после начала культивирования в монослое макрофагов зарегистрировано появление 2,6 ± 0,2(%) клеток эпителиоидного типа, 6,4±0,3(%) гигантских многоядерных клеток (2 - 7 ядерных) типа Пирогова-Лангханса, образование большого количества межклеточных контактов.

Пример 3. Через 1 сут после начала совместного культивирования перитонеальных макрофагов с другими клетками смыва перитонеальной полости в культуру макрофагов вносили ГЗФ, дальнейшее культивирование макрофагов проводили совместно с лимфоцитами, т.е. с процедурой возврата лимфоцитов в культуру макрофагов после очередной смены среды для культивирования клеток. Через 10 сут после начала совместного культивирования макрофагов и лимфоцитов в культуре макрофагов зарегистрировано появление 6,8±0,4(%) эпителиоидных клеток разных типов, более 10% переходных форм трансформированных макрофагов, 6,7±0,2(%) гигантских многоядерных клеток (2 - 10 ядерных) типа Пирогова-Лангханса, наличие большого количества межклеточных контактов, наличие делящихся эпителиоидных клеток, а также формирование кластеров, состоящих из эпителиоидных клеток.

Список литературы 1. Струков И. А., Кауфман О.Я. Гранулематозное воспаление и гранулематозные болезни.- М.: Медицина, 1989, - 182 с.

2. Rhee H.J., van Burgh de Winter C.P.M., Daems M.Th. The differentiation of monocytes into macrophages, epithelioid cells and multinucleated giant cells In subcutaneous granulomas. // Cell. Tiss. Res.- 1979,- Uol. 197. - N3.- P.355-738.

3. Rhee N. J., van Burgh de Winter, Daems M.Th. The differentiation of monocytes into giant cells in subcutaneous granulomas. // Cell. Tiss. Res.- 1979.- Uol. 197.- N3.- P.379-396.

4. Маянский Д.H. Хроническое воспаление.- M.: Медицина, 1991.- 271 c.

5. Bonney R.J., Gery l., T.-Y.LIn, Meyenhofer W.A., Davies P. Mononuclear phagocytes from carrageenan-induced granulomas. // J. Exp. Med.- 1978.- Uol.-148.- N1.- P.261-275.

6. Adams D.O. The biology of the granulomas // Pathology of granulomas/ Ed, H.L.Iochim.- New York, 1983.- P. 1-19.

7. Oord J.J., Chris de Wolf-Peeters, Facchetti F., Desmet U.J. Cellular composition of hypersensivity-type granulomas: Immunochemical analysis of tuberculous and sarcoidal lymphadenitis. // Hum. Path.- 1984,- Uol.- 15.- N6.- P.559-565.

8. Edelson P.J., Cohn Z,A. Effect of concanavalin A on mouse peritoneal macrophages. //J.Exp.Med.-1974.- Uol.140.-P.1364-1386.

9. Sone S., Bucana C., Hoyer L., Fidler l. Kinetiks and ultrastructural studies of the induction of rat alveolar macrophage fusion by mediators released from mitogen-stimulated lymphocytes.// Amer. J. Path.- 1981.- Uol. 103.- P.234-246.

10. Boros D. Limphokines,- N.Y.: Acad. Press, 1981.- Vol.3.- P.257-281.

Формула изобретения

Способ моделирования гранулематозного воспаления in vitro путем длительного культивирования перитонеальных макрофагов мышей в монослое на стекле, отличающийся тем, что через 1 сутки после совместного культивирования макрофагов с лимфоцитами, гранулоцитами и тучными клетками смыва перитонеальной полости супернатант, содержащий все неадгезированные клетки, убирают, неадгезированные макрофаги и лимфоциты возвращают в культуру макрофагов в свежей порции среды после внесения в культуру макрофагов гранул зимозана, нагруженных кислым фуксином, смешанную культуру макрофагов и лимфоцитов инкубируют при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂, в среде, содержащей сыворотку эмбрионов коров, пенициллин и стрептомицин, процедуру замены среды повторяют через каждые 3 суток одновременно с процедурой возврата в культуру макрофагов неадгезированных лимфоцитов и через различные интервалы времени после начала совместного культивирования макрофагов и лимфоцитов методами световой микроскопии регистрируют в культуре макрофагов появление различных переходных форм трансформированных макрофагов, гигантских многоядерных клеток, эпителиоидных клеток, делящихся эпителиоидных клеток, формирование межклеточных контактов, образование кластеров, состоящих из эпителиоидных клеток.